DNA提取原理和方法

1、可編輯ppt,1,DNA extraction,ZJL 2014.05.09,可編輯ppt,2,細(xì)胞內(nèi)的核酸包括DNA與RNA兩種分子，均與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白。 真核生物的DNA又有染色體DNA與細(xì)胞器DNA之分。前者為雙鏈線性分子；后者為雙鏈環(huán)狀分子。 除此之外，在原核生物中還有雙鏈環(huán)狀的質(zhì)粒DNA；在非細(xì)胞型病毒顆粒內(nèi)，DNA的存在形式多種多樣,DNA extraction,可編輯ppt,3,極性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑，鈉鹽比游離核酸易溶于水。 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。 天然狀態(tài)的DNA 是以脫氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于細(xì)胞

2、核中,核酸的理化性質(zhì),可編輯ppt,4,提取DNA總的原則,1 保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性； 2 其他生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度； 3 核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子； 4 其他核酸分子，如RNA，也應(yīng)盡量去除,可編輯ppt,5,DNA提取的幾種方法,基因組DNA的提取,非基因組DNA的提取,質(zhì)粒DNA的提取,可編輯ppt,6,基因組DNA的提取,根據(jù)裂解方式的不同有,可編輯ppt,7,吸附材料結(jié)合法,根據(jù)核酸分離純化方式的不同有,基因組DNA的提取,可編輯ppt,8,濃鹽法： 有機(jī)溶劑抽提法： 密度梯度離心法,利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者

3、分離,有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用,利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物,基因組DNA的提取,可編輯ppt,9,SDS法流程圖 （以動(dòng)物組織為例,動(dòng)物組織,細(xì)胞裂解,上層溶液,組織勻漿,抽提,干燥溶解,離心洗滌,酒精沉淀,DNA溶液,基因組DNASDS法,可編輯ppt,10,Approximately 1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube; Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55C overn

4、ight or until tissue is dissolved; More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr; Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube; Add 0.5 ml Chloroform and

5、vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times; A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate; Spin at 13,000 rp

6、m for 5 min at RT; If there is no pellet, place samples in -80C for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4C; Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; Resuspend DNA in ddH2O. Use 100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR,Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNA,可

7、編輯ppt,11,1.SDS ：十二烷基硫酸鈉,2.Tris：緩沖液,3.EDTA,2. Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55C overnight or until tissue is dissolved,作用：細(xì)胞裂解時(shí)PH值也能穩(wěn)定,作用：a. 溶解細(xì)胞膜、核膜上脂質(zhì)成分 b.使蛋白質(zhì)變性,作用：是二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶；降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,Tail solution,可編輯ppt,12,3. More Proteinase K may be added if dige

8、stion is not complete after 24 hr,Proteinase K,作用：廣譜蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白質(zhì)，將DNA游離,可編輯ppt,13,4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; 5. Spin at 13,000 rpm for 30 min at RT,優(yōu)點(diǎn)：1. 有效變性蛋白質(zhì)； 2. 抑制了DNase的降解作用。 缺點(diǎn)：能溶解10-15%的水，從而溶解一部分DNA,Phenol,Chloroform,1.加速有機(jī)相與液

9、相分層。 2.去除DNA水溶液中殘留的微量酚,減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。 有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定,Isoamyl alcohol,可編輯ppt,14,7.Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube; 8.Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for min at RT; 9.Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT,經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可

10、用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用,Chloroform,可編輯ppt,15,10.Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times; 11.Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT,NaOAc (pH=6.0),1. 沉淀核酸，縮短乙醇沉淀的時(shí)間 2. 提供單價(jià)陽離子。減少DNA分子之間的同性電荷

11、相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀,100% ethanol,任意比和水相混溶，奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。 但是加其他比例的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率,可編輯ppt,16,12. If there is no pellet, place samples in -80C for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4C; 13. Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; 14. Resus

12、pend DNA in ddH2O,DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。 2. 基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比,DNA的保存,可編輯ppt,17,非基因組DNA的提取,堿裂解法 密度梯度離心法 煮沸法,質(zhì)粒DNA的提取,可編輯ppt,18,1、培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增 -對(duì)數(shù)生長后期 2、收集和裂解細(xì)菌 3、質(zhì)粒DNA的純化,質(zhì)粒DNA的提取-堿裂解法,可編輯ppt,19,1、培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增 -對(duì)數(shù)生長后期 在含有相應(yīng)抗性的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)菌(單克隆)，使細(xì)菌快速增殖的同時(shí)質(zhì)粒DNA得到大量擴(kuò)增,質(zhì)粒DNA的提取-堿裂解法,可編輯ppt,2

13、0,2、收集和裂解細(xì)菌 非離子型/離子型去污劑 裂解 有機(jī)溶劑/堿 加熱,質(zhì)粒DNA的提取-堿裂解法,可編輯ppt,21,3 、質(zhì)粒DNA的純化 - CsCl-溴化乙錠梯度密度離心 取決于線狀DNA與閉環(huán)DNA與溴化乙錠結(jié)合的量,質(zhì)粒DNA的提取-堿裂解法,可編輯ppt,22,原理,染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子； 當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象； 變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從

14、而可通過離心將兩者分開,質(zhì)粒DNA的提取-堿裂解法,可編輯ppt,23,離心洗滌,質(zhì)粒DNA的提取-堿裂解法,可編輯ppt,24,SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液的成分及作用,溶液 Resuspension Buffer 成分：50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl， pH=8.0 葡萄糖: 增稠。維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械切力作用降解。 EDTA : 二價(jià)金屬離子的螯合劑，抑制DNase的活性。 有利于溶菌酶的作用。 這一步溶液中還可以加入RNase 溶菌酶：糖苷水解酶。當(dāng)溶液中PH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制,可編輯ppt,25,溶液 Lysis Bu

15、ffer 成分 ：0.2M NaOH / 1% SDS NaOH ：溶解細(xì)胞，DNA變性 SDS ： (1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。 (2)解聚細(xì)胞中的核蛋白。 (3)SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。 SDS與NaOH聯(lián)用：增強(qiáng)NaOH的強(qiáng)堿性,SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液的成分及作用,可編輯ppt,26,SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液的成分及作用,溶液 Neutralization Buffer 成分 ： 3M KAc / 2M HAc KAc : K+置換了SDS中的Na+，得到PDS沉淀 HAc : 中和NaOH,使DNA復(fù)

16、性,可編輯ppt,27,吸附柱 Spin Column with Collection Tubes,結(jié)構(gòu)： 特殊硅基質(zhì)吸附材料，特異性吸附DNA，而RNA與蛋白質(zhì)穿過。 高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫,可編輯ppt,28,大提&小提,區(qū)別： 1. 大提可以用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，而小提用的菌液量很少，一般1.5-5ml。 2.一般試劑盒中大提比小提多了溶菌酶、異丙醇（回收沉淀核酸）、LiCl（特異性去除RNA）、含一定量PEG的氯化物（回收質(zhì)粒DNA）及乙酸銨等，其作用及目的都是有利于細(xì)菌的裂解和質(zhì)粒的純化，所以大提的產(chǎn)物比小提的量多很多，而且純度很高。 3.

17、小提一般用于質(zhì)粒鑒定和對(duì)純度要求不是很高的實(shí)驗(yàn)，大提用于質(zhì)粒的大量提取和轉(zhuǎn)染等純度要求很高的實(shí)驗(yàn),可編輯ppt,29,內(nèi)毒素的去除,內(nèi)毒性也稱為脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性胞膜上一種成分，細(xì)菌外膜的外部脂質(zhì)完全由內(nèi)毒素分子組成。 包含疏水區(qū)域也包含了親水和帶電區(qū)域，從而賦予其與其它分子相互作用的獨(dú)特性質(zhì)。 細(xì)菌在其活躍生長時(shí)表面的內(nèi)毒素成分較少，而一旦其死亡則會(huì)釋放大量內(nèi)毒素。在質(zhì)粒提取的裂解過程中，內(nèi)毒素會(huì)從細(xì)菌的外膜釋放到裂解液中。 內(nèi)毒素會(huì)對(duì)原代細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生嚴(yán)重影響，同樣也會(huì)影響培養(yǎng)細(xì)胞的敏感性，內(nèi)毒素水平增加可導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的大幅下降,可編輯ppt,30,原理,染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得