多重鏈接探針擴(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)步驟與應(yīng)用

1、多重鏈接探針擴(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)步驟與應(yīng)用多重鏈接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）最早是由荷蘭的Schouten博士于2002年發(fā)明的，是一種高通量、針對(duì)待測(cè)核酸中靶序列進(jìn)行檢測(cè)和分析的新技術(shù)1.該技術(shù)僅需20 ng/μL模板DNA或RNA,即可通過(guò)簡(jiǎn)單的探針雜交、連接及PCR擴(kuò)增和電泳步驟，在同一反應(yīng)管中對(duì)多達(dá)50個(gè)不同的靶基因進(jìn)行檢測(cè)和分析。該技術(shù)經(jīng)過(guò)短短幾年的發(fā)展，目前已經(jīng)在遺傳疾病、基因甲基化分析等多個(gè)領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用2-3.1MLPA的原理MLPA技術(shù)是將核酸的雜交檢測(cè)和PCR鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合

2、，從而實(shí)現(xiàn)多對(duì)靶分子的高效特異性分析。其核心技術(shù)是設(shè)計(jì)與目的靶序列高度特異性的長(zhǎng)探針和短探針，發(fā)生MLPA反應(yīng)時(shí)，這兩段探針首先分別與模板序列雜交，之后通過(guò)連接酶將兩段探針進(jìn)行連接。連接反應(yīng)高度特異，只有當(dāng)兩個(gè)探針與靶序列完全雜交，即靶序列與探針特異性序列完全互補(bǔ)，連接酶才能將兩段探針連接成一條完整的核酸單鏈；反之，如果靶序列與探針序列不完全互補(bǔ)，即使只有一個(gè)堿基的差別，就會(huì)導(dǎo)致雜交不完全，使連接反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。長(zhǎng)探針和短探針發(fā)生連接后，生成一條兩端分別含有上下游通用PCR引物的全長(zhǎng)探針，并在通用引物的擴(kuò)增之下，使模板成鏈?zhǔn)椒糯?，最后生成的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)管電泳分離，再經(jīng)軟件分析1.2ML

3、PA反應(yīng)步驟2.1 探針與靶序列雜交在MLPA反應(yīng)中，一個(gè)目標(biāo)序列需要設(shè)計(jì)一對(duì)探針，包括長(zhǎng)探針和短探針，短探針由兩段核苷酸組成，包括位于5‘端的PCR通用正向引物序列和位于3’端的模板特異性序列；長(zhǎng)探針由三段核苷酸組成，包括位于5‘端的模板特異性序列和3’端的通用反向引物序列外，在兩者之間還添加了大小不等的填充序列（指紋序列），填充序列不是必須的，主要是用于區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物的大小。MLPA反應(yīng)時(shí)，首先將雙鏈DNA在98變性裂解，裂解為單鏈DNA,溫度降為60時(shí)長(zhǎng)短探針分別與單鏈DNA過(guò)夜雜交1-3.2.2 探針的特異性連接調(diào)節(jié)溫度降為54，加入連接酶

4、。如果被檢核酸中含有靶序列，則長(zhǎng)短探針可均與模板序列互補(bǔ)良好，連接反應(yīng)可以進(jìn)行，長(zhǎng)短探針可以連接為一條完整的核酸單鏈。若其中一條探針的序列與被檢靶基因序列不完全互補(bǔ)，即使只有一個(gè)堿基不互補(bǔ)，也會(huì)使雜交不完全而使連接反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。這種連接是高度特異性的，保障了MLPA的高特異性優(yōu)勢(shì)1-4.2.3PCR擴(kuò)增MLPA擴(kuò)增的并不是被檢樣本核酸，而是上述連接生成的與靶序列結(jié)合的完整核酸探針，只要有一條完整的核酸單鏈生成了，PCR擴(kuò)增反應(yīng)即可進(jìn)行，這保證了MLPA技術(shù)的高靈敏性。連接反應(yīng)完成后，每一條完整的核酸單鏈5‘端都帶有通用PCR正向引物，3’端都帶有通用PCR反向引物。由于

5、事先給每種被檢基因的長(zhǎng)探針加入了特定大小的指紋序列，每對(duì)探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度都是唯一的，在通用引物的擴(kuò)增下，這些大小不同的擴(kuò)增片段被同時(shí)擴(kuò)增了出來(lái)，一般相鄰兩產(chǎn)物的長(zhǎng)度差可以在10 bp之間，這樣可以同時(shí)檢測(cè)的基因數(shù)可高達(dá)50種不同靶基因1-4.2.4 毛細(xì)管電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可用瓊脂糖凝膠電泳分離分析，也可通過(guò)毛細(xì)管電泳等進(jìn)行分離分析。但一般情況下由于多重?cái)U(kuò)增的不同片段之間相差較小，而且，擴(kuò)增片段大小多集中于90150之間效果較好，普通瓊脂糖凝膠電泳無(wú)法分離，建議使用毛細(xì)管電泳，再用相關(guān)軟件分析電泳結(jié)果2,4.3MLPA的優(yōu)缺點(diǎn)MLPA作為一種新型檢測(cè)技術(shù)，具有如下優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，所

6、需樣本量小，最少僅需20 ngDNA即可完成檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)3 0006 000個(gè)靶分子；2.多重分析，可同時(shí)檢測(cè)多達(dá)50檢測(cè)靶基因；3.特異性強(qiáng)，檢測(cè)精準(zhǔn)度高，可以區(qū)分單個(gè)核苷酸不同，保證了檢測(cè)的特異性；4.高通量，一個(gè)反應(yīng)可以同時(shí)檢測(cè)多種病原，有利于疫病的及時(shí)確診；5.自動(dòng)化程度高，在PCR結(jié)束之后直接可用毛細(xì)管電泳分析結(jié)果，操作易于標(biāo)準(zhǔn)化；6.一次檢測(cè)可完成96個(gè)樣品的檢測(cè)1-2.MLPA技術(shù)盡管有諸多優(yōu)點(diǎn)，但其畢竟是一種新技術(shù)，局限性特別是應(yīng)用方面的局限性是難免的：1.目前普及程度不高，試劑比較昂貴；2.探針設(shè)計(jì)比較困難耗時(shí)，不過(guò)一旦前期設(shè)計(jì)完成，后期的高通量檢測(cè)工作即容易進(jìn)行；3.由

7、于需核酸雜交，操作比較繁瑣而且費(fèi)時(shí)；4.應(yīng)用受限制，目前更多的應(yīng)用還是基因突變和甲基化檢測(cè)，在其他領(lǐng)域進(jìn)展緩慢。4MLPA的應(yīng)用4.1 用于檢測(cè)人類基因或基因片段的缺失或重復(fù)人類很多遺傳性疾病都跟基因缺失或突變有關(guān)，因此MLPA多年來(lái)在基因遺傳性疾病的研究及臨床監(jiān)測(cè)中發(fā)揮了巨大應(yīng)用。如MLPA技術(shù)已用于遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌的鑒別以及卵巢癌和乳腺癌患者的預(yù)后等，也可用于多種遺傳病的基因定量研究，如苯丙酮尿癥，杰格斯綜合征及多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤等5.4.2 用于檢測(cè)由染色體異常引發(fā)的疾病染色體重排常引發(fā)智力發(fā)育遲緩及其他多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。MLPA可以檢測(cè)出染色體重排或微小重排。已有多家實(shí)驗(yàn)室對(duì)MLP

8、A技術(shù)在檢測(cè)精神發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用進(jìn)行研究，已報(bào)道的有Williams綜合征、Sotos綜合征及Axenfeld-Rieger綜合征等3.MLPA可以識(shí)別單個(gè)核苷酸的差異，因此可用于單核苷酸多態(tài)性和各種點(diǎn)突變的檢測(cè)。MLPA技術(shù)也可以檢測(cè)染色體數(shù)目的異常，如唐氏綜合征等。4.3MLPA在腫瘤檢測(cè)方面的應(yīng)用大約30%的人類腫瘤基因組中存在DNA拷貝數(shù)異常，其中DNA拷貝數(shù)增加是癌基因激活的重要方式。由于MLPA技術(shù)可檢測(cè)出DNA拷貝數(shù)量的異常，因此已被應(yīng)用于多種腫瘤的檢測(cè)中。2003年，Eldering等6在MLPA技術(shù)基礎(chǔ)上建立了逆轉(zhuǎn)錄-MLPA（RT-MLPA），該技術(shù)改進(jìn)能夠發(fā)現(xiàn)m

9、 RNA低拷貝數(shù)變異。此外，細(xì)胞全基因組水平的低甲基化和局部區(qū)域關(guān)鍵基因的高甲基化也是腫瘤的基本特征，且其甲基化狀態(tài)的改變往往出現(xiàn)于細(xì)胞惡性增生早期，并隨惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展而變化。因此，檢測(cè)細(xì)胞甲基化狀態(tài)對(duì)腫瘤的預(yù)防、治療及觀察預(yù)后都有極其重大的意義。甲基化特異性MLPA（methylation-specific MLPA,MS-MLPA）是一種由MLPA技術(shù)部分改進(jìn)而成的可檢測(cè)基因甲基化情況的新技術(shù)1,7,可以實(shí)現(xiàn)此目的。4.4 用于傳染病的高通量檢測(cè)MLPA被報(bào)道以來(lái)主要用于基因遺傳病的檢測(cè)，近些年逐漸發(fā)展到傳染病高通量檢測(cè)，表現(xiàn)出了良好的發(fā)展勢(shì)頭。Martin等人建立了可以同時(shí)檢測(cè)15

10、種呼吸道病毒的MLPA方法，敏感性與單個(gè)熒光PCR相當(dāng)，但檢測(cè)通量大大提高了8.Muvunyi等建立了MLPA同步檢測(cè)7種性傳播疾病，結(jié)果用單重?zé)晒釶CR驗(yàn)證，符合性達(dá)到100%9.Lina等利用MLPA技術(shù)，建立了可以同時(shí)檢測(cè)10種蜜蜂病毒的高通量篩選技術(shù)，取得了較好效果10.國(guó)內(nèi)史喜菊等人前期研究建立了五種豬病MLPA同步檢測(cè)技術(shù)2,在此基礎(chǔ)上，又建立了五種牛病MLPA同步檢測(cè)技術(shù)4,后期這兩種檢測(cè)技術(shù)可以完全融合，實(shí)現(xiàn)10種動(dòng)物疫病的MLPA同步檢測(cè)平臺(tái)，而且該平臺(tái)是開放式的，后期可以隨時(shí)加入更多的病原菌。Ehlert等利用了MLPA技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)10種食品過(guò)敏原的高通量技術(shù)11.這

11、些研究都表明，MLPA技術(shù)為疫病的多重檢測(cè)提供了一種全新的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，可用于國(guó)內(nèi)動(dòng)物疫病疫情的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和普查以及相關(guān)病原疫苗、檢測(cè)試劑病原純度的檢測(cè)，也可用于動(dòng)物源性食品相關(guān)病原的檢測(cè)。參考文獻(xiàn)：1SchoutenJP,Mc ElgunnCJ,WaaijerR,etal.Relativequantificationof40nucleicacidsequencesbymultiplexliga-tion-dependent probe amplificationJ.Nucleic Acids Research,2002,30（12）：1-13.2史喜菊，馬貴平，喬彩霞，等。多重鏈接探針擴(kuò)增技

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