生化實(shí)驗(yàn)(七)----綜合性實(shí)驗(yàn)之三----血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳2013

1、綜合性實(shí)驗(yàn)三,血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1.,掌握醋酸纖維膜電泳的基本原理及其臨,床意義,;,2.,掌握醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白,質(zhì)的操作技術(shù),;,3.,熟悉電泳儀器的使用和操作。,二、實(shí)驗(yàn)原理：,（一）電泳,(electrophoresis),：,帶電粒子在電場中,向與其電性相反的電極方向泳動的現(xiàn)象。,帶負(fù)電粒子,正極,帶正電粒子,負(fù)極,電泳技術(shù),指利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。,1.,球形帶電顆粒在電場作用下所受的力,?,?,?,電場力,F = XQ,(,X,電場強(qiáng)度，,Q,粒子所帶電荷,),阻力,F = 6,r,v,(,r,粒半徑，,介質(zhì)粘度，,v,粒運(yùn)動

2、速度,),當(dāng),F= F,，,(,電泳達(dá)平衡,),，,XQ = 6,r,v,?,移項(xiàng)得,v,/,X,= Q / 6r,?,遷移率,(mobility) :,U,=,v,/,X,= Q / 6,r,v,/,X,單位電場強(qiáng)度時粒子運(yùn)動的速度,?,帶電粒子的,遷移率,在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì)：,即與其所帶電量成正比；與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。,?,?,移動速度,:,v,=,d,/,t,(cm /,秒,),電場強(qiáng)度,:,X,=,E,/,l,(,伏特,/ cm) (,單位距離內(nèi)電勢差,),2.,兩種不同物質(zhì)的電泳分離,d,/,t,d l,遷移率,U,=,v / X =,=,(,單位,: cm,2,

3、伏特,-1,秒,-1,),E,/,l,Et,?,?,?,物質(zhì),(A),在電場中移動的距離為,d,A,=,U,A,Et / l,物質(zhì),(B),在電場中移動的距離為,d,B,=,U,B,Et / l,兩物質(zhì)移動距離的差為,d = d,A,- d,B,= (,U,A,U,B,),Et / l,物質(zhì),A,和,B,能否分離取決于兩者遷移率。,如兩者的,U,相同，則不能分離；如有差別則能分離。,?,兩物質(zhì),的,分離距離,：,與電壓和電泳時間成正比，,與電場的距離成反比。,小結(jié)：,?,帶電粒子的,遷移率,在一定條件下取決于粒子本,身的性質(zhì)：,即與其所帶電量成正比；與其半徑,及介質(zhì)粘度成反比。,?,兩物質(zhì),的

4、,分離距離,：,與電壓和電泳時間成正比，,與電場的距離成反比。,電泳法：,利用在電場的作用下，由于待分離樣品,中各種,分子帶電性質(zhì),以及,分子本身大小,、,形狀,等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速,度，從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的方法,和技術(shù)。,（二）影響電泳速度的因素,樣品本身,?,?,?,帶電量：,Q,越多，,v,越大。,分子大小,：,r,越小，,v,越大。,形狀：球形分子,纖維狀分子。,電場強(qiáng)度,：,X,越大，,v,越大。,d,=,U,Et / l,U,=,v,/,X,= Q / 6,r,V = d,/,t,=,U,E / l,=,U,X,= Q ,E,/ (6,r ,l,),

5、緩沖液,?,?,?,成分：性質(zhì)穩(wěn)定，不易電解。,pH,：,pH - pI,越大，,Q,越多，,v,越大。,離子強(qiáng)度,：,0.02,0.2M,。,I,越大，樣品電流減,小，,v,變??；,I,越小，樣品電流越大，,v,越大，,但樣品易擴(kuò)散。,支持介質(zhì),：惰性材料，有一定堅韌度，易保,存；吸附力要??；無電滲作用。,?,電滲：液體對固體的相對移動，由緩沖液的水分子,和支持介質(zhì)的表面之間所產(chǎn)生的一種相關(guān)電荷所引,起。電滲與電泳方向相同，,v,變大；反之變小。,簡言之，在電場作用下液體對于固體支持物的相對,移動稱為電滲（,electro-osmosis,）。,?,附：電滲,?,原因：,?,固體支持物多孔，

6、帶可解離化學(xué)基團(tuán)，常吸附溶液中正離子或負(fù)離子，,使,溶液相對帶負(fù)電或正電,。,?,如以濾紙作支持物時，紙上纖維素吸附,OH,-,帶負(fù)電荷；而與紙接觸的水溶,液因產(chǎn)生,H,3,O,+,帶正電荷。,?,因此，若樣品質(zhì)點(diǎn)在電場中移向負(fù)極，結(jié)果質(zhì)點(diǎn)的表現(xiàn)速度比其固有速,度要快，若質(zhì)點(diǎn)是移向正極，則表現(xiàn)速度比其固有速度要慢，,可見應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。甚至，當(dāng)電,滲作用大于電泳時，樣品質(zhì)點(diǎn)可“不進(jìn)反退”，向電泳相反方向移動。,?,溫度,：過高，產(chǎn)熱增加、水分蒸發(fā)，對電泳不利。,?,產(chǎn)生熱量,(Q=I,2,Rt),對電泳技術(shù)不利，因產(chǎn)熱可促使支持介,質(zhì)上溶劑蒸發(fā)，而影響緩沖溶液離

7、子強(qiáng)度。,溫度升高，介質(zhì)粘度下降，分子運(yùn)動加劇，自由擴(kuò)散變快，,遷移增加。,為降低熱效應(yīng)對電泳影響，可控制電壓或電流，也可安裝,冷卻散熱裝置。對高壓電泳增設(shè)冷卻系統(tǒng)，防樣品變性。,?,?,影響電泳遷移率的因素：,外加電流、電壓,ANODE,Voltage,CATHODE,+,-,Friction,+,Charge,-,分子量,分子形狀,分子的等電點(diǎn),?,在,確定的條件下,，某物質(zhì)的遷移率為,常數(shù),，,是該物質(zhì)的,化學(xué)特征常數(shù),（三）血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳原理,1.,醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維素薄膜作為支,持物的電泳方法。,2.,血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在,pH4.0,7.3,之間，,在,p

8、H8.6,的緩沖溶液中均帶負(fù)電荷，在電場中向,正極泳動。,3.,血清中各種蛋白質(zhì)的,等電點(diǎn)不同,，所以,帶電荷,量也不同,。此外各種蛋白質(zhì)的,分子大小各有差,異,，因此在同一電場中,泳動的速度不同,。分子,小而帶電荷多者，泳動較快；反之，則較慢。,+,白蛋,白,(A),1,2,血清蛋白的,pI,大多在,7.5,以下，在,pH8.6,的巴比妥緩沖液,中以負(fù)離子形式存在，并且蛋白質(zhì)的分子量、立體構(gòu)象、等電,點(diǎn)及形狀也有差異，在電場中遷移速度不同，可以在醋酸纖維,薄膜上分離成,A,、,1,、,2,、,、,五條區(qū)帶。,蛋白質(zhì)名稱,清蛋白,等電點(diǎn),4.88,5.06,分子量,69000,1,200000

9、,2,300000,血清在,5.12,6.85,7.50,90000,150000,156000,300000,定量,-,將染色后的區(qū)帶分別剪開，將其溶與堿液，進(jìn)行比色測定，計算各區(qū)帶的百分?jǐn)?shù)。,pH8.6,的緩沖體系中電泳,1h,左右，染色后可顯示,5,條帶。清蛋白泳動最塊，其余依次,1,、,2,、,、,球蛋白。,4.,醋酸纖維素薄膜,具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)（厚約,120,?,m,），滲透,性強(qiáng)，對分子移動的阻力很弱。,用其作支持物進(jìn)行電泳，具有微量、快速、簡,便、分離清晰、對樣品無吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。,現(xiàn)已廣泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血,紅蛋白、酶的分離和免疫電泳等方面。,三、實(shí)驗(yàn)器材,1

10、.,電泳儀：,為電泳提供直流電源。,2.,電泳槽：,為電泳提供場所。多用有機(jī)玻璃制成，電極用鉑絲。,3.,血清加樣器,：,可用蓋玻片或,X,膠片或微量加樣器。,4.,醋酸纖維素薄膜：,2cm,8cm,5.,其它：,培養(yǎng)皿（直徑,9-10cm,）、濾紙、玻璃板、鑷子等。,DYY-,型,電泳槽,DYY-5,型穩(wěn)壓,穩(wěn)流電泳儀,四、實(shí)驗(yàn)試劑和材料,1,、巴比妥,-,巴比妥鈉緩沖液,(pH=8.6,，離子強(qiáng)度,0.075),：,稱取,1.66g,巴比妥和,12.76g,巴比妥鈉,置于大燒杯中，加,蒸餾水約,600ml,，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定溶至,1000ml,。置4保存，備用。,2,、染色液：

11、,稱取,0.5g,氨基黑，甲醇,50ml,，冰醋酸,10ml,，,蒸餾水加至,100ml,。,3,、漂洗液：,取無水乙醇,45ml,，冰乙酸,5ml,和蒸餾水,50ml,，,混勻置塞試劑瓶內(nèi)貯存。,3,、,0.4N,氫氧化鈉：,稱取氫氧化鈉,16.0g,，蒸餾水加至,1000ml,五、實(shí)驗(yàn)操作步驟,（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備,1.,醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇,將醋酸纖維素薄膜完全浸泡于緩沖液中,5-10,分鐘后。,每組取醋酸纖維素薄膜,1,張，取時用鑷子夾住薄膜一,端，風(fēng)干或置于試管上，晾干，注意區(qū)分薄膜的“光,面”和“毛面”。,2.,電泳槽的準(zhǔn)備,（二）點(diǎn)樣,(,先劃線，再浸泡,),點(diǎn)樣時，先在

12、醋酸纖維薄膜的無光澤面距一端,1.5cm,處，,預(yù)先用鉛筆劃一條線作為點(diǎn)樣線，在緩沖液中浸泡,10,分鐘后，,晾干，去除多余的緩沖液,(,防止樣品擴(kuò)散稀釋,),，用點(diǎn)樣器的,邊緣沾上血清后，在點(diǎn)樣線上迅速地壓一下，使血清通過點(diǎn),樣器印吸在薄膜上，點(diǎn)樣力求均勻。（見圖）。此步是實(shí)驗(yàn),的關(guān)鍵。,醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖（虛線處為點(diǎn)樣位置）,（三）電,泳,將,點(diǎn)樣端,的薄膜平貼,在陰極,電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn),樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上,(,見下圖,),。,要求,薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。,連接好電泳儀。在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電,壓為,100,伏，電泳時間,

13、1hr,。電泳后，調(diào)節(jié)旋鈕使電流為零，,關(guān)閉電泳儀切斷電源。,醋酸纖維薄膜電泳裝,置示意圖,1.,濾紙橋,2.,電泳槽,3.,醋酸纖維素薄膜,4.,電泳槽膜支架,5.,電極室中央隔板,（四）染色與漂洗,電泳完畢后將薄膜取下,用剪刀剪出個性小口,（標(biāo)記用），,直接浸于氨基黑,10B,的染色液中，染,2 min,取出。將薄膜從,染色液中取出后用水沖洗后，依次在第一、第二、第三漂,洗液中漂洗，最后再用清水漂洗一遍，直至可清晰分辨出,5,條色帶。風(fēng)干或晾干。,血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜示意圖,（五）記錄和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,漂洗完畢后將薄膜取出,放在濾紙上。將薄膜上的,5,條色帶根據(jù)其顏色深淺、形狀、大

14、小及相對位置進(jìn)行,描述、記錄在實(shí)驗(yàn)報告本上，并判斷分析其結(jié)果。,注意事項(xiàng)：,薄膜和鉛筆畫示意圖均要提供，需要標(biāo)示每條,染色后條帶的名稱，并討論說明判斷原因。,六、注意事項(xiàng),1,、薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。,2,、點(diǎn)樣時，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，,吸水量以不干不濕為宜。,3,、點(diǎn)樣時，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞,膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果。,4,、點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過,多或過少。,5,、電泳時應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且,點(diǎn)樣面向下（,為什么？,）。,6,、應(yīng)控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間,太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要,時可進(jìn)行復(fù)染。,臨床意義,?,血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分,含量為,60,80g/L ,絕大部分由肝臟合成,僅,球蛋白由漿細(xì)胞合成,正常值,:,?,?,?,?,?,白蛋白,57%,72%,1,球蛋白,2%,5%,2,球蛋白,4%,9%,球蛋白,6.5%,12%,球蛋白,12%,20%,?,血漿蛋白的主要功