補腎陰對胚胎干細胞活動的影響

1、DOC格式論文，方便您的復制修改刪減補腎陰對胚胎干細胞活動的影響（作者：單位：郵編：）作者：安紅梅,胡兵,史云峰,許麗雯,史秀峰，陳方敏,顧耘, 潘露茜,王志【摘要】目的 觀察補腎陰中藥復方對胚胎干細胞活動的影響。方法選用胚胎干細胞模型 CRL-1825細胞株，加入補腎陰中藥復方大鼠含 藥血清,觀察補腎陰中藥對干細胞分化、凋亡、細胞周期及其關鍵基 因表達的影響。結果 補腎陰中藥復方含藥血清可以抑制干細胞的分 化和凋亡，促進干細胞增殖以及細胞周期的進程，促進干細胞Wnt、 Oct4等基因的表達，下調P16INK4a基因的表達。結論 補腎陰中藥復 方可以促進干細胞增殖、維持其不分化狀態(tài)?！娟P鍵詞】

2、 補腎陰；中藥；胚胎干細胞Abstract : Objective To study the effects of tonifyingkidney-yin on activities of embryo stem cell.Methods Embryonicstem cell li ne CRL-1825 was choosed as model cell in prese nt study, and tonifying kidney-yin herb serum was added to CRL-1825 cell. The in flue nce of tonifying kid ney-

3、yin on stem cell differe ntiatio n, cell cycle, apotosis and express of keygenes were observed. Results Tonifying kidney-yin can inhibit stem celldifferentiationand apotosis, promote stem cellproliferation and progression of cell cycle. In addition, tonifyingkid ney-yin can up-regulate Wnt, Oct4 gen

4、e expressi on,anddow n-regulati onP16INK4a expressi on. Con clusi onsTonifying kid ney-yin can promote stem cell proliferati on and maintain the state of stem cell.Key words: Tonifying the kidney-yin ; Chiese herb; embryo stem cell腎在中醫(yī)學中具有極為重要的地位，腎為先天之本，腎主藏 精,其精氣促進人體的生長、發(fā)育和生殖，是人體生命活動的原動力。 筆者從中醫(yī)腎的角度理

5、解胚胎干細胞，觀察了補腎陰對胚胎干細胞增 殖、分化、凋亡等基本生命活動的影響，以及補腎陰對胚胎干細胞功 能關鍵決定基因 Wnt、Oct4、P16INK4a基因表達的影響。1實驗材料1.1細胞株與試劑小鼠胚胎干細胞CRL-1825細胞購自 ATCC (American TypeCultureCollection)； ATRA(all trans-retinoicacid)購自Panomics 公司；DMS購自 Sigma公司；a -MEM培養(yǎng)基購自 Hyclone 公司；DeadEndTM Fluorometric TUNEL System 購自 Promega公司； CCK8(Cell Cou

6、nting Kit-8)試劑購自Dojindo 公司。其余為國產試 劑。1.2儀器培養(yǎng)箱：NUAIKE流式細胞儀：BD FACSCalibur;倒置顯微鏡、 免疫熒光顯微鏡：Olympus ；酶標儀：Bio-Rad ； PCF儀：MJResearch Inc ;凝膠成像系統(tǒng)：復日科技。2實驗方法2.1左歸丸處方組成及藥物制備熟地黃24 g,山藥12 g,枸杞子12 g,山茱萸12 g,川牛膝9 g,菟絲子12 g,鹿角膠12 g,龜板膠12 g（按景岳全書新方八陣補 陣中的配伍比例確定劑量）。以補腎中藥氣味并重的要求，上述藥物 除鹿角膠、龜板膠外，余藥加8倍量水,煎煮2次,第1次2 h,第2次

7、 1 h,過濾,合并濾液。鹿角膠、龜板膠用適量水加熱溶化，加入濾液,混勻，濾液濃縮至相對密度1.20（80 C ）,4 C保存?zhèn)溆?。由龍華醫(yī)院 中藥制劑室提供。2.2含藥血清的制備選健康 Wistar大鼠32只，雄性,SPF級，體重180200 g,來源上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心。大鼠分為左歸丸組 （小、中、大 劑量組）、生理鹽水組,每組8只,分別按人鼠藥物換算等效劑量的1、2、4倍喂飼大鼠左歸丸，生理鹽水組灌服等體積生理鹽水，每天2次, 連續(xù)3 d（灌藥前禁食不禁水12 h）。末次給藥后1 h腹主動脈采血,5 000 r/min離心分離并收集含藥血清,56 C常規(guī)滅活30 min,0.2卩m

8、 濾膜過濾除菌，密封后于-20 C冰箱保存?zhèn)溆谩?.3細胞培養(yǎng)與分化觀察CRL-1825細胞常規(guī)培養(yǎng),12 d換培養(yǎng)基1次,23 d傳代一次， 傳代時常規(guī)倒置顯微鏡觀察并記錄培養(yǎng)細胞形態(tài)。細胞分化實驗中加 入10%卜腎陰中藥復方大鼠含藥血清（左歸丸大、中、小劑量組）以及 等體積空白血清（生理鹽水組），作用3 d后每組加入1% DMSC或1 nmol/L ATRA作用14 h,各組細胞進行光鏡拍照。根據分化實驗及預 實驗結果確定實驗采用10%卜腎陰中藥復方大鼠含藥血清中劑量組。2.4細胞增殖檢測細胞增殖采用CCK8方法進行。常規(guī)消化細胞，以2X103的密度 接種細胞于96孔板,每組設3個復孔；接

9、種后第2天加入10%含藥血 清以及等體積空白對照血清，并自接種后第2天開始每天取9孔加入 CCK8式齊I10卩L,37 C反應2 h后,450 nm波長測上清光密度。2.5細胞凋亡觀測常規(guī)消化細胞，以1X 105/盤的密度接種細胞于3.5 cm培養(yǎng)皿，第2 天加入10%含藥血清以及等體積空白對照血清，作用3 d后加入400 卩mol（終濃度）H2O2,作用14 h后取細胞檢測凋亡。細胞凋亡采用 TUNEL（TdT-meidated dUTP Nick-End Labling） 法檢測,操作按 Promega公司說明書進行。2.6細胞周期的觀測常規(guī)消化傳代細胞，加入10%含藥血清以及等體積空白對

10、照血清 作用,3 d后細胞消化離心，調整濃度1X 106/mL以上,70%酒精（終濃 度）固定,PI（碘化吡啶）染色用于流式細胞儀檢測細胞周期變化及增 殖特性。2.7基因表達采用RT-PCF法檢測基因表達，總RNA在逆轉錄酶的作用下逆轉錄成cDNA再以cDNA為模板進行PCRT增，反應條件為：94 C變性30s,55 C退火30 s,72 C延伸30 s,PCR產物在1%勺agarose膠中電 泳。反應中所用引物為，Oct3/4 : 5 - ATTCAGCCAAACGACCAT,-3 -CCCTGAGAAAGGAGACCC16INK4a 5 -CCCTTGCCTGGAAAGAA-3 -AACT

11、ATTCGGTGCGTTG；Wit: 5 -TGGCTGGGTTTCTGCTC53 -CTCGGTTGACGATCTTC-33結果3.1補腎陰對胚胎干細胞分化的影響（見圖1）結果顯示,CRL-1825細胞可在DMS作用下分化，細胞呈現出菱形 或梭形,喪失干細胞特有的形態(tài)以及克隆生長特性；在補腎陰中藥的 聯(lián)合作用下，細胞部分分化，有部分細胞尚維持干細胞的形態(tài)，并有部 分細胞仍呈克隆生長，提示補腎陰可以阻滯干細胞的分化。3.2補腎陰對胚胎干細胞增殖的影響（見表1、圖2）表1補腎陰對胚胎干細胞周期的影響（略）注：與 空白血清組以及空白組比較，*P0.05。3.3補腎陰對胚胎干細胞凋亡的影響本研究采用

12、H2O2誘導細胞凋亡，觀察補腎陰對細胞凋亡的 影響。結果顯示，補腎陰可抑制H2O2誘導的細胞凋亡，與對照組比較 差異顯著。3.4補腎陰對胚胎干細胞基因表達的影響在CRL-1825細胞培養(yǎng)基中加入10%含藥血清以及等體積空白對 照血清，提取細胞總RNA,RT-PCR僉測補腎陰對干細胞基因表達的影 響。結果顯示，補腎陰可以促進干細胞 Wn、Oct4等基因的表達，下調 P16INK4a基因的表達(見圖3)。4討論本研究采用的CRL-1825細胞株來源于小鼠畸胎瘤，具有胚胎干 細胞的基本特性。實驗結果提示，補腎陰可以促進干細胞增殖，促進胚 胎干細胞周期的進程，抑制細胞凋亡，同時可以維持胚胎干細胞不分

13、化的狀態(tài)，從而在實驗體系中驗證了胚胎干細胞與中醫(yī)腎為先天之 本、腎主藏精理論的聯(lián)系。本實驗研究結果還顯示，補腎陰可以促進干細胞 Wnt、Oct4基因 的表達，下調P16INK4a基因的表達。Wnt是 Wnt/beta- catenin 信號 通路的重要蛋白，其在Presenilin 酶以及frizzled 等配體的作用下 進而激活beta-catenin,beta- catenin 入核與TCF等轉錄因子協(xié)同 作用調控靶基因的轉錄 ，在維持干細胞狀態(tài)方面起著重要的作用 1-2 ; Oct4位于6p21.31,含360個氨基酸，同樣是一個轉錄因子， 其與ATTTGCA特異序列結合介導靶基因的轉錄

14、調控，與細胞核移植 后的核再程化(nuclear reprogramming) 相關，主要表達于胚胎干細 胞,可作為胚胎干細胞的表型標志，并在干細胞增殖以及干細胞狀態(tài) 維持方面起著重要的作用3-5。P16INK4a是一個抑癌基因，是細胞 周期激酶CDK4的抑制劑，通過調節(jié)CDK及P53的活性而促進細胞 周期的進程，在G1期調控點起著重要的作用6-8。結果發(fā)現，補腎陰 能促進胚胎干細胞增殖，促進細胞周期，以及維持干細胞不分化的狀 態(tài)，因此，有理由認為這與補腎陰上調 Wnt、Oct4以及下調P16INK4a 基因表達相關?！緟⒖嘉墨I】1 KleberM, Sommer L. Wnt signali

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