基因工程制藥ppt課件

1、第四章 基因工程制藥,在制藥業(yè)中，醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)經(jīng)歷了3 個(gè)不同的歷史階段,天然藥物 通過(guò)化學(xué)方法合成的藥物 基因工程藥物,基因工程藥物3 個(gè)階段: 其一是細(xì)菌基因工程，即把目的基因通過(guò)適當(dāng)?shù)母慕▽?dǎo)入大腸桿菌中，再通過(guò)細(xì)菌等原核微生物表達(dá)的目的蛋白作為藥物; 其二是細(xì)胞基因工程藥物，這是把人或哺乳動(dòng)物的基因直接導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，生產(chǎn)有生物活性的產(chǎn)品; 其三是利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)低成本、高活性的藥物,第一節(jié) 基因工程藥物概述 第二節(jié) 基因工程藥物的表達(dá) 第三節(jié) 基因工程藥物的生產(chǎn) 第四節(jié) 基因藥物實(shí)例 轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物制藥,新型生物藥物研發(fā)流程,第一節(jié) 基因工程藥物概述,意義：自20世界70年代基因工程

2、誕生以來(lái)，最先應(yīng)用基因工程技術(shù)且目前最為活躍的研究領(lǐng)域便是醫(yī)藥科學(xué)?；蚬こ碳夹g(shù)的迅猛發(fā)展使人們已能夠十分方便有效地生產(chǎn)許多以往難以大量獲得的生物活性物質(zhì)，甚至可以創(chuàng)造出自然界中不存在的全新物質(zhì)。1982年第一個(gè)基因重組產(chǎn)品人胰島素在美國(guó)問(wèn)世，吸引和激勵(lì)了大批科學(xué)家利用基因工程技術(shù)研制新藥品，迄今累計(jì)已有近30種基因工程藥物投入市場(chǎng)，產(chǎn)生了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益,1）免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體； （2）細(xì)胞因子，如各種干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、凝血因子； （3）激素，如胰島素、生長(zhǎng)激素、心素納； （4）酶類，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、組織型纖維蛋白溶酶原激活

3、劑、超氧化物歧化酶,一、基因工程技術(shù)可生產(chǎn)的藥物和制劑,二、基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥物的優(yōu)點(diǎn),1）利用基因工程技術(shù)可大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白質(zhì)和多肽，為臨床使用提供有效保障； （2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的使用范圍,3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)，挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)； （4）內(nèi)源生理活性物質(zhì)在作為藥物使用存放的不足之處，可以通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除； （5）利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源,三、我國(guó)基因工程藥物研究和開發(fā),起步較晚，基礎(chǔ)較差。 1b 型基因工程干擾素是由我國(guó)自行研制開發(fā)

4、的具有國(guó)際先進(jìn)水平的生物高科技成果，于1997年 通過(guò) 期臨床，并獲得國(guó)家一類新藥證書，成為“863”計(jì)劃生物技術(shù)領(lǐng)域第一個(gè)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的基因工程藥物。 目前我國(guó)已批準(zhǔn)12種基因工程藥物和疫苗上市，在研究開發(fā)中的也有10余種,四、基因工程藥物生產(chǎn)的基本過(guò)程,定義：基因工程技術(shù)是指將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌（或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá),基因工程藥物制造的一般流程： （1）獲得目的基因； （2）組建重組質(zhì)粒； （3）構(gòu)建基因工程菌； （4）培養(yǎng)工程菌； （5）產(chǎn)物分離純化； （6）除菌過(guò)濾； （7）半成品檢定； （8

5、）包裝,上游階段,下游階段,1、上游階段：首先獲得目的基因，然后用限制性內(nèi)切酶和連接酶將其插入適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)?；蚴删w中并轉(zhuǎn)大腸桿菌或其它宿主菌（細(xì)胞），以便大量復(fù)制目的基因。選擇基因表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)功能，其次要考慮的是表達(dá)量的多少和分離純化的難易。其中的（1）、（2）、（3）步驟屬于上游階段，在實(shí)驗(yàn)室完成。 2、下游階段：將實(shí)驗(yàn)室成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，它主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度純品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)的優(yōu)化控制等。上述（4）、（5）、（6）、（7）、（8

6、）等屬于下游階段,第二節(jié) 基因工程藥物的表達(dá),一、藥物基因的分離 二、基因表達(dá),一、藥物基因的分離,目前基因工程藥物大都是人基因片段的蛋白產(chǎn)物，或糖基化修飾后的蛋白產(chǎn)物。 真核生物的基因一般包括了若干外顯子和內(nèi)含子。由于內(nèi)含子不能翻譯產(chǎn)物，因此基因工程藥物表達(dá)所使用的基因通常是cDNA，即mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,特定的mRNA可以通過(guò)不同的方法獲得,cDNA文庫(kù) 直接從特定的mRNA分離基因 從蛋白質(zhì)分離編碼基因 基因的化學(xué)合成 RT-PCR分離基因,1、mRNA的純化 2、cDNA第一鏈的合成 3、cDNA第二鏈的合成 4、cDNA克隆 5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 6、cDNA文庫(kù)的鑒定 7、目

7、的cDNA克隆的分離和鑒定,一）cDNA文庫(kù),方法： oligo(DT)親和層析法,一般 mRNA都帶有3polyA，所以可以用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。 用放射性探針?lè)z測(cè),以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈,1）核酸探針雜交法 （2）免疫反應(yīng)鑒定法,用于cDNA克隆的載體有兩類： 質(zhì)粒DNA和噬菌體。又將其分為表達(dá)型載體和非表達(dá)型載體。選用表達(dá)型載體可以增加目的基因的篩選方法，有利于目的基因的篩選。 cDNA片段與載體的連接通常采用下面方法： 加同聚尾連接：在載體和cDNA的3末端加上互補(bǔ)的同型多聚酶序列。 人工接頭連接：所謂人工接頭是指用人工合成的、連接在

8、目的基因兩端的含有某些限制酶切點(diǎn)的寡核苷酸片斷,前提：較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因，必須知道目的基因的核苷酸排列順序，或知道目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序，再按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基序列。 限制,二）化學(xué)合成法,一、不能合成太長(zhǎng)的基因。 二、人工合成基因時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并會(huì)為選擇密碼子帶來(lái)很大的困難。 三、費(fèi)用高,三）RT-PCR,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)法。該方法是mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，不需再合成第二鏈，而是在特異引物的協(xié)助下，用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，特異地合成目的cDNA鏈，用于重組，克隆,二、基因表達(dá),基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程。 基因表達(dá)研究是指外源基

9、因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)，即剪切下一個(gè)外源基因片斷，拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物,基因工程重組藥物宿主的選擇主要考慮產(chǎn)物的活性表達(dá)和宿主的安全性。 一般的原則是根據(jù)所用的載體體系及各種受體細(xì)胞的基因型進(jìn)行選擇，要使重組體的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染效率高、能穩(wěn)定傳代、受體細(xì)胞基因型與載體所含的選擇標(biāo)記需匹配,一）宿主細(xì)胞的選擇,1、原核細(xì)胞 2、真核細(xì)胞,1）大腸桿菌：目前采用最多的原核表達(dá)體系。 （2）枯草芽孢桿菌 （3）鏈霉菌,1）酵母：釀酒酵母應(yīng)用廣泛。 （2）絲狀真菌 （3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞 （4）植物細(xì)胞,二）大腸桿菌中的基因表達(dá),1、載體 表達(dá)載體必須具備的條

10、件： （1）載體能夠獨(dú)立的復(fù)制 （2）具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記 （3）具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子 （4）具有阻遏子 （5）有很強(qiáng)的終止子 （6）有翻譯的起始信號(hào),常用的表達(dá)載體： （1）pBV220系統(tǒng) （2）pET系統(tǒng),2、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素 （1）外源基因的拷貝數(shù) （2）外源基因的表達(dá)效率 （3）表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 （4）細(xì)胞的代謝負(fù)荷 （5）工程菌的培養(yǎng)條件,啟動(dòng)子的強(qiáng)弱 核糖體結(jié)合位點(diǎn) SD序列和起始密碼子ATG的間距 密碼子組成,3、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式 （1）以融合蛋白的表達(dá)形式表達(dá)藥物基因 由一段短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)，稱為融合蛋白。 （

11、2）以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因 （3）分泌型表達(dá)蛋白藥物基因,1、載體 （1）載體的復(fù)制序列包括YEp類、YRp類、YRp類和YIp類。 （2）克隆載體由于從大腸桿菌中制備質(zhì)粒比從酵母中容易，所以酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行的。 （3）表達(dá)載體包括普通表達(dá)載體和精確表達(dá)載體,三）酵母中的基因表達(dá),2、影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素 （1）外源基因的拷貝數(shù) （2）外源基因的表達(dá)效率 （3）外源蛋白的糖基化 （4）宿主菌株的影響,表達(dá)用的酵母宿主菌應(yīng)具備： 菌體生長(zhǎng)力強(qiáng)。 菌體內(nèi)蛋白酶要較弱。 菌株性能穩(wěn)定。 分泌能力強(qiáng),主要與啟動(dòng)子、分泌信號(hào)和終止序列有關(guān),四）動(dòng)物細(xì)胞中的

12、基因表達(dá),中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO） 猴腎細(xì)胞（COS,CHO細(xì)胞屬成纖維細(xì)胞，該細(xì)胞缺乏二氫葉酸還原酶（DHFR），經(jīng)轉(zhuǎn)染可將DHFR重組至細(xì)胞中，含有DHFR表達(dá)載體的重組CHO細(xì)胞，經(jīng)氨甲喋呤（MTX）培養(yǎng)篩選后可選擇出克隆表達(dá)異源基因的重組細(xì)胞,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因的主要優(yōu)點(diǎn) 能識(shí)別和剪切外源基因中的內(nèi)含子并加工為成熟的mRNA,主要載體,SV40衍生載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 腺病毒載體（AV） 腺相關(guān)病毒載體（AVV） 痘苗病毒載體（VV,三、基因工程菌的穩(wěn)定性,基因工程菌在傳代過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，又分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。分裂不穩(wěn)定是指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)

13、粒子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變,質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法,1、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因,主要與兩個(gè)因素有關(guān)： 一是含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率； 二是這兩種菌的生長(zhǎng)比速率差異的大小,二階段培養(yǎng)法：第一階段先使菌體生長(zhǎng)至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達(dá),2、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法,第三節(jié) 基因工程藥物的生產(chǎn),一、基因工程藥物的生產(chǎn)特點(diǎn),是外源蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的異源表達(dá)，不同于微生物的天然次級(jí)代謝藥物，因此在調(diào)控合成方式上，應(yīng)該主要受限于質(zhì)?；蚴删w的內(nèi)在性質(zhì)； 是蛋白質(zhì)產(chǎn)物，不同于種類多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物； 合成途徑簡(jiǎn)單，沒(méi)有復(fù)雜的多酶系統(tǒng)；

14、產(chǎn)物的積累主要在胞內(nèi)，分泌型也主要積累在細(xì)胞周質(zhì)中； 產(chǎn)物在胞內(nèi)積累通常是以內(nèi)涵體的形式； 分離純化相對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物而言要簡(jiǎn)單、一致； 產(chǎn)物分離純化后可能沒(méi)有活性，需要進(jìn)一步的復(fù)性,基因工程藥物是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，具有潛在的危險(xiǎn)，因此對(duì)產(chǎn)生菌的管理要求嚴(yán)格，應(yīng)該避免各種可能的擴(kuò)散污染，必須在合格的GMP生產(chǎn)車間進(jìn)行。 基因工程藥物的GMP是對(duì)生產(chǎn)全過(guò)程的質(zhì)量管理，涉及人員、廠房、設(shè)備，原材料采購(gòu)入庫(kù)、檢驗(yàn)、發(fā)料、加工、制品及半成品檢驗(yàn)、分包裝，成品檢定，產(chǎn)品銷售、運(yùn)輸，用戶意見及使用反應(yīng)處理等在內(nèi)的全過(guò)程的質(zhì)量管理,二、基因工程菌發(fā)酵,基因工程菌的培養(yǎng)過(guò)程主要包括： （1）通過(guò)搖瓶操作了解工程菌生

15、長(zhǎng)的基礎(chǔ)條件，如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分以及碳氮比，分拆表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對(duì)受體細(xì)胞的影響； （2）通過(guò)培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案以及順序,1、基因工程菌的培養(yǎng)方式,常用的有：補(bǔ)料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、透析培養(yǎng)、固定化培養(yǎng),1）補(bǔ)料分批培養(yǎng) 將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長(zhǎng)的培養(yǎng)方式。 （2）連續(xù)培養(yǎng) 將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至一定濃度后，開動(dòng)進(jìn)料和出料的蠕動(dòng)泵，以控制一定稀釋率進(jìn)行不間斷的培養(yǎng)。 （3）透析培養(yǎng) 利用膜的半透性原理使代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基分離，通過(guò)去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來(lái)解除其生產(chǎn)菌的不利影響。 （4）固

16、定化培養(yǎng),2、基因工程菌的發(fā)酵工藝,基因工程菌的發(fā)酵工藝與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵工藝的區(qū)別： （1）生物材料方面 （2）生產(chǎn)目的方面,1）培養(yǎng)基的影響 常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解產(chǎn)物、玉米漿和氨水、硫酸銨、硝酸銨、氯化銨等。 另外還要加一些無(wú)機(jī)鹽、微量元素、維生素、生物素等。對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株還要補(bǔ)加相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),2）接種量的影響 接種量是指移入的種子液體和培養(yǎng)液體積的比例。 接種量小，不利于外源基因的表達(dá)，大接種量有利于對(duì)基質(zhì)的利用，縮短生長(zhǎng)延遲期，并使生產(chǎn)菌能迅速占領(lǐng)整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，減少污染機(jī)會(huì)，但接種量過(guò)高又會(huì)抑制后期菌體的生長(zhǎng)。所

17、以接種量大小取決于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵中的生長(zhǎng)繁殖速度,3）溫度的影響 溫度對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可發(fā)生在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或小分子調(diào)節(jié)分子的合成水平上。 在復(fù)制水平上，可通過(guò)調(diào)控復(fù)制，改變基因拷貝數(shù)，影響基因表達(dá)；在轉(zhuǎn)錄水平上，可通過(guò)影響RNA聚合酶的作用或修飾RNA聚合酶，來(lái)調(diào)控基因表達(dá)；溫度也可在mRNA講解和翻譯水平上影響基因表達(dá)，溫度還可能通過(guò)細(xì)胞內(nèi)小分子調(diào)節(jié)分子的量而影響基因表達(dá)，也可通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)ppGpp量調(diào)控一系列基因表。 溫度還影響蛋白質(zhì)的活性和包含體的形成,4）溶解氧的影響 溶解氧是工程菌發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中影響菌體代謝的一個(gè)重要參數(shù)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的生成影響很大。 外源基因的高效表

18、達(dá)和翻譯需要維持較高水平的DO2值。 通常采用調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速的方法，可以改善培養(yǎng)過(guò)程中的氧供給，提高活菌產(chǎn)量,5）誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響 一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)后期升溫誘導(dǎo)表達(dá),總之，工程菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化對(duì)異源蛋白的表達(dá)關(guān)系重大，必須建立最佳優(yōu)化工藝,6）pH的影響 pH對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和外源蛋白的高效表達(dá)都有影響，所以應(yīng)根據(jù)工程菌的生長(zhǎng)和代謝情況，對(duì)pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié),3、基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備,發(fā)酵罐的組成部分有： 發(fā)酵罐體 保證高傳質(zhì)作用的攪拌器 精細(xì)的溫度控制 滅菌系統(tǒng) 空氣無(wú)菌過(guò)濾裝置 殘留氣體處理裝置 參數(shù)測(cè)量與控制系統(tǒng) 培養(yǎng)液配置 連續(xù)操作裝置等,三、基因工程藥物的分離純化,許多醫(yī)藥生物

19、技術(shù)產(chǎn)品都是活性肽或蛋白質(zhì)。這些產(chǎn)品的制得具有下列特點(diǎn)： （1）目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低 （2）含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜，且影響較大 （3）目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差 （4）種類繁多 （5）應(yīng)用面廣，對(duì)其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無(wú)菌、無(wú)熱原等。 因此，為了獲得合格的目的產(chǎn)物，必須建立與上述特點(diǎn)相適應(yīng)的醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品的分離純化工藝,一）建立分離純化工藝的依據(jù),1、含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn)： （1）菌種類型及其代謝特性 （2）原材料和培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量 （3）生產(chǎn)工藝和條件 （4）初始物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性。 2、物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì) 3、目的產(chǎn)物特性 4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求,二）分離

20、純化的基本過(guò)程,分離純化是基因工程藥物生產(chǎn)中極其重要的一環(huán)。一般不應(yīng)超過(guò)45個(gè)步驟，包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工,三）分離純化的技術(shù),分離純化技術(shù)應(yīng)滿足下列要求： （1）技術(shù)條件要溫和 （2）選擇性要好 （3）收率要高 （4）兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接 （5）整個(gè)分離純化過(guò)程要快,1、細(xì)胞破碎與固液分離,1）細(xì)胞收集：細(xì)胞收集常用的是離心分離的方法，膜過(guò)濾法液逐步得到廣泛應(yīng)用。 （2）細(xì)胞破碎：有機(jī)械破碎法和非機(jī)械破碎法。 機(jī)械破碎法：高壓勻漿法、超聲破碎法、高速珠磨法、高壓擠壓法 非機(jī)械破碎法：酶溶法、化學(xué)滲透法、熱處理法、滲透壓沖擊法等。 （3）固

21、液分離：離心沉淀是固液分離的主要手段，包括高速離心和超速離心。常用的膜過(guò)濾技術(shù)有微濾、超濾和反滲透等,2、目的產(chǎn)物的分離純化,主要依賴色譜分離方法。色譜技術(shù)分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠色譜、高壓液相色譜等。 蛋白質(zhì)純化方法的設(shè)計(jì)通常根據(jù)產(chǎn)物分子的物理、化學(xué)參數(shù)和生物學(xué)特性。 選擇純化方法應(yīng)根據(jù)目的蛋白質(zhì)和雜蛋白的物理、化學(xué)和生物學(xué)方面性質(zhì)的差異，尤其重要的是表面性質(zhì)的差異,1）離子交換色譜 （ion exchange chromatography,IEC） 基本原理是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離的目的。 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和表面電荷的分

22、布主要影響其離子交換的性能，影響蛋白質(zhì)離子交換色譜保留的其他因素，還有交換基團(tuán)和交換介質(zhì)的種類、吸附和洗脫的條件等,2）反相色譜（reversed phase chromatography,RPC）和疏水色譜（hydrophobic interaction chromatography,HIC） 反相色譜和疏水色譜是根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性的差異來(lái)分離純化的,3）親和色譜 （ affinity chromatography,AC） 親和色譜是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附的 。 親和色譜的過(guò)程大致分為3步： 配基固定化; 吸附目的產(chǎn)物； 樣品解吸,4）凝膠過(guò)濾色譜 凝膠過(guò)濾是以

23、具有空隙大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，利用這種移動(dòng)差別可使大分子與小分子分開,3、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除,非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)不應(yīng)忽視，在純化過(guò)程中，需特別注意3種可能存在的非蛋白類雜質(zhì)，它們是DNA、熱原質(zhì)和病毒,四）選擇分離純化方法的依據(jù),1、根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇 2、根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 3、根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇,四、基因工程藥物的質(zhì)量控制,1、原材料的質(zhì)量控制 原材料的質(zhì)量控制是要確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來(lái)自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性,2、培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制,在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定； 在培養(yǎng)過(guò)程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無(wú)突變； 在重復(fù)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染,3、純化工藝過(guò)程的質(zhì)量控制,產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致；外源性蛋白質(zhì)、DNA與熱原都控制在規(guī)定限度下,4、目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制,基因工程藥物質(zhì)量控制主要包括以下幾項(xiàng)要求：產(chǎn)品