生物傳感技術(shù)在食品農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用

1、第8期滿 燕, 等: 生物傳感技術(shù)在食品農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用11生物傳感技術(shù)在食品農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用滿 燕, 梁 剛, 靳欣欣, 付海龍, 潘立剛*(北京市農(nóng)林科學(xué)院, 北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究中心, 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(北京),農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100097)摘 要: 農(nóng)藥的大量使用引發(fā)的食品安全問題日益突出。目前, 食品中農(nóng)藥殘留的分析主要采用液相及液質(zhì)聯(lián)用、氣相及氣質(zhì)聯(lián)用等傳統(tǒng)檢測方法。這些方法具有較高檢測靈敏性和選擇性, 但卻需要昂貴的儀器設(shè)備以及專業(yè)的技術(shù)人員, 不能滿足當(dāng)前食品安全領(lǐng)域?qū)?shí)時(shí)、快速、便攜式檢測的需求。生物傳感技術(shù)作為

2、農(nóng)藥檢測的前景替代方法, 具有高專一性、高選擇性、便攜性和實(shí)時(shí)分析的性能, 因此, 可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測方法的不足。本文首先對應(yīng)用于農(nóng)藥檢測的基于酶的、抗體的生物傳感技術(shù)進(jìn)行綜述。其次, 對基于核酸適配體、微流控芯片、分子印跡的新型生物傳感技術(shù)在農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)介紹。最后, 對食品農(nóng)藥殘留檢測的發(fā)展前景進(jìn)行展望。關(guān)鍵詞: 食品; 農(nóng)藥殘留; 酶生物傳感器; 免疫傳感器; 檢測Application of biosensor techniques in pesticides detection in foodMAN Yan, LIANG Gang, JIN Xin-Xin, FU Hai-L

3、ong, PAN Li-Gang*(Beijing Municipal Key Laboratory of Agriculture Environment Monitoring, Risk Assessment Lab for agro-products (Beijing), Ministry of Agriculture, Beijing Research Center for Agricultural Standards and Testing,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, Chi

4、na)ABSTRACT: Food safety problems have become more and more serious due to the extensive use of pesticides. So far, the traditional detection methods, such as liquid chromatography (LC) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), gas chromatography (GC) and gas chromatography-mass spectrome

5、try (GC-MS), had been used for pesticides detection with the advantages of high sensitivity and selectivity. However, those methods required expensive equipments and highly qualified technicians. Moreover, it couldnt satisfy the needs of real-time, rapid and portable for the food safety areas. Biose

6、nsor techniques have become one of the most promising alternative methods for pesticides detection with the capabilities of high specificity, selectivity, portability and real-time analysis, which can make up the deficiency of the traditional detection methods. The enzyme/antibody-based biosensors f

7、or pesticide detection were reviewed firstly in this paper. Secondly, the new biosensor technologies based on aptamer, microfluidic chip and molecularly imprinted polymer (NIP) were introduced in detail as well. Finally, the development prospects of the biosensors for the pesticides detection were p

8、reviewed.KEY WORDS: food; pesticides; enzyme biosensor; immunosensor; detection1 引 言“民以食為天, 食以安為先”, 食品是人類賴以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ), 是人民生活最基本的必需品, 隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會進(jìn)步, 食品安全問題日益凸顯。食品污染主要包括生物性污染、化學(xué)污染和物理性污染3種, 其中, 農(nóng)藥是化學(xué)性污染的一大重要來源。農(nóng)藥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)不可或缺的, 在農(nóng)產(chǎn)品收獲前后, 施用多種農(nóng)藥以預(yù)防、消滅或控制農(nóng)作物不受害蟲、細(xì)菌、雜草、線蟲、嚙齒動物等侵害, 進(jìn)而提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量。農(nóng)藥是一種有機(jī)毒物, 基于其化學(xué)組成的不

9、同, 被分為有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等種類; 基于靶分子的不同, 可以分為殺蟲劑、殺線蟲劑、殺菌劑、除草劑等1。有機(jī)氯農(nóng)藥是以它們的強(qiáng)毒性效應(yīng)而不是作為殺蟲劑得到世界的關(guān)注, 它們的使用已被低毒、更加有效的有機(jī)磷(organophosphorus, OP)農(nóng)藥所代替2。最初, OP農(nóng)藥的使用被認(rèn)為是一種替代有機(jī)氯農(nóng)藥的安全選擇, 因而忽略了多年來的濫用、積累以及暴露對生命體產(chǎn)生的急性毒性影響。大量的農(nóng)藥會在施用點(diǎn)沿著順風(fēng)向方向漂流, 人和牲畜會通過皮膚、呼吸道、飲食等直接或間接途徑接觸到環(huán)境中的農(nóng)藥, 對生命體的健康產(chǎn)生危害; 同時(shí), 農(nóng)藥暴露也會對環(huán)境產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)3,4。目前使用

10、最多的農(nóng)藥是OP農(nóng)藥, 這種農(nóng)藥具有神經(jīng)毒性, 能對人或牲畜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶乙酰膽堿酯酶(AChE)產(chǎn)生不可逆的抑制作用, 因此, 會導(dǎo)致乙酰膽堿在神經(jīng)系統(tǒng)中的積累, 干擾器官的功能, 導(dǎo)致疾病發(fā)生甚至死亡5,6。其他種類的農(nóng)藥會對生殖發(fā)育系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、肝臟、中樞神經(jīng)和免疫系統(tǒng)造成影響3,7。食品中農(nóng)藥殘留傳統(tǒng)分析方法主要有氣相色譜(gas chromatography, GC)和氣質(zhì)聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)8,9, 液相色譜(liquid chromatography, LC)和液質(zhì)聯(lián)用(liquid chro

11、matography-mass spectrometry, LC-MS)10-12、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)13,14和其他光譜方法15,16。雖然這些方法具有高的檢測靈敏性、選擇性和可靠性, 但需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)的技術(shù)人員、費(fèi)時(shí)費(fèi)力, 因此不能滿足實(shí)時(shí)實(shí)地檢測的需求。生物傳感技術(shù)作為農(nóng)藥檢測的前景替代方法, 具有簡單快速、高專一性、高選擇性、成本低、便攜性和實(shí)時(shí)分析的性能, 可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測方法的不足, 已經(jīng)成為食品、環(huán)境等研究領(lǐng)域中的一種重要檢測方法17。生物傳感技術(shù)是將生物傳感元件(如酶、抗體、核酸等)和信號傳導(dǎo)方法(光、電化學(xué)、壓電等)18,19集成, 將生物化學(xué)反應(yīng)信號轉(zhuǎn)換

12、成可測量的電信號, 信號的大小與檢測的特定農(nóng)藥的濃度成比例。最初OP農(nóng)藥的檢測是通過基于酶的生物傳感器, 主要用來檢測不同OP農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶的抑制程度20?；诿敢种频纳飩鞲衅骶哂懈叩臋z測靈敏度, 檢測限達(dá)到10-10 mol/L, 但其檢測專一性差, 這是由于氨基甲酸鹽、重金屬等底物也能抑制酶的活性6。隨后又出現(xiàn)了基于酶催化水解、抗原抗體免疫反應(yīng)等相關(guān)的生物傳感器。本文首先是對應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測的酶、免疫生物傳感技術(shù)進(jìn)行了綜述; 其次, 對應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測的新型生物傳感技術(shù), 如核酸適配體、微流控芯片和分子印跡聚合物(MIPs)等進(jìn)行詳細(xì)介紹。2 酶生物傳感器用于食品中農(nóng)藥殘留檢測的

13、酶生物傳感器主要分為2種: (1)抑制型生物傳感器, 這是一種間接檢測方法; (2)催化型生物傳感器, 這是一種直接方法。酶生物傳感器作為一種簡單、快速、靈敏的檢測方法, 已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥的檢測。2.1 抑制型生物傳感器2.1.1 膽堿酯酶有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測主要是基于農(nóng)藥對膽堿酯酶的抑制。膽堿酯酶分為乙酰膽堿酯酶(AChE)和丁酰膽堿酯酶(BChE)2種不同類型, 目前用于農(nóng)藥檢測最多的是AChE21, 并且需要注意的是, 除了有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥外, 重金屬、氟化物、神經(jīng)毒氣、尼古丁等也能對膽堿酯酶的活性產(chǎn)生抑制, 因此會對農(nóng)藥檢測的特異性造成干擾, 因此基于酶抑制的生物

14、傳感器的選擇性不高。另外, 酶易失活, 因此在構(gòu)建膽堿酯酶生物傳感器時(shí), 最關(guān)鍵的步驟是酶在電極材料上的固定化, 這種固定化必須能保證傳感器酶的活性及穩(wěn)定性。目前, 已經(jīng)有大量文獻(xiàn)對酶的固定化方法進(jìn)行詳細(xì)的介紹及考察22,23?；陔娀瘜W(xué)檢測的膽堿酯酶生物傳感器。第一代膽堿酯酶生物傳感器出現(xiàn)在20世紀(jì)80年代末, 是一種測電流的雙酶(膽堿酯酶和膽堿氧化酶)生物傳感器, 其中所測電流來自酶對底物產(chǎn)生的氧化或還原電流。如Josiane等24制備了一種可再生的AChE電流型酶生物傳感器, 定量檢測滅多蟲農(nóng)藥的含量, 在樣品沒有經(jīng)過前處理的條件下, 測得卷心菜、西紅柿和豆?jié){食品中滅多蟲農(nóng)藥的含量在pp

15、b的范圍內(nèi), 制備的這種電流型酶生物傳感器的檢測限達(dá)到30.4 ng/mL。Raghu等25利用AChE電流型生物傳感器檢測食品中的馬拉硫磷和乙酰甲胺磷農(nóng)藥的含量, 得到馬拉硫磷農(nóng)藥的檢測限和定量檢測限分別為0.058 ng/mL、0.044 ng/mL, 乙酰甲胺磷農(nóng)藥的檢測限和定量檢測限分別0.194 ng/mL、0.147 ng/mL。此外, Stoytcheva等26對電流型生物傳感器在OP農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。除了上述電流型膽堿酯酶生物傳感器之外, 還有電勢型膽堿酯酶生物傳感器, 這種生物傳感器是測定傳感器表面酶層pH的變化, 其中pH的測量通常使用玻璃、金屬氧化電極或是pH敏感

16、場效應(yīng)晶體管。Khaled等27制備了一種簡單、便攜式的電勢型AChE傳感器, 檢測滅多蟲和OP農(nóng)藥, 檢測靈敏度為0.25 ng/mL37.5 g/mL。Zhang等28通過甲基纖維素、N,N-二甲基甲酰胺和牛血清白蛋白(BSA)的捕獲作用, 將AChE膜層固定在pH電極上, 構(gòu)建了一種電勢型生物傳感器, 得到5種農(nóng)藥的檢測限為10-7 mol/L?；跓晒鈾z測的膽堿酯酶生物傳感器。Meng等29制備了一種由酶(AChE和膽堿氧化酶)、量子點(diǎn)和乙酰膽堿組成的抑制性生物傳感器, 并將其應(yīng)用于蘋果樣本中OP農(nóng)藥敵敵畏的檢測, 檢測原理見圖1。當(dāng)存在OP農(nóng)藥敵敵畏時(shí), AChE被抑制, 隨后就會抑

17、制膽堿氧化酶, 這時(shí)過氧化氫的產(chǎn)量就會減少, 從而導(dǎo)致量子點(diǎn)熒光淬滅減弱。當(dāng)OP濃度增加時(shí), 量子點(diǎn)的熒光淬滅程度也會相應(yīng)減弱。最后, 利用這種生物傳感器得到敵敵畏的最低檢測限為4.49 nmol/L。另外, Long等30制備了一種基于上轉(zhuǎn)換納米材料的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)傳感器, 得到甲基對硫磷、久效磷和樂果的檢測限分別為0.67、23和67 ng/L。其檢測原理(見圖2): 熒光共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNPs)和AuNPs之間, 其中UCNPs作為供體, AuNPs作為受體; 膠體金納米顆粒(AuNPs)通過靜電相互作用結(jié)合到UCNPs表面, 使UCNPs的熒光淬滅。

18、硫代乙酰膽堿(ATC)是乙酰膽堿的結(jié)構(gòu)類似物, 是AChE的底物, 能被AChE水解成硫代膽堿。硫代膽堿和AuNPs之間的靜電作用和金硫鍵作用導(dǎo)致AuNPs/UCNPs聚合物的分離和AuNPs的聚集。當(dāng)OPs農(nóng)藥存在時(shí), AChE的活性被抑制, 阻礙硫代膽堿的產(chǎn)生和FRET體系的形成, 因此UCNPs熒光被淬滅。圖 1 基于AChE抑制機(jī)理的有機(jī)磷QDs熒光檢測示意圖Fig. 1 QDs fluorescence detection schemes for organophosphorus based on the AChE inhibition圖 2 UCNPs-AuNPs熒光檢測農(nóng)藥原理示

19、意圖Fig. 2 Schematic illustration of the UCNPs-AuNPs fluorescence assay for the detection of pesticides2.1.2 過氧化物酶據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 金屬、p-氨基苯甲酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、羥胺、硫化物、硫脲嘧啶、重鉻酸鹽、硫醇、二乙基二硫代氨基甲酸酯、氰化物等對過氧化物酶也有抑制作用31,32?；谶^氧化物酶抑制作用的生物傳感器也被用于農(nóng)藥檢測, 如Moccelini等33通過方波伏安法, 利用苜蓿芽中的過氧化物酶檢測農(nóng)藥硫雙威。其中過氧化物酶在金電極上的固定是通過L-半胱氨酸的自組裝作用形成的(圖3)

20、。利用這種方法對蔬菜樣本中的硫雙威進(jìn)行檢測, 得到硫雙威的線性曲線的濃度范圍為2.2710-64.4010-5 mol/L, 檢測限為5.7510-7 mol/L, 這種檢測方法得到的結(jié)果與HPLC方法所得檢測結(jié)果基本相同, 并且這種基于過氧化物酶的生物傳感器具有檢測過程不受基質(zhì)干擾、不需要衍生化處理、低成本和響應(yīng)時(shí)間短等的優(yōu)點(diǎn)。Sahin等34利用有機(jī)磷水解酶和辣根過氧化物酶, 制備了一種雙酶電化學(xué)傳感器檢測OP農(nóng)藥, 得到除線磷的檢測靈敏度為(0.0950.024) mol/L, 最低檢測限為7.6 pmol/L。2.1.3 酸性/堿性磷酸酶酸性磷酸酶也能被一些農(nóng)藥可逆抑制。Mazzeia

21、等35制備了2種不同類型的電流型酸性磷酸酶/葡萄糖氧化酶(GOD)雙酶生物傳感器, 定量檢測有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。一種是經(jīng)典的雙酶生物傳感器, 它是通過物理化學(xué)方法在安培計(jì)電極的頂端固定酸性磷酸酶和葡萄糖氧化酶制備而成; 另外一種是混合型生物傳感器, 是將酸性磷酸酶固定于馬鈴薯薄層組織, 這種固定方法可以使酶具有高的酶活。這兩種生物傳感器對葡萄糖-6-磷酸(G6P)的檢測限為5.010-51.210-3 mol/L, OP農(nóng)藥的檢測限達(dá)到1 g/L。堿性磷酸酶能被多種化合物抑制, 如有機(jī)磷、有機(jī)氯、重金屬等。Mazzei等36研制了一種基于堿性磷酸酶的電化學(xué)生物傳感器, 其中以吲羥磷酸、

22、磷酸苯或抗壞血酸-2-磷酸作為酶的底物, 用于檢測農(nóng)藥馬拉硫磷和2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)。Snchez等37制備了一種基于堿性磷酸酶的熒光生物傳感器, 用于檢測有機(jī)氯(四氯殺螨砜)、氨基甲酸酯(威百畝)、有機(jī)磷農(nóng)藥(殺螟硫磷)、重金屬Ag+和CN-。2.2 催化型生物傳感器催化型生物傳感器的構(gòu)建主要基于有機(jī)磷水解酶(organophosphorus hydrolase, OPH), 這種生物傳感器是以農(nóng)藥作為酶的底物, 而不是酶的抑制劑。OPH是一種典型的細(xì)菌酶, 被稱為磷酸三酯酶。OPH具有一定的底物專一性, 能夠水解OP農(nóng)藥(對氧磷、對硫磷、蠅毒磷、二嗪農(nóng)、毒死蜱和甲基對硫磷)

23、和化學(xué)戰(zhàn)劑(甲氟膦酸異丙酯和甲氟磷酸異已酯)?；贠PH的生物傳感器, 被認(rèn)為是一種更好用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測的生物傳感器, 主要原因是: 催化型生物傳感器可以被重復(fù)使用, 并且可以用于樣本的連續(xù)圖3 Au電極上過氧化物酶的固定原理圖Fig. 3 Schematic of peroxidase immobilizing on gold electrode檢測。目前, 基于OPH的電流型、電勢型和光學(xué)型生物傳感器已經(jīng)被詳細(xì)介紹38,39, 如Tang等40制備了一種新型的電化學(xué)微生物傳感器, 用于快速檢測p-對硝基苯酚取代的有機(jī)磷化合物。作者在這種生物傳感器的玻碳電極上修飾了一種基因工程細(xì)胞, 這種

24、細(xì)胞的表面可以表達(dá)OPH, 并且將有序的中孔碳(OMCs)與這種OPH進(jìn)行組合。這種基因工程細(xì)胞表達(dá)的OPH的酶活性和穩(wěn)定性較高, 并且不需要耗費(fèi)時(shí)間對酶進(jìn)行提取和純化, 最后得到對氧磷、對硫磷和甲基對硫磷的最低檢測限分別為9.010-9、1010-9和1510-9 mol/L。3 免疫生物傳感器大多數(shù)基于酶的生物傳感器僅能檢測農(nóng)藥的總含量, 不能檢測農(nóng)藥中某種特定農(nóng)藥分子。而免疫生物傳感器是以抗體或抗原作為特定的生物傳感元素, 可以專一性地檢測特定農(nóng)藥分子。另外, 免疫傳感器還具有實(shí)時(shí)檢測的潛能, 具備小型化和價(jià)格低廉的特性?；诳贵w-半抗原反應(yīng)的免疫傳感器已經(jīng)成為一種重要的分析工具并用于農(nóng)

25、藥的檢測, 免疫傳感器在食品中農(nóng)藥殘留檢測的應(yīng)用已有大量文獻(xiàn)報(bào)道41-44。農(nóng)藥屬于有機(jī)小分子, 一般只有一個(gè)單克隆抗體, 因此在這些免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中通常采用競爭法檢測農(nóng)藥。但是這種競爭法操作相對比較復(fù)雜, 因此不需標(biāo)記熒光化合物、酶等的非標(biāo)記型生物傳感器在農(nóng)藥檢測上具有更大的優(yōu)勢。與標(biāo)記型生物傳感器相比, 非標(biāo)記型生物傳感器具有簡單、成本低和實(shí)時(shí)檢測的特點(diǎn), 但非標(biāo)記型生物傳感器的體積較大, 操作復(fù)雜, 因此不能將其簡單的操作或組裝用于快速檢測?；诓煌男盘栟D(zhuǎn)換機(jī)制, 非標(biāo)記型生物傳感器又分為表面等離子共振(SPR)45、石英晶體微量天平(QCMs)46和微懸臂梁47等。3.1 電化學(xué)免疫傳

26、感器多種類型的電化學(xué)免疫傳感器已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留的檢測。Liu等48制備了一種非標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器檢測莠去津(OC)(圖4), 在此傳感器的金電極表面上修飾AuNPs, 這種修飾的金電極具有較好的電化學(xué)活性, 并且AuNPs可以增加莠去津單克隆抗體的固載量, 因此, 也能提高傳感系統(tǒng)的檢測靈敏度。莠去津與莠去津單克隆抗體相互作用的信號由微分脈沖伏安法(DPV)檢測, 最后得到莠去津的最低檢測限為0.016 ng/mL, 線性范圍為0.050.5 ng/mL。Valera等49,50利用電導(dǎo)式競爭性免疫傳感器定量檢測紅酒樣品中的莠去津, 其中傳感電極使用的是自組裝集成的微電極(I

27、DuEs), 這種傳感器可以檢測濃度在10-9 ng/mL以下的莠去津, 并且使用的是簡單、價(jià)格低廉的直流型檢測器。Mosiello等51制備了一種基于單克隆抗體的電位型生物傳感器, 用于檢測水樣中的農(nóng)藥特丁津。這種生物傳感器的傳感元件是光可尋址電位傳感器(LAPS), 最后得到特丁津的線性檢測范圍為1.510 g/L。Ionescu等48制備了一種非標(biāo)記型電化學(xué)阻抗免疫傳感器檢測農(nóng)藥莠去津, 其中莠去津抗體固定在金電極上嵌有Cu2+的聚吡咯膜上, 這種傳感器具有高的檢測靈敏度、操作簡單、實(shí)驗(yàn)成本低、分析時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn), 檢測限達(dá)到10 pg/mL。3.2 光學(xué)免疫傳感器光學(xué)免疫傳感器的檢測主要

28、是基于抗原抗體結(jié)合產(chǎn)生的光學(xué)信號的改變。Kim等52,53制備了一個(gè)基于SPR的非標(biāo)記型間接競爭免疫傳感器, 高靈敏、高選擇性地檢測水中的2, 4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。SPR免疫傳感器傳感界面的形成是將BSA與2,4-D共價(jià)結(jié)合形成的2,4-D-BSA復(fù)合物固定到金電極的表面上巰基丙酸(MPA)層層自組裝形圖4 電化學(xué)免疫傳感器檢測莠去津原理圖Fig. 4 Schematic of electrochemical immunosensor for the detection of atrazine成的膜層上。構(gòu)建的這種免疫傳感器對2,4-D的最低檢測限為10 pg/mL。另外, 還有一

29、種基于全內(nèi)反射熒光(TIRF)的全纖維免疫傳感器用于檢測水中的農(nóng)藥2,4-D54, 55。3.3 壓電式免疫傳感器壓電式免疫傳感器主要是基于固定有抗原或抗體的石英晶體等材料制備而成, 目前主要用到的是石英晶體微量天平(QCMs)傳感器, 這種傳感器具有非常高的檢測靈敏度。March等56制備了一種QCM免疫傳感器用于檢測果汁中殺蟲劑西維因和三氯吡啶酚(TCP)殘留。通過自組裝, 硫辛酸在石英晶體表面的金電極上形成自組裝單層膜(SAM), 半抗原復(fù)合物被共價(jià)結(jié)合到自組裝膜上。最后得到西維因和TCP的檢測限分別為11 g/L和7 g/L; 線性檢測范圍分別為1553 g/L和1383 g/L。這種

30、傳感器具有高檢測靈敏性、專一性, 高精度和準(zhǔn)確度等優(yōu)點(diǎn)。另外, Wang等57制備了一種基于薄膜體聲波諧振器(FBAR)的高靈敏非標(biāo)記生物傳感器用于檢測農(nóng)藥殘留。作者通過自組裝的方法將人工抗原固定到共振器的傳感表面, 形成競爭性免疫檢測界面。2 GHz的FBAR作為生物傳感器的質(zhì)量敏感轉(zhuǎn)換器; 通過共振器頻率的改變, 實(shí)時(shí)測定競爭性免疫反應(yīng)。當(dāng)存在農(nóng)藥時(shí), 頻率遷移減少。這種傳感器對對硫磷的檢測區(qū)間為0.1732.5 g/L, 其超低的最低檢測限達(dá)到0.08 g/L。3.4 機(jī)械免疫傳感器微懸臂梁傳感器微懸臂梁傳感器以表面應(yīng)力或是質(zhì)量的改變作為響應(yīng)。固定的抗體和分析物之間的相互作用能使懸臂的表

31、面應(yīng)力改變, 這種傳感器能檢測到由于抗原抗體作用而發(fā)生的懸臂偏轉(zhuǎn)。Kaur等58在金電極的表面固定2,4-D和莠去津2種農(nóng)藥抗體, 制備了活性免疫傳感器界面; 農(nóng)藥與抗體之間的粘附力利用半抗原裝載的蛋白功能化的原子力顯微鏡(AFM)懸臂進(jìn)行測量。另外, 抗體在抗原涂層的懸臂上的粘附已經(jīng)通過基于懸臂的檢測系統(tǒng)進(jìn)行了多次研究59。4 新型生物傳感技術(shù)4.1 核酸適配體核酸適配體是利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX), 從合成的寡核苷酸文庫中經(jīng)體外篩選得到的能與金屬離子、小分

32、子、生物大分子, 甚至與整個(gè)細(xì)胞高親和性和專一性結(jié)合的ssDNA或RNA分子60。與抗體相比, 核酸適配體具有高親和性、穩(wěn)定性、無免疫原性、可修飾性、靶分子的廣泛性等優(yōu)點(diǎn), 并且理論上講, 自然界中所有的分子都應(yīng)該有其核酸適配體61。核酸適配體的這些優(yōu)點(diǎn)解決了抗體在篩選過程中出現(xiàn)的問題, 如(1)小分子不能誘導(dǎo)免疫反應(yīng), 必須與BSA蛋白衍生化后才能進(jìn)行抗體篩選; (2)抗體的穩(wěn)定性差, 在不適宜的條件下易失活、降解等。目前, 基于核酸適配體的生物傳感器已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于分析多種農(nóng)藥小分子62。Shi等63利用基于核酸適配體的比色傳感器檢測油中的啶蟲脒農(nóng)藥殘留(圖5), 最后得到啶蟲脒的線性范圍

33、為75 nmol7.5 mol/L最低檢測限為5 nmol/L; 另外本文作者還利用啶蟲脒的結(jié)構(gòu)類似物吡蟲啉和毒死蜱對該生物傳感器高的檢測專一性進(jìn)行考察驗(yàn)證。Bala等64也制備了一種基于AuNPs的適配體比色傳感器, 可視化檢測蘋果汁中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留甲拌磷。適配體的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)使AuNPs保持穩(wěn)定性, 當(dāng)存在農(nóng)藥目標(biāo)物時(shí), 適配體則變?yōu)橐环N剛性結(jié)構(gòu)與目標(biāo)物結(jié)合, 這種剛性結(jié)構(gòu)導(dǎo)致AuNPs聚集, 肉眼可見溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。利用這種生物傳感方法得到甲拌磷的檢測限為0.01 nmol/L。另外, Pang等65制備了一種基于核酸適配體的表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)方法, 快速檢測蘋果汁中

34、的水胺硫磷、氧化樂果、甲拌磷和丙溴磷4種農(nóng)藥殘留, 最后得到它們的檢測限分別為3.4、24、0.4和14 mol/L。由于OP農(nóng)藥和分子信標(biāo)(MB)可以同時(shí)競爭性結(jié)合核酸適配體, Zhang等66利用這種原理檢測熒光信號激活的程度, 間接檢測OP農(nóng)藥殘留, 具體的檢測原理為: MB是一種高靈敏、高特異性的新型熒光核酸探針, 當(dāng)它與互補(bǔ)的DNA或是RNA序列結(jié)合時(shí)會激發(fā)出熒光。當(dāng)樣品中沒有OP農(nóng)藥殘留時(shí), MB與適配體互補(bǔ)鏈結(jié)合, MB鏈展開, 熒光激發(fā); 當(dāng)樣本中存在OP農(nóng)藥殘留時(shí), 一部分適配體與MB鏈結(jié)合, 一部分與OP農(nóng)藥結(jié)合, 這樣就熒光激活的程度降低, 熒光信號減弱(圖6)。利用這種

35、方法對樣本中的甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷和氧化樂果農(nóng)藥進(jìn)行檢測, 得到的檢測限分別為19.2、13.4、17.2和23.4 nmol/L。隨后, Dou等67構(gòu)建了一種基于金納米顆粒的新型MB傳感器, 檢測干桔皮中的有機(jī)磷農(nóng)藥, 得到水胺硫磷、丙溴磷、甲拌磷和氧化樂果農(nóng)藥的檢測限分別為0.035、0.134、0.384和2.35 mol/L。4.2 分子印跡聚合物分子印跡聚合物(MIPs)是一種合成的聚合物材料, 這種材料帶有與模板分子的形狀、大小和官能團(tuán)互補(bǔ)的專一性識別位點(diǎn)68,69。與基于酶的生物傳感器和免疫傳感器相比, MIPs傳感器具有更高的穩(wěn)定性、成本低、操作簡單、模板和功能分子聚合物

36、的選擇范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。目前, MIPs作為一種靈敏的人造傳感識別元件, 已經(jīng)被大量應(yīng)用于農(nóng)藥檢測的生物傳感器中。Xue等70將甲基對硫磷(MP)作為模板分子, 苯酚作為功能分子, 通過電聚合作用將MIP合成到Au電極上, 制備了一種新型、高選擇性和高靈敏性的電化學(xué)傳感器。其中, 電極的修飾是通過將懸浮的石墨烯沉積在電極的表面而制備的, 這種修飾使電極具有高的電導(dǎo)率和高的表面積, 具體制備過程見圖7。同時(shí), 在鐵溶液中, 利用循環(huán)伏安法(CV)評估分子印跡的和非分子印跡的聚合物, 分子印跡的聚合物表現(xiàn)出對MP具有高的選擇性和靈敏性。在優(yōu)化條件下得到MP的檢測范圍為0.110 g/mL; 檢測限為0

37、.01 g/mL(n=8)。圖5 基于核酸適配體的比色傳感器檢測啶蟲脒的原理圖Fig. 5 Schematic of colorimetric sensors based on aptamer for the detection of acetamiprid圖6 基于分子信標(biāo)的OP農(nóng)藥熒光檢測原理圖Fig. 6 Schematic of organophosphorus pesticide fluorescence detection based on MB圖7 Au電極表面MIPs生物傳感器的構(gòu)建原理圖Fig. 7 Schematic of the construction of MIPs

38、biosensor on Au electrode surfaceAnirudhan等71制備了一種高選擇性和高專一性的電位式傳感器, 用來檢測有機(jī)氯農(nóng)藥-六氯環(huán)己烷(-HCCH)。傳感器中的MIPs被固定在多層碳納米管(MWCNT)上。這種生物傳感器對農(nóng)藥的檢測范圍為110-10110-3 mol/L檢測限為1.010-10 mol/L。Toro等72建立了另外一種基于MIPs的新型生物模擬傳感器, 檢測環(huán)境中的除草劑環(huán)嗪酮(HXZ)。MIPs是通過非共價(jià)的方法合成的, 其中應(yīng)用在聚合反應(yīng)中的單體是通過分子建模方法篩選出的。在傳感器的構(gòu)建中, 利用MIP或NIP(非印跡聚合物)分別修飾電極,

39、 最后使用電極糊微分脈沖吸附陰極溶出伏安法(DPAdCSV)檢測HXZ。這種新型傳感器具有高的靈敏度, 對農(nóng)藥HXZ的濃度檢測范圍在10-10 mol/L另外, 除了上述的電化學(xué)檢測外, 還有一種基于MIPs的光學(xué)傳感器和化學(xué)發(fā)光傳感器, 如Jenkins等73將MIPs結(jié)合到光學(xué)纖維上, 制備了一種用于檢測毒死蜱、二嗪農(nóng)和草甘膦農(nóng)藥的光學(xué)生物傳感器。在這個(gè)傳感器中, 使用發(fā)光的鑭系元素(銪)作為光譜探針, 并將其結(jié)合到聚合物中。當(dāng)農(nóng)藥與銪離子相組合時(shí), 鑭系元素的光譜會發(fā)生改變, 然后利用光譜的這種改變實(shí)現(xiàn)樣品的檢測。Yao等74將SPR光譜與MIPs進(jìn)行集成, 利用磁分子印跡聚合物放大SP

40、R反應(yīng), 提高檢測靈敏度, 最后得到毒死蜱的檢測限為0.76 nmol/L。Wang等75在紙上通過原位聚合反應(yīng)接枝MIPs, 利用競爭性化學(xué)發(fā)光法高靈敏、專一性檢測食品中的農(nóng)藥殘留2,4-D, 最后得到2,4-D的檢測限為fmol/L平。4.3 微流控芯片微流控芯片技術(shù)已被列入21世紀(jì)最重要的前沿技術(shù)行列。微流控芯片作為一種極具潛力的分析平臺, 可以與實(shí)驗(yàn)室中所用到的生物技術(shù)或分析方法進(jìn)行集成, 以降低樣品的消耗量, 縮短分析時(shí)間, 提高檢測的靈敏度, 實(shí)現(xiàn)樣品的高通量檢測。微流控芯片的檢測一般都是基于生物傳感技術(shù)的原理, 待檢樣本中特定目標(biāo)分子的檢測是通過該目標(biāo)分子與微流控芯片上的生物傳感

41、元件的專一性識別、結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的76。與生物傳感器相似, 抗體、核酸、適配體、細(xì)胞、酶、肽段、MIPs等都能作為生物傳感元件應(yīng)用于微流控芯片傳感器的構(gòu)建77。目前, 微流控芯片技術(shù)已經(jīng)作為一種重要的分析檢測工具廣泛應(yīng)用于各種分析領(lǐng)域, 但是在農(nóng)藥檢測的應(yīng)用上卻少有文獻(xiàn)報(bào)道。Mishra等78制備了一種快速、高靈敏的化學(xué)發(fā)光酶抑制方法, 利用OP農(nóng)藥對丁酰膽堿酯酶(BuChE)的抑制作用, 實(shí)現(xiàn)牛奶中OP農(nóng)藥殘留的定量檢測。作者將BuChE固定在一個(gè)含有384孔的微陣列芯片上, 在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了牛奶中OPs的快速檢測。作者對牛奶中的對甲基對氧磷(MPOx)、甲基對硫磷(MP)和馬拉硫磷(MT

42、)分別進(jìn)行檢測, 并且也考察了3種OP農(nóng)藥對BuChE抑制上的協(xié)同效應(yīng), 最后得到MPOx、MP和MT的線性檢測范圍分別為0.00550 g/L、0.51000 g/L和0.5 1000 g/L。Li等79制備了一種快速、免標(biāo)記的SPR生物免疫芯片, 用于檢測OP農(nóng)藥蠅毒磷。實(shí)驗(yàn)中使用的是沒有經(jīng)過純化的單克隆抗體, 并且能連續(xù)檢測80組樣品。與ELISA和其他檢測方法相比, 這種方法具有免標(biāo)記、高專一性、樣品前處理簡單、便攜式等優(yōu)點(diǎn), 并且可以應(yīng)用于超市、集市場和工廠中的實(shí)時(shí)、快速和定量檢測。Wang等72在PMMA微流控芯片上構(gòu)建了酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。作者利用Al2O3溶膠凝膠基質(zhì)將抗體固定在

43、聚合物預(yù)處理的微流控芯片通道上, 這種固定方法可以維持抗體的生物活性, 并且能避免微流控芯片通道對樣品的非特異性吸附。這種微芯片具有高的檢測靈敏度, 檢測限為1 pg/mL, 線性范圍為1500 pg/mL。Guo等80搭建了一種PDMS阻抗免疫傳感器, 高靈敏檢測蔬菜樣本中的農(nóng)藥殘留, 最后利用這種生物傳感器實(shí)現(xiàn)了韭菜、小白菜、生菜中毒死蜱農(nóng)藥的定量檢測。Jia等81在微流控芯片通道內(nèi), 嵌入了相互交錯(cuò)集成的陣列金微電極, 制備了一個(gè)基于微流控芯片的電化學(xué)阻抗免疫傳感器, 用來檢測黃瓜、青菜、生菜樣本中的毒死蜱, 得到的檢測限為0.5 ng/mL。5 結(jié) 論基于酶、抗體、核酸適配體、MIPs

44、、微流控芯片的生物傳感器已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣本中農(nóng)藥殘留的檢測。基于酶的生物傳感器是用于農(nóng)藥檢測最早、最多的生物傳感器, 其檢測具有簡單、快速和高靈敏的特性, 其中酶的活性對生物傳感器的檢測靈敏度至關(guān)重要, 并且只能對農(nóng)藥的總含量進(jìn)行測定, 不能對某種特定的農(nóng)藥進(jìn)行定量、定性檢測。另外, 在酶抑制型生物傳感器中, OP農(nóng)藥對酶的抑制是不可逆的, 因此, 這種傳感器不具備重復(fù)使用的性能。免疫生物傳感器特別適用于極性或水溶性農(nóng)藥的檢測, 檢測速度比傳統(tǒng)的檢測方法快, 專一性強(qiáng), 但是這種傳感器在農(nóng)藥檢測的應(yīng)用上還存在一定的局限性, 這是由于農(nóng)藥屬于有機(jī)小分子, 其抗體的篩選與大分子相比還是比較困

45、難的。另外, 免疫傳感器的檢測靈敏度還沒有達(dá)到傳統(tǒng)液質(zhì)聯(lián)用的檢測靈敏度。目前, 基于核酸適配體、MIPs、微流控芯片等的新技術(shù)在食品中農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用變得越來越重要。與抗體相比較, 核酸適配體的穩(wěn)定性好, 其親和能力可以與抗原抗體的親和性能相媲美, 并且理論上幾乎所有的分子都有其核酸適配體。但是, 農(nóng)藥屬于有機(jī)小分子, 小分子核酸適配體的篩選與大分子相比相對比較困難。因此, 未來的研究重點(diǎn)應(yīng)著重于農(nóng)藥小分子高專一性、親和性的核酸適配體的篩選。MIPs作為一種靈敏的人造傳感識別元件, 具有更高的穩(wěn)定性, 模板和功能分子聚合物的選擇范圍寬等優(yōu)點(diǎn), 但是這種分子印跡聚合物的制備過程比較繁瑣, 響

46、應(yīng)時(shí)間過長, 因此目前這種方法依然沒有被完全開發(fā)并廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥小分子的檢測。微流控芯片作為21世紀(jì)一種重要的前沿分析技術(shù)之一, 具有集成化、微型化、便攜式檢測的優(yōu)點(diǎn), 國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)投入更多的時(shí)間和精力, 將其廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥的檢測。參考文獻(xiàn)1 Odukkathil G, Vasudevan N. Toxicity and bioremediation of pesticides in agricultural soil J. Rev Environ Sci Bio/Technol, 2013, 12(4): 421-444.2 Singh BK, Walker A, Wright DJ. Bi

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