氨基酸含量的測定及分離鑒定

1、實(shí)驗(yàn)七 氨基酸的分離鑒定,紙層析法,一 目的 通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法 二 原理 紙層析法是利用各物質(zhì)不同的分配系數(shù)，使混合物隨流動(dòng)相時(shí)而得 到分離的方法。 紙層析法是以濾紙作為惰性支持物的。濾紙纖維與水親和力較強(qiáng)，而與有機(jī)溶劑親和力弱，所以紙層析以濾紙纖維和結(jié)合水為固定相，以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。當(dāng)有機(jī)相沿濾紙流動(dòng)經(jīng)過樣品點(diǎn)時(shí)，樣品點(diǎn)上的溶液在水相和有機(jī)相之間進(jìn)行分配，樣品移動(dòng)速率與樣品的極性及水親和力有關(guān)，因此，極性氨基酸移動(dòng)較慢，而非極性氨基酸移動(dòng)較快。 物質(zhì)被分離后在紙層析圖上的位置用Rf值表示 Rf=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿距離 在一定條件下某種物

2、質(zhì)的Rf值是常數(shù),溶液前沿層析點(diǎn) 原點(diǎn),溶劑前沿 苯丙氨酸 丙氨酸 天冬氨酸,器材 1 層析缸 2 毛細(xì)管 3 噴霧器 4 培養(yǎng)皿 5 層析濾紙,操作步驟 1 取層析濾紙一張，在紙的一端距邊緣2-3處用鉛筆劃一條直 線，在直線上約每隔3-4做一次記號(hào)，共記四次。 2 用毛細(xì)管將各種氨基酸樣品分別點(diǎn)在4個(gè)記號(hào)點(diǎn)上，干后再點(diǎn) 一次。盡量點(diǎn)成圓形，并在各點(diǎn)表上樣品名。 3 手通過紙將濾紙卷成圓筒形，并用針縫，共3針。每縫一針打 個(gè)結(jié)，第三針的線留長一點(diǎn)。 4 將縫好的紙（裝入）垂直放入裝有擴(kuò)展劑的層析缸內(nèi)（點(diǎn)樣的 一端朝下，濾紙不應(yīng)碰到缸壁） 5 約2個(gè)小時(shí)后，將濾紙取出，拆掉線后，放入烘干機(jī)內(nèi)烘干

3、，約10分 鐘后取出即顯色。 6 畫出溶液前沿線，確立個(gè)層析點(diǎn)中心，計(jì)算各氨基酸的Rf值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果:,原點(diǎn)到溶劑前沿距離為L，原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心距離為d,氨基酸的定量分析 甲醛滴定法,一、目的： 初步掌握甲醛滴定法測定氨基酸含量的原理和操作要點(diǎn),水溶液中的氨基酸為兼性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。甲醛可與氨基酸上的N+H3結(jié)合，形成NHCH2OH、N(CH2OH)2 等羥甲基衍生物，使N+H3上的H+游離出來，這樣就可以用堿滴定N+H3放出H+，測出氨基氮，從而計(jì)算氨基酸的含量。,二、實(shí)驗(yàn)原理,若樣品中只含有單一的已知氨基酸，則可由此法滴定的結(jié)果算出氨基酸的含量。若樣品中含有多種氨基酸

4、（如蛋白質(zhì)水解液），測不能由此法算出氨基酸的含量。 脯氨酸與甲醛作用后，生成的化合物不穩(wěn)定，導(dǎo)致滴定后結(jié)果偏低；酪氨酸含酚基結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致滴定結(jié)果偏高。,三、材料、試劑與器具,（一）試劑 1、0.5%酚酞酒精溶液 稱0.5g酚酞溶于100ml50%酒精中。 2、0.1mol/L甘氨酸溶液 取3.75g甘氨酸溶于500ml蒸餾水。 3、標(biāo)準(zhǔn)0.0200mol/L 氫氧化鈉溶液 4、中性甲醛溶液 取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示劑約3ml，滴加0.01mol/LNaOH溶液， 使溶液呈微紅色，臨用前中和。 （二）實(shí)驗(yàn)器具 錐形瓶 、堿式滴定管、移液管洗耳球、天平 容量瓶、試劑瓶、量筒、玻棒與燒杯

5、,四、操作步驟,1、取5只50ml錐形瓶，按下表加入試劑。,2、用0.0200mol/L NaOH溶液滴定至溶液變微紅色 注意：滴定管中溶液的初始位置和滴定結(jié)束時(shí)的位置； 滴定管的使用方法,3、用0.0200mol/L NaOH溶液滴定至溶液變微紅色,4、記錄每次滴定所用的0.0200mol/L NaOH溶液的 體積,五、計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸氨基氮的回收率=,VNaoH*0.0200mol/L,理論計(jì)算值,*14.008,理論計(jì)算值:取用氨基酸的體積乘以濃度,再乘以14.008,VNaoH 兩次測定所用氨基酸的體積的平均值,每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克數(shù)為 式中：V1為滴定樣品消耗氫氧化鈉的體積（ml）； V2為滴空白消耗氫氧化鈉的體積（ml）； MNaOH 標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的摩爾濃度,1、甲醛法測定氨基酸含