腫瘤免疫治療的新方法CAR-T細胞治療

1、 腫瘤免疫治療的新方法CAR-T 細胞治療秦皇島市第四醫(yī)院病理科 康文喜 康 瑤 滿迪隨著腫瘤免疫學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，腫瘤免疫治療近年來取得了長足的進步。以嵌合抗原受體( chimeric antigen receptor，CAR) 修飾 T 細胞為代表的腫瘤靶向免疫治療的成就受到世界矚目，在體外和臨床試驗中表現(xiàn)出良好的靶向性、殺傷性和持久性，給人類抗擊腫瘤帶來了新的曙光。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR) 在體外進行基因重組, 生成重組質(zhì)粒, 再在體外通過轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染到患者的T細胞胞膜上, 使患者T細胞表達腫瘤抗原受體,轉(zhuǎn)染后經(jīng)過純化和大規(guī)模擴增后的

2、T細胞, 稱之為嵌合抗原受體T細胞（Chimeric Antigen Receptor T-Cell ， CAR-T）。1989年Grooss等首次提出- 細胞這一概念，多年來科學(xué)家經(jīng)過不斷的深入研究， -細胞技術(shù)已經(jīng)研制出三代。第 一 代 CAR 由識別腫瘤表面抗原的單鏈抗體和免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）組成。然而，ITAM 發(fā)出的激活信號只能引起 T 細胞短暫的分裂和較低水平的細胞因子分泌，不能提供長時間的多克隆擴增和持續(xù)的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。給患者輸注第 一 代 CAR-T細胞2天后, CAR-T細胞在體內(nèi)可大量繁殖, 但1個月后迅速下降至難以檢測的水平, 也沒有觀察到對腫瘤的免疫應(yīng)答

3、反應(yīng)。雖然對第一代CAR-T細胞的研究較多, 但是大多數(shù)試驗在細胞擴增、體內(nèi)存活時間、細胞因子分泌等方面還存在很多問題, 沒有達到預(yù)期的臨床效果。研究表明, T細胞的完全活化有賴于雙信號和細胞因子的作用。其中第一信號為特異性信號, 由 TCR識別抗原遞呈細胞表面的抗原肽-MHC復(fù)合物所啟動；第二信號為協(xié)同刺激信號, 通過CD28/B7等重要的共刺激分子, 促進IL-2合成, 并使T細胞充分活化及免于凋亡。對于初始型T細胞(未與抗原接觸的T細胞), 如果只有信號1而沒有信號2， T 細胞就不能發(fā)揮正常作用；即使T細胞與抗原接觸, 若沒有協(xié)同刺激信號, 細胞也不能發(fā)揮正常功能。一種僅含有CD3序列

4、的嵌合抗原受體, 如果沒有協(xié)同刺激信號2, 也是無法激活CAR-T細胞。因此，依照 T 細胞活化的雙信號學(xué)說，T 細胞的激活和增殖需要共刺激信號，因此第二代和第三代 CAR 引入了共刺激分子信號，提高了 T 細胞的細胞毒性、增殖活性、存活時間、細胞因子釋放等功能?？茖W(xué)家們用電穿孔、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法修飾T 細胞，使 T 細胞的抗腫瘤作用現(xiàn)出了令人滿意的效果。Porter等和Kalos等研究用第二代CAR-T細胞靶向治療3例慢性淋巴細胞白血病, 接受治療的3例患者回輸CAR-T細胞總數(shù)為1.4107 1.1109 , CAR-T細胞不僅在體內(nèi)擴增1 000倍以上, 而且

5、在血液和骨髓中存活的時間也超過6個月, 分泌的細胞因子如干擾素-、CXCL9等較治療前顯著增高。接受治療的3例患者中, 2例達到完全緩解, 1例部分緩解, 療效得到肯定。2013年, Brentjens等用CD19-CAR-T細胞治療5例急性B細胞性白血病患者，通過治療, 5例腫瘤迅速減小,其中1例患者治療8天之后就很快得到完全緩解, 3例患者緩解期長達5-24個月。該臨床試驗結(jié)果表明，CAR-T細胞治療成人急性B細胞性白血病是有效的。雖然患者對該療法能夠耐受, 但是也出現(xiàn)了細胞因子相關(guān)的毒性反應(yīng), 并且與腫瘤負荷成正相關(guān)。Morgan等對一例結(jié)腸癌合并肝和肺轉(zhuǎn)移的患者給予第三代CAR-T細胞

6、治療。患者輸入CAR-T細胞4小時后，血液就檢測出高水平的IFN-、GM-CSF、TNF-和IL-6等細胞因子。但患者發(fā)生“細胞因子風(fēng)暴”,于5后天死亡。這也是迄今為止公布的最為嚴重的1例CAR-T細胞相關(guān)的不良反應(yīng)。由于目前第三代CAR-T細胞臨床應(yīng)用還比較少, 故其安全性和有效性是否就一定優(yōu)于第二代CAR-T細胞, 以及選擇怎樣的共刺激分子組合, 還需進一步觀察。隨著細胞免疫治療腫瘤的進展, 嵌合抗原受體修飾的T細胞在臨床應(yīng)用中的作用越來越受到人們 的重視。通過探索完美的CAR信號組合, 調(diào)節(jié)適宜的CAR親和性, 增加人工基因調(diào)控開關(guān), 產(chǎn)生合理的 細胞因子分泌, 誘導(dǎo)T細胞特異性歸巢等,

7、 相信第四代甚至第五代CAR-T細胞也將很快應(yīng)用于臨床。 除此之外, 嵌合抗原受體也不僅僅只是修飾T 細胞, 它還可以修飾CIK細胞、NK細胞以及T細胞等。例如, 德國波恩大學(xué)的研究人員從結(jié)直腸癌患者外周血中采集和培養(yǎng)CIK細胞, 并利用 CEA+ 抗體特異性的CAR對CIK細胞進行改造, 使 CIK細胞獲得CAR的特性。將CAR-CIK細胞與 CEA+ 腫瘤細胞共培養(yǎng)后, 發(fā)現(xiàn)其分泌的IFN-, 要高于與CEA-腫瘤細胞共培養(yǎng)情況; 而用未改造的CIK 細胞與CEA+ /CEA 分別共培養(yǎng), 卻未觀察到IFN-分泌增加, 且CAR-CIK細胞的細胞毒效應(yīng)也比未改造的CIK細胞要高。當前構(gòu)建的

8、嵌合抗原受體存在固定的抗原特異性, 這意味著它們每次只能靶向一種類型的腫瘤抗原。將來可以設(shè)計構(gòu)建一種更加通用性的嵌合抗原受體框, 最終可用于同時或依次靶向多種腫瘤抗原, 這樣將更大程度解決腫瘤免疫逃逸引起的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等問題, 成為療效更確切的過繼性免疫細胞治療方法, 給腫瘤治療帶來新的希望。CA-T 細胞治療的副作用：1、CAR 修飾 T 細胞的脫靶效應(yīng)： CAR 修飾 T 細胞臨床應(yīng)用的一個重要問題是脫靶效應(yīng)。作為分子靶點的腫瘤抗原中，真正的腫瘤特異性抗原很少，大多數(shù)為腫瘤相關(guān)抗原。如果這些抗原在重要臟器上也有表達，勢必造成免疫損傷。當然一些組織可能通過天然的屏障免于受到 CAR 修飾 T

9、細胞的攻擊，如睪丸，但是體內(nèi)大多數(shù)組織不具備這些屏障。例如，用特異性識別碳酸酐酶-IX(CA-IX) CAR 修飾 T 細胞治療轉(zhuǎn)移性腎細胞癌可能會造成肝細胞毒性，因為正常肝臟細胞上低水平表達 CA-IX。Rosenberg 等報道 1 例接受 CD19-CAR 修飾 T 細胞治療淋巴瘤患者，外周血 CD19 + 淋巴瘤細胞消除的同時，其 B 細胞也消失長達 39 周，表明脫靶效應(yīng)對健康成熟 B 細胞存在潛在威脅。 2、細胞因子風(fēng)暴： CAR-T 細胞與腫瘤抗原結(jié)合會導(dǎo)致T 細胞活化，這一結(jié)果可能導(dǎo)致大量的炎癥細胞因子釋放到循環(huán)中，如 IFN- 和 TNF- 等，即所謂“細胞因子風(fēng)暴”， 大量

10、的炎癥細胞因子會引起急性呼吸窘迫綜合征和多器官功能衰竭，有時甚至危及患者生命，因此密切監(jiān)測重要器官的功能是必需的。 3、CAR-T細胞引起的移植物抗宿主病(GVHD) 樣損傷： CAR-T細胞應(yīng)用的另一個問題是發(fā)生類似于異基因造血干細胞移植中出現(xiàn)的 GVHD。 移植物抗腫瘤作用常常伴隨著免疫效應(yīng)細胞對正常組織的攻擊，尤其是當腫瘤相關(guān)抗原在健康組織也有表達的時候，其抗癌效能與其毒性程度相關(guān)聯(lián)。例如靶向 MART-1 的 CAR + T 細胞治療黑素瘤的臨床試驗中，一些患者出現(xiàn)了皮疹、葡萄膜炎或聽力減退，嚴重者出現(xiàn)多器官功能衰竭而死亡。如何保證發(fā)揮 CAR-T 細胞生物有效性的同時，減少其潛在危險

11、性，是實現(xiàn)基因及細胞治療惡性腫瘤需要解決的問題。預(yù)防措施：1、人工調(diào)控： CAR 表達人工調(diào)控基因表達是實現(xiàn)基因治療的安全策略之一。當 CAR-T 細胞輸入患者體內(nèi)出現(xiàn)明顯免疫損傷時，利用人工基因調(diào)控手段( 如啟動自殺基因) 清除 CAR-T 細胞，可以防止嚴重不良事件的發(fā)生。為此，一些自殺基因系統(tǒng)引入了 CAR-T 細胞，以增加治療的安全性。 2、T 細胞亞群/型選擇：有證據(jù)表明效應(yīng)記憶 T 細胞(TEM )在體外毒性方面優(yōu)于中樞記憶 T 細胞(TCM ) ，但在體內(nèi) TCM具有較強的抗腫瘤效應(yīng)和建立免疫記憶潛能。CAR 修飾的初始 T 細胞亞群/型也影響它們的體外擴增和體內(nèi)治療作用。CAR 修飾的 T 細胞體外擴增時，CD4 + T 細胞與 CD8 + T 細胞共同培養(yǎng)對細胞毒效應(yīng) T 細胞的大量制備有幫助；樹突狀細胞與 T 細胞共培養(yǎng)對幼稚 T 細胞到效應(yīng)/記憶 T 細胞轉(zhuǎn)化、細胞因子分泌( Th1 / Th2) 有重要作用。精確地分離和檢測潛在最有效的 T 細胞亞群/型，用少量的細胞達到最佳的治療效果，將會提高臨床應(yīng)用的安全性。3、共刺激分子的選擇：因 CAR 細胞內(nèi)信號區(qū)不同，共刺激分子激活 T 細胞產(chǎn)生的抗腫瘤效應(yīng)也不同，有研究表明，CD137 能提高 T 細胞存活和抵抗激活誘導(dǎo)性細胞凋亡(AICD) 。因此，選擇最佳的共刺激分子達到良好的抗腫瘤作用，又避免