酶工程復(fù)習(xí)大綱答案詳解

1、酶工程復(fù)習(xí)大綱試題題型： 名詞解釋，判斷題，選擇題，簡(jiǎn)答題，論述題，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)題。第一章 酶工程基礎(chǔ)、名詞解釋：酶： 指生物體產(chǎn)生的具有催化活性的生物大分子。酶工程： 由酶學(xué)與化學(xué)工程技術(shù)、 基因工程技術(shù)、 微生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新技術(shù)， 是工業(yè)上有目的地設(shè)計(jì)一定的反應(yīng)器和反應(yīng)條件， 利用酶的催化功能， 在常溫常壓下催化化 學(xué)反應(yīng)，生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品或服務(wù)于其它目的地一門應(yīng)用技術(shù)。即每摩爾酶單位時(shí)間催轉(zhuǎn)換數(shù) ：酶使底物每分鐘變化的分子數(shù)。 催化周期： 單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子將底物分子轉(zhuǎn)換成產(chǎn)物的最大值， 化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的摩爾數(shù)。酶活力： 也稱為酶活性， 是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力。其大小

2、可用在一定條件下，酶催 化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示，酶催化反應(yīng)速度愈大，酶活力愈高。比活力：指在特定條件下，單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)或RNA所擁有的酶活力單位數(shù)。酶活國際單位IU: 1961年國際酶學(xué)會(huì)議規(guī)定：在特定條件 （25 C,其它為最適條件）下，每 分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 口 mol底物或催化1 口 mol產(chǎn)物形成所需要的酶量為 1個(gè)酶活力單位，即為國 際單位（ IU）。催量 kat ： 每秒鐘轉(zhuǎn)化 1 摩爾底物（被反應(yīng)物）所需的酶活力為 1 個(gè) katal , 簡(jiǎn)稱 kat 、問答題1、酶催化的特點(diǎn)有哪些？高效性： 酶的催化效率比無機(jī)催化劑更高 , 使得反應(yīng)速率更快； 專一性： 一種酶只能催化一種或

3、一類底物 , 如蛋白酶只能催化蛋白質(zhì)水解成多肽、二肽酶可 催化各種氨基酸脫水縮合形成的二肽；溫和性： 是指酶所催化的化學(xué)反應(yīng)一般是在較溫和的條件下進(jìn)行的 .活性可調(diào)節(jié)性 ：包括抑制劑和激活劑調(diào)節(jié)、反饋抑制調(diào)節(jié)、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)和變構(gòu)調(diào)節(jié)等 . 有些酶的催化性與輔因子有關(guān) .易變性： 由于大多數(shù)酶是蛋白質(zhì) , 因而會(huì)被高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等破壞2、影響酶催化作用的因素有哪些？O溫度：酶促反應(yīng)在一定溫度范圍內(nèi)反應(yīng)速度隨溫度的升高而加快；但當(dāng)溫度升高到 一定限度時(shí)，酶促反應(yīng)速度不僅不再加快反而隨著溫度的升高而下降。在一定條件下，每 一種酶在某一定溫度時(shí)活力最大，這個(gè)溫度稱為這種酶的最適溫度。酸堿度：每一種酶

4、只能在一定限度的 pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)活性，超過這個(gè)范圍酶就會(huì)失 去活性。酶濃度：在底物足夠，其它條件固定的條件下，反應(yīng)系統(tǒng)中不含有抑制酶活性的物 質(zhì)及其它不利于酶發(fā)揮作用的因素時(shí)，酶促反應(yīng)的速度與酶濃度成正比。3底物濃度：在底物濃度較低時(shí)，反應(yīng)速度隨底物濃度增加而加快，反應(yīng)速度與底物 濃度近乎：成正比，在底物濃度較高時(shí)，底物濃度增加，反應(yīng)速度也隨之加快，但不顯著； 當(dāng)?shù)孜餄舛群艽笄疫_(dá)到一定限度時(shí)，反應(yīng)速度就達(dá)到一個(gè)最大值，此時(shí)即使再增加底物濃 度，反應(yīng)也幾乎不再改變。35 抑制劑： 能特異性的抑制酶活性 , 從而抑制酶促反應(yīng)的物質(zhì)稱為抑制劑。36 激活劑： 能使酶從無活性到有活性或使酶活性提高的

5、物質(zhì)稱為酶的激活劑。3、試述米氏方程和米氏常數(shù) Km的意義。米氏方程就是表示在酶促反應(yīng)中底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系式 V=（Vmax*S）/（Km+S）;其中V是反應(yīng)速率Km即米氏常數(shù) Vmax是酶反應(yīng)最大速率S是底物 濃度；米氏方程表示一個(gè)酶促反應(yīng)的起始速度（v）與底物濃度（S）關(guān)系的速度方程。其意義為：方程反映了反應(yīng)性質(zhì)、反應(yīng)條件、反應(yīng)速度之間的關(guān)系； 反映了反映速度與底物濃度之間的關(guān)系，當(dāng)S遠(yuǎn)大于Km時(shí)，反應(yīng)速度與底物濃度無關(guān)； 反映了酶反應(yīng)速度與酶濃度的關(guān)系，當(dāng)S遠(yuǎn)大于Km時(shí),v=k2E 0為線性關(guān)系，酶活正比于酶濃度。4、測(cè)定酶活力時(shí)終止酶活力的方法有哪些？SDS化學(xué)法、放射性化學(xué)法、

6、酶偶聯(lián)法 等終止法是在恒溫系統(tǒng)中進(jìn)行酶促反應(yīng)，間隔一段時(shí)間后，終止酶反應(yīng)，然后測(cè)定反應(yīng)物的 消耗量或產(chǎn)物的生成量，從而計(jì)算出酶的活性?？梢约訜嶙冃浴?qiáng)酸、強(qiáng)堿、三氯乙酸、 乙醇等使酶失活或終止反應(yīng)。催化反應(yīng)的底物或產(chǎn)物可用 方法進(jìn)行測(cè)定。5、如何繪制雙倒數(shù)曲線（L-B作圖法）？1/s）的作圖。X和Y軸上的截距一個(gè)酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/v ）對(duì)底物濃度的倒數(shù)（ 分別代表米氏常數(shù)（Km和最大反應(yīng)速度（VmaX的倒數(shù)1秒第二章酶的發(fā)酵工程一、名詞解釋微生物細(xì)胞內(nèi)的酶可分為組成酶和誘導(dǎo)酶組成組成酶：根據(jù)酶的合成方式和存在時(shí)間 酶是細(xì)胞內(nèi)一直存在的酶，它的合成僅受遺傳物質(zhì)控制即受內(nèi)因控制。誘導(dǎo)酶是誘導(dǎo)

7、酶：根據(jù)酶合成的方式，微生物細(xì)胞內(nèi)的酶可以分為誘導(dǎo)酶和組成酶兩類。 在環(huán)境中有誘導(dǎo)物（通常是酶的底物）存在的情況下，由誘導(dǎo)物誘導(dǎo)而生成的酶。協(xié)同誘導(dǎo)：加入一種誘導(dǎo)劑后微生物能同時(shí)或幾乎同時(shí)合成幾種酶，它主要存在于較短的 代謝途徑中，合成這些酶的基因由 同一個(gè)操縱子 控制。順序誘導(dǎo)：指第一種酶的底物會(huì)誘導(dǎo)第一種酶的合成，而第一種酶的產(chǎn)物又可誘導(dǎo)第二種 酶的合成，依此類推合成一系列的酶。先后誘導(dǎo)合成分解底物的酶和分解其后各中間代謝產(chǎn)物 的酶.終產(chǎn)物阻遏：催化某一特異產(chǎn)物合成的酶，在培養(yǎng)基中有該產(chǎn)物存在的情況下常常是不合 成的，即受阻遏的。分解代謝物阻遏：大腸桿菌在含有能分解的兩種底物（如葡萄糖和乳

8、糖）的培養(yǎng)基中生長 時(shí)，首先分解利用其中的一種底物（葡萄糖），而不分解另一種底物（乳糖），這是因?yàn)槠咸烟堑姆纸獯x產(chǎn)物阻遏了分解利用乳糖的有關(guān)酶合成的結(jié)果，此作用即為分解代謝產(chǎn)物阻遏。葡萄糖效應(yīng)：由于葡萄糖常對(duì)分解利用其他底物的有關(guān)酶的合成有阻遏作用，故分解代謝 產(chǎn)物阻遏又稱為葡萄糖效應(yīng)。二、問答題1、常見的產(chǎn)酶微生物有哪些？ （ P22）細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌2、對(duì)產(chǎn)酶菌種有哪些要求？（1）酶的產(chǎn)量高（2）容易培養(yǎng)和管理，產(chǎn)酶細(xì)胞容易生長繁殖，適應(yīng)性較強(qiáng)，便于管理菌株遺傳性要穩(wěn)定，不易變異退化，不易感染噬菌體，保證生產(chǎn)的穩(wěn)定性4）菌株能利用廉價(jià)原料，發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低發(fā)酵產(chǎn)物利于酶產(chǎn)

9、品的分離純化，最好是分泌型的胞外酶6）菌株安全可靠，不是病原菌，不產(chǎn)毒素及其他有害物質(zhì)，不影響生產(chǎn)人員的身體健康?；蚬こ叹瓯仨毞习踩砸?。（7）3 、從微生物產(chǎn)酶的上、中、下游階段調(diào)控來分析，可通過哪些措施來提高產(chǎn)酶量？（包括優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的選育、設(shè)備的選型、發(fā)酵方法的選擇、發(fā)酵工藝的控制、添加誘導(dǎo)物、解除阻 遏物、添加表面活性劑和產(chǎn)酶促進(jìn)劑、選擇先進(jìn)的分離純化設(shè)備和技術(shù)等）（P32）改善菌種，選擇優(yōu)良菌種，產(chǎn)酶能力高使其酶產(chǎn)量提升 選擇通風(fēng)攪拌設(shè)備匹配、容量盡可能與產(chǎn)酶菌種匹配的發(fā)酵罐 采用連續(xù)發(fā)酵的方式，連續(xù)加入培養(yǎng)物并不斷的提取酶產(chǎn)物防止其次級(jí)代謝產(chǎn)物堆積。 添加一些表面活性劑，增

10、加產(chǎn)酶細(xì)胞的透過性，打破胞內(nèi)酶合成的反饋平衡 加誘導(dǎo)物（酶的作底物、酶的反應(yīng)產(chǎn)物、酶的底物類似物） 解除阻遏物（采用難以利用的碳源，或采用分次添加的碳源的方法使培養(yǎng)液中的碳源保持 在不至于引起分解代謝物阻遏的濃度；對(duì)于末端產(chǎn)物阻遏的酶，可通過控制末端產(chǎn)物的濃 度使阻遏解除）添加表面活性劑（非離子型，對(duì)酶分子有一定的穩(wěn)定作用） 添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑（指那些非微生物生長所必需，能提高酶產(chǎn)量但作用機(jī)制尚未闡明的物質(zhì)， 可以是酶的激活劑或穩(wěn)定劑，也可能是產(chǎn)微生物的生長因子，或有害金屬的螯合劑） 選擇先進(jìn)的分離純化設(shè)備和技術(shù)誘變育種 使誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型：選育組成型突變株 使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?解除反饋?zhàn)瓒簦哼x

11、育營養(yǎng)缺陷型突變株、選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株 解除分解代謝物阻遏：選育抗分解代謝阻遏突變株4 、結(jié)合酶生物合成的四種模式，試論述如何提高酶的生物合成量。 酶生物合成的模式分為 4 種，即 同步合成型、延續(xù)合成型、中期合成型和滯后合成型。 （1）遺傳控制a.b.c.d.基因工程育種：改變細(xì)胞調(diào)節(jié)基因，使菌種由誘導(dǎo)型變?yōu)榻M成型；增加結(jié)構(gòu)基因的拷貝 數(shù)，增加細(xì)胞專一性酶的生產(chǎn)。（2）條件控制 添加誘導(dǎo)物酶的作用底物、作用底物的前體、反應(yīng)產(chǎn)物、酶的底物類似物或底物修飾物cAMP 降低阻遏物濃度 : 產(chǎn)物阻遏：除去終產(chǎn)物；添加阻止產(chǎn)物形成的抑制劑 分解代謝物阻遏：避免使用葡萄糖、避免培養(yǎng)基過于豐富、添加

12、一定量的 添加表面活性劑 : 離子型 （ Tween 80）, 對(duì)細(xì)胞有毒害作用 ; 非離子型 （ TritonX 100）, 增加細(xì)胞通透性 . 添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑：酶促進(jìn)劑對(duì)不同細(xì)胞、不同酶的效果各不相同，需通過試驗(yàn)選用適當(dāng) 的產(chǎn)酶促進(jìn)劑并確定最適濃度 , 其作用機(jī)制并未闡明清楚。 如添加植酸鈣鎂可使桔青霉素生 產(chǎn)磷酸二酯酶的量提高 1020 倍。5、如果要篩選酸性蛋白酶或酸性淀粉酶高產(chǎn)菌株，請(qǐng)制定初篩和復(fù)篩實(shí)驗(yàn)方案（策略）。1材科和方法E1試殮材料1.1.1出發(fā)株=黑曲毒1.1.2分離及斜面培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基為TOA培養(yǎng)基和S氏培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)基是在察氏 培養(yǎng)基中抑入播的酪蛋a。1）FDA培

13、養(yǎng)基3 10min 12min （各 做2組）0隨后在暗光條件下，用環(huán)L無菌生理鹽水對(duì)平皿上的菌進(jìn)行洗脫，適當(dāng)稀釋后， 涂布于分為平nib以黑布包S3orr避光培養(yǎng)天，從長出菌落與其水解H直徑比的大小 及菌落形態(tài)的變化，挑迭所需菌種，編號(hào)并保存，同時(shí)根據(jù)平01菌落數(shù)計(jì)算致死率，從而求 得成活率*致死率（） =（A-B）/aXloo式中：A為對(duì)照組平皿上的菌落數(shù)；B為諉變處理后平m上的菌落數(shù)。N3酶活測(cè)主方法酶活定義：謔酶粉在40t，pH值為3. Q反應(yīng)條件下，1分鐘水解酬素產(chǎn)生h g酣氨酸為一個(gè) 酶活力單位U尢）.3結(jié)果與分析3.1菌株選肓結(jié)果為了篩選在固體培養(yǎng)條件下產(chǎn)酶高的菌株，經(jīng)紫外線誘變

14、處理后，得到LQO余株突變 株.這些菌株在形態(tài)上有一走的差異，依照其菌落的形態(tài)、菌落大小、抱子顏色和抱子豐滿 程度臥S水解圈的大小，從中挑選出20株先經(jīng)三角瓶液體發(fā)酣產(chǎn)酶測(cè)定，獲得10個(gè)高產(chǎn)菌 株再經(jīng)三角瓶固體發(fā)醐培養(yǎng)復(fù)選V其中曠W的酶活最高92a4U/g 影響OH正常解鏈與堿基配對(duì)，從而引起基因突變，提高酶產(chǎn)量。第三章 酶的分離工程（不作考核）第四章固定化酶與細(xì)胞一、名詞解釋固定化酶：用物理或化學(xué)手段定位在限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性，可重復(fù)利用 的酶。固定化細(xì)胞：固定化細(xì)胞技術(shù)是利用物理或化學(xué)手段將游離狀態(tài)的細(xì)胞固定或定位在限定 的空間區(qū)域，并使其保持固有的催化活性。構(gòu)象效應(yīng)：酶在固

15、定化過程中，由于酶與載體相互作用使酶的活性中或變構(gòu)中心的構(gòu)象發(fā)生變化，從而導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或酶催化底物轉(zhuǎn)化的能力降低，導(dǎo)致酶活性下降，這種效應(yīng)被稱為構(gòu)象效應(yīng)。屏蔽效應(yīng)：酶經(jīng)固定化后，載體會(huì)成為底物或者其他效應(yīng)物結(jié)合到活性中心或者變構(gòu)中心的空間障礙，降低了酶與底物或其他效應(yīng)物結(jié)合 ，從而影響酶的催化活性。 微擾效應(yīng)：由于載體固有的性質(zhì)使緊鄰固定化酶的區(qū)域發(fā)生微環(huán)境變化，使酶的催化能力及酶對(duì)效應(yīng)物作出調(diào)節(jié)反應(yīng)的能力發(fā)生改變，這種效應(yīng)被稱為微擾效應(yīng)。分配效應(yīng)：由于載體的親水或者疏水特性以及帶電特征使底物、產(chǎn)物或其他效應(yīng)物在固定化酶所處微觀環(huán)境和宏觀體系間發(fā)生 不等分配，改變了酶反應(yīng)系統(tǒng)的組成平

16、衡, 從而影響了反應(yīng)速度。外擴(kuò)散限制：底物、產(chǎn)物和其他效應(yīng)物從宏觀體系穿過包圍在固定化酶周圍近乎停滯的液膜層（又稱為Nernst層）到固定化酶表面所受到的限制。內(nèi)擴(kuò)散限制：底物、產(chǎn)物和其他效應(yīng)物從固定化顆粒表面進(jìn)入顆粒內(nèi)部酶活性位點(diǎn)受到的 一種限制。二、問答題1、固定化酶具有什么優(yōu)點(diǎn)?簡(jiǎn)化了提純工藝。極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留,以在較長時(shí)間內(nèi)反復(fù)使用， 有利于工藝的連續(xù)化、管道化。反應(yīng)過程可以嚴(yán)格控制，有利于 工藝自動(dòng)化。絕大多數(shù)情況下提高了酶的穩(wěn)定性。較能適應(yīng)于多酶反應(yīng)。酶的使用效率提高，產(chǎn)物得率提高，產(chǎn)品質(zhì)量有保障，成本低。2、試述常見固定化酶的方法、原理及其優(yōu)

17、缺點(diǎn)（可采用表格歸類總結(jié)）。物理吸附法離子結(jié)合法生物特異性吸附法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法包埋法發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),將酶分子截留范德華力氫鍵疏水作用互補(bǔ)生物分子形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)離子效應(yīng)共價(jià)鍵作用在具有特定網(wǎng)間的親和作用的酶固定化方狀結(jié)構(gòu)載體中操作簡(jiǎn)單，處理采用吸附法固定酶包埋在聚合物中條件溫和，酶的酶，其操作簡(jiǎn)便、共價(jià)結(jié)合法酶與利用此法進(jìn)行固定不易漏出；操作條化，酶的活性中心不高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性條件溫和，不會(huì)載體之間結(jié)合緊件溫和、對(duì)外界環(huán)優(yōu)點(diǎn)易被破壞，且酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)變化少，因而酶活力損失很少但是物理吸附法固中心的氨基酸殘基不易被破壞,能得到酶活回收率高的固定化酶。載體和酶的結(jié)合力比較弱，容易受緩沖液種類或引起酶邊形或

18、失活，且載體廉價(jià)易得，可反復(fù)使用。密，不易脫落，穩(wěn)定性好反應(yīng)條件激烈，操制備的細(xì)胞與載體結(jié)合緊密境的緩沖作用大,可防止酶體的機(jī)械損傷，易于再生，產(chǎn)物分離提取容易缺點(diǎn)定的酶與載體相互pH的影響，在離固定化費(fèi)用高作復(fù)雜，控制條件作用力弱、酶容易從載體上脫落下來。子強(qiáng)度高的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí),酶往往會(huì)從載體上脫落。制備難苛刻，活力損失較制備麻煩，活力損失 較大，是交聯(lián)反應(yīng)的過 程往往比較激烈，因?yàn)?交聯(lián)反應(yīng)可能發(fā)生在 酶分子間，也可能發(fā)生 于分子內(nèi)，分子間交聯(lián) 和分子內(nèi)交聯(lián)的比例 在一定程度上和酶的 濃度與交聯(lián)試劑的濃 度有關(guān)，也與 pH離 子強(qiáng)度有關(guān)，如果交聯(lián) 條件控制不合適，許多 酶易在固定化過程

19、中 失效，酶回收率不高。不可能再生容易造成酶的泄露3、評(píng)價(jià)固定化酶固定效果的參數(shù)有哪些？ 由于選用的固定化方法不同，固定化酶的活力和性質(zhì)也有所不同，因此需要對(duì)不同的固定化方 法進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)的指標(biāo)主要有：cm2)（1）固定化酶的比活 每克（毫克）干固定化酶所具有的酶活力單位?；颍?jiǎn)挝幻娣e（ 的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。（2）操作半衰期 是衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。指在連續(xù)使用的條件下，固定化酶活力下降為最初活 力一半所需要的時(shí)間（ t1/2 ）。固定化酶的操作半衰期是影響其實(shí)際應(yīng)用的重要因素。(3)(4)(5)(6)偶聯(lián)效率=（加入的蛋白量一溶液中殘留的蛋白量）/加入的總蛋白量X 100%活

20、力回收=（固定化酶活力/投入的總酶活力）X 100% 相對(duì)酶活力 具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與游離酶活力的比值。 酶載量 單位載體所固定的酶活力（或酶蛋白量）。（7）酶的固定化效率與酶的活力回收率 ；酶的固定化效率：是指酶與載體結(jié)合的百分率。酶活 力回收率：指固化酶的總活力與用于固化酶的總酶活力的百分率。酶分子在固定化過程中，由于構(gòu)象效應(yīng)造成活性中心或調(diào)節(jié)中心空間構(gòu)象發(fā)生變化或者 由于屏蔽效應(yīng)造成酶活性中心無法結(jié)合底物。有部分活性中心的氨基酸殘基參與了與載體的結(jié)合，導(dǎo)之部分酶完全喪失活性。 酶活性未參與反應(yīng)，但與載體結(jié)合后使酶與底物的結(jié)合和產(chǎn)物的擴(kuò)散存在位阻效應(yīng)。4、 固定化酶活力降低的可

21、能原因有哪些？（P87） 一般來說，固定化酶的活力比游離酶的低。固定酶的活力要低于等摩爾游離酶的活力的原因可 能是：（1） （2）（3）5、固定化對(duì)酶反應(yīng)體系產(chǎn)生了哪些影響（效應(yīng)）？ 為了便于分析，通常在固定化酶體系中作兩個(gè)預(yù)先的假設(shè)：一是酶在載體表面或多孔介質(zhì)內(nèi)的 分布是完全均勻的；二是整個(gè)系統(tǒng)各向同性。在上述條件下，固定化對(duì)反應(yīng)體系造成以下效應(yīng)。構(gòu)象效應(yīng) 屏蔽效應(yīng) 微擾效應(yīng)分配效應(yīng)擴(kuò)散限制效應(yīng)（外擴(kuò)散限制和內(nèi)擴(kuò)散限制）6、固定化酶的表觀米氏常數(shù) Km受哪些因素的影響？ （ P89） 固定化可以使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生一定程度的改變，可以影響到酶分子與底物的親和力，造成酶分子Km值的變化，由于

22、構(gòu)象改變引起的 Km值變化很難經(jīng)行預(yù)測(cè)，其受載體的類型、固定 化方法等因素的制約。載體的帶電性質(zhì)可以影響固定化酶的表觀 Km值。固定化酶載體的疏水性強(qiáng)弱 同樣會(huì)影響到底物在酶催化微環(huán)境的濃度分配，進(jìn)而影響固定化酶 的表觀Km值。酶的表觀Km值還受溶液中離子強(qiáng)度的影響。7、 載體的帶電荷性質(zhì)如何影響固定化酶最適pH的變化？酶固定化后，對(duì)底物作用的最適 pH和酶活力一pH曲線常常會(huì)發(fā)生偏移。 帶負(fù)電荷的載體 固定化的酶的最適pH向堿性偏移，帶正電荷的載體固定化的酶的最適pH向酸性偏移。8、 載體的親疏水性質(zhì)如何影響固定化酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)表觀Km值的變化？固定化酶載體的疏水性強(qiáng)弱同樣會(huì)影響到底物在酶催化

23、微環(huán)境的濃度分配，進(jìn)而影響固定化酶 的表觀Km值，如果載體的疏水性較強(qiáng)， 疏水性底物在酶催化的微環(huán)境的分配增加，使固定化酶的表觀Km值降低，對(duì)于親水性底物在酶催化的微環(huán)境的分配相對(duì)減少，造成酶的表觀Km值增加；反之，如果親水性載體用于固定化酶，對(duì)于疏水性底物的表觀Km值會(huì)值增加，對(duì)親水性底物的表觀Km值降低。第五章 化學(xué)酶工程一、名詞解釋酶分子改造：通常把改變酶蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)的過程稱為改造。 酶分子修飾：通過各種方法可使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，從而改變酶的某些特性和功能 的技術(shù)過程。模擬酶：用合成高分子來模擬酶的結(jié)構(gòu)、特性、作用原理以及酶在生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)過 程，從原理的本質(zhì)定義為 是用人工方

24、法合成具有酶性質(zhì)的一類催化劑。肽酶：是模擬天然酶的 活性部位， 人工合成的具有催化活性的多肽。 抗體酶：又稱催化抗體，是一種新型人工酶制劑，是 抗體的高度特異性和酶的高效催化能 力巧妙結(jié)合的產(chǎn)物 ，本質(zhì)上是一類具有催化能力的免疫球蛋白。印跡酶：通過分子印跡技術(shù)產(chǎn)生類似于酶的活性部位的空腔，對(duì)底物產(chǎn)生有效的結(jié)合作用 的一類人工模擬酶。二、問答題提高生物活性。 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。 降低酶類藥物的抗原性。 改變酶學(xué)性質(zhì)。1、簡(jiǎn)述酶化學(xué)修飾的目的。（ P101） 酶化學(xué)修飾的目的在于：人為地改變某些天然酶的性質(zhì)，創(chuàng)造某些天然酶所不具備的某些優(yōu)良 特性甚至創(chuàng)造出新的特性，概括起來有：（1）（2）（3）（4

25、）(1)2、 在酶的化學(xué)修飾過程中應(yīng)考慮哪些因素？（P101） 被修飾酶。開始設(shè)計(jì)酶化學(xué)修飾反應(yīng)時(shí)， 對(duì)被修飾酶的活性部位、穩(wěn)定條件、側(cè)鏈基團(tuán)性 質(zhì)及酶反應(yīng)的最適條件等應(yīng)盡可能全面了解。(2)修飾劑的選擇。 要求修飾劑具有較大的相對(duì)分子質(zhì)量 ，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附有良 好的生物相容 性和水溶性 ，修飾劑 表面具有比較多的活性基團(tuán)。(3)修飾反應(yīng)條件的選擇。修飾反應(yīng)一般要選擇在酶穩(wěn)定的條件下進(jìn)行，盡可能少破壞酶的必需集團(tuán)， 選擇酶與修飾劑的結(jié)合率和酶活回收率都較高的反應(yīng)條件。 對(duì)反應(yīng)條件中酶與修飾 劑的分子比例、反應(yīng)溫度、pH時(shí)間、溶劑性質(zhì)和離子強(qiáng)度等在確定反應(yīng)條件時(shí)也必須考慮。3、簡(jiǎn)述酶分子側(cè)鏈上的

26、修飾功能基團(tuán)主要有哪些？ 酶的化學(xué)修飾主要是對(duì)一些活潑性比較強(qiáng)的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾。主要包括：氨基（賴氨 酸殘基）、羧基（谷氨酸、天冬氨酸殘基）、羥基（絲氨酸、蘇氨酸殘基）、巰基（半胱氨酸 殘基）、咪唑基（組氨酸殘基）、胍基（精氨酸殘基）、酚基（酪氨酸殘基）、吲哚基（色氨 酸殘基）、甲硫基（蛋氨酸殘基）。P107）聚乙二醇對(duì)酶的修飾， 該類修飾劑是既能溶于水，又可以溶于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑的兩親 分子，且在沒有免疫原性和毒性，在體內(nèi)不殘留。右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯對(duì)酶的修飾：溴化氰法；，02高碘酸法糖肽對(duì)酶的修飾：糖肽一般是通過纖維蛋白酶或蛋白水解酶降解纖維蛋白或Y球蛋白而得。糖肽結(jié)構(gòu)上有氨基

27、，這些氨基經(jīng)合適的方法活化后能與酶分子中的氨基發(fā)生反應(yīng) 而以共價(jià)鍵結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)酶的修飾。5、在酶分子的表面化學(xué)修飾中，常用的大分子修飾劑有哪些？ 聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清蛋白。6、修飾酶的性質(zhì)發(fā)生了哪些變化？ 首先要強(qiáng)調(diào)的是，我們對(duì)酶進(jìn)行修飾的目的就是要改變酶的結(jié)構(gòu)和特性，而且要使這種改變4、簡(jiǎn)述常用的酶分子表面化學(xué)修飾方法。（1）朝著對(duì)人類有用的方向進(jìn)行。 不管是從理論上分析還是從實(shí)際修飾的結(jié)果來看， 酶經(jīng)修飾之后， 性質(zhì)朝任何方向改變的可能性都存在，而且多數(shù)改變都是不利的。酶修飾之后，性質(zhì)的變化因 酶、修飾劑和修飾方法的不同而出現(xiàn)很大的差異。（1）熱穩(wěn)定性用前面介紹的一些修飾劑對(duì)

28、酶進(jìn)行修飾， 在多數(shù)情況下可以提高酶的穩(wěn)定性。但PEG沒有明顯的提高。（2） 抗原性抗原性是藥物用酶必須解決的問題。在前面介紹過的修飾劑中，被認(rèn)為可以消除酶的抗原性的修飾劑只有 PEG和人血清白蛋白。（3） 對(duì)各類失活因子的抵抗力由于酶修飾之后，表面會(huì)帶上修飾劑而受到保護(hù)，因此，酶 修飾之后，抵抗蛋白酶水解和其它失活因子的能力普遍增強(qiáng)。（4） 在生物體內(nèi)的半衰期由于修飾之后，穩(wěn)定性和對(duì)抗各種失活因子的能力增強(qiáng)，因此， 半衰期也普遍延長。（ 5 ）修飾酶的最適 pH（6）修飾酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)7、抗體酶具有什么特點(diǎn)？ 能催化一些天然酶不能催化的反應(yīng)抗體酶的多樣性決定了抗體酶的催化反應(yīng)類型多樣性；催化

29、抗體的構(gòu)建，表明可通過免疫學(xué)技術(shù)，為人工酶的設(shè)計(jì)和制備開辟一條新的、實(shí)用化的途 徑。這種利用抗原 -抗體識(shí)別功能，把催化活性引入免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的技術(shù)，或許可能發(fā)展 成為構(gòu)建某種具有定向特異性和催化活性的生物催化劑的一般方法。 有更強(qiáng)的專一性和穩(wěn)定性抗體酶作為一種具酶和抗體雙重功能的新型大分子用作分子識(shí)別元件，具有優(yōu)于酶和抗體的突出特點(diǎn)。因?yàn)榕潴w底物與抗體酶的活性部位結(jié)合后，會(huì)立即發(fā) 生催化反應(yīng)，釋放產(chǎn)物，所以每一次分子反應(yīng)之后，抗體的分子識(shí)別位點(diǎn)都可以再生，這就使 催化抗體能夠作為一種可以連續(xù)反復(fù)使用的可逆性分子。 化作用機(jī)制不同酶催化機(jī)制是鎖鑰學(xué)說” （Lock and Key）及“誘導(dǎo)

30、契合學(xué)說” （Induced-Fit ）;而抗體酶 的催化劑至目前還沒有完全搞清楚。 Jan da曾提出“識(shí)別開關(guān)”或“誘餌開關(guān)” （Bait and Switch） 機(jī)制，即抗體將底物“釣進(jìn)”抗體結(jié)合部位，然后使其與抗體結(jié)合，打開底物轉(zhuǎn)化為反應(yīng)過渡 態(tài)的“開關(guān)”，導(dǎo)致共價(jià)鍵斷裂，形成產(chǎn)物，還有待研究。8、試述采用誘導(dǎo)法制備抗體酶的一般步驟。 首先合成穩(wěn)定反應(yīng)的過渡態(tài)類似物，將此化合物作為半抗原與載體蛋白相連，然后免疫動(dòng)物制 備單克隆抗體，由它誘導(dǎo)產(chǎn)生的單克隆抗體可以按預(yù)定的方向獲得催化活性。9、簡(jiǎn)述分子印跡聚合物的制備方法。 所謂分子印跡是制備對(duì)某一化合物具有選擇性的聚合物的過程。這個(gè)化合物

31、叫印跡分子或叫模 板分子。印跡技術(shù)包括下列內(nèi)容： 選定印跡分子和功能單體，使兩者發(fā)生互補(bǔ)反應(yīng)。 與印跡分子發(fā)生互補(bǔ)作用的單體與其它單體共同發(fā)生聚合反應(yīng)。 將印跡分子從聚合物中去除。 這樣形成的聚合物內(nèi)就保留有和印跡分子的形狀、大小完全 一樣的空穴，印跡的聚合物能維持相對(duì)于印跡分子的互補(bǔ)性，因此，該聚合物能以高選擇性重 新結(jié)合印跡分子。 分子印跡也叫主 -客體聚合作用或模板聚合聚合作用， 制得的分子聚合物稱為 分子印跡聚合物。10、簡(jiǎn)述生物印跡酶的基本制備過程。（ P140） 將酶溶解于含有其配體的緩沖溶液中，使其構(gòu)象發(fā)生改變，有利于與底物結(jié)合，再將此酶液冷 凍干燥形成酶粉，用有機(jī)溶劑沖洗干酶粉

32、除去配體后，將其過濾并真空干燥，在無水或微水有 機(jī)溶劑中，由于酶的記憶功能，這種新構(gòu)象仍能保持，致使結(jié)合配體的能力大大提高。第六章生物酶工程即通過添加、插入或刪除 已知的DNA序列中特定的模擬天然 進(jìn)化機(jī)制來達(dá)到體外對(duì)酶基因的改造， 產(chǎn) 定向 選擇獲取特定性質(zhì)的酶。一、名詞解釋 定點(diǎn)突變： 在基因的特定位點(diǎn)引入突變， 核苷酸序列。 酶分子定向進(jìn)化： 人為的控制進(jìn)化條件， 生基因多樣性，并通過定向篩選技術(shù)獲取易錯(cuò)PCR是一種迅速、簡(jiǎn)便的在 DNA序列中進(jìn)行隨機(jī)突變的方法，主要特點(diǎn)是能夠控制它 的突變頻率。連續(xù)易錯(cuò)PCR將一輪PCRT增得到的有用突變基因作為下一輪的模板進(jìn)行PCRT增，連續(xù)反復(fù)進(jìn)行

33、隨機(jī)誘變使每一輪獲得的小突變可以積累大部分的有益突變。DNA改組：用Dnase 1或者用超聲波進(jìn)行隨機(jī)切割產(chǎn)生隨機(jī)大小片段，再從正突變基因庫中 分離出來所需DNA片段，得到的片段在不加引物的多次 PCR環(huán)中，彼此之間互為模板和引 物進(jìn)行擴(kuò)增，直到連接成為接近目的片段長度的 DNA分子，然后再利用基因兩端序列為引物 擴(kuò)增獲得全長基因，這是來自不同基因之間的重組。2 種或復(fù)合酶：復(fù)合酶是一種混合物，由多只能跟沒組成，用來完成一系列的催化反應(yīng)。由2 種以上單一酶制劑混合而成。融合酶：指將兩個(gè)或兩個(gè)以上的酶分子組合在一起形成的融合蛋白。二、問答題1、如何理解酶分子改造的理性設(shè)計(jì)和非理性設(shè)計(jì)？ 在研究天

34、然酶及其突變體時(shí)，通常先獲得酶分子特征、空間結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系等方面 信息，這些用各種生物化學(xué)、光譜學(xué)、晶體學(xué)等方法來解決，然后根據(jù)這些信息進(jìn)行酶分子的 改造，這就是酶分子的理性設(shè)計(jì)，它包括 化學(xué)修飾、定點(diǎn)突變 等，而不 需要準(zhǔn)確知道酶蛋白結(jié) 構(gòu)與功能等信息，直接通過隨機(jī)突變、篩選等方法進(jìn)行酶分子的改造，稱為酶分子的非理性設(shè) 計(jì)，如定向進(jìn)化、雜合進(jìn)化。1、 簡(jiǎn)述酶分子定向進(jìn)化的一般步驟。 酶定向進(jìn)化通常分 3 步進(jìn)行： 首先通過隨機(jī)突變或基因體外重組創(chuàng)造基因多樣性；然后導(dǎo)入適 當(dāng)載體后構(gòu)建突變文庫；最后通過靈敏的篩選方法，選擇陽性突變子。這個(gè)過程可重復(fù)循環(huán)，直至得到預(yù)期性狀的酶。3、酶分

35、子定向進(jìn)化的基本方法有哪些？ 易錯(cuò) PCR可以用MiT來替代Mg+，使PCM發(fā)生突變。 DNA重組（改組）（DNA shuffling）重組可以在同一基因的不同突變體之間進(jìn)行，也可以在不同物種的同源基因間進(jìn)行。因此，DNA重組就是把不同來 源的同源基因斷裂成不同大小的片段，然后對(duì)這些片段進(jìn)行重新組合。4、外顯子改組；與DNA改組相似，都是在各自含突變的片段進(jìn)行交換。 隨機(jī)引物體外重組交錯(cuò)延伸法 臨時(shí)模板隨機(jī)嵌合法易錯(cuò)PCR的技術(shù)目的和策略有哪些？（調(diào)整 dNTP濃度、增加Mg+濃度、添加 皿斤等）易錯(cuò)PCF是一種迅速、簡(jiǎn)便的在 DNA序列中進(jìn)行隨機(jī)突變的方法，主要特點(diǎn)是能夠控制它的突變頻率。用

36、PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，通過使用低保真度的Taq DNA聚合酶或改變PCR常規(guī)的反應(yīng)條件，如調(diào)整 dNTP濃度、增加Mg2+濃度、添加Mn2+等，引起堿基以某一頻率進(jìn)行隨機(jī)錯(cuò) 配而引入多點(diǎn)突變，構(gòu)建突變體庫，然后選擇或篩選出所需的突變體。目的：將一輪PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一輪的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連續(xù)反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)誘變，結(jié)果使每一輪獲得的小突變可以積累大部分的有益突變。5、簡(jiǎn)述DNA改組技術(shù)的基本原理和操作。DNA改組技術(shù)又稱DNA重排技術(shù)或有性PCR指DNA分子的體外重組，是基因在分子水平 上進(jìn)行有性重組。通過用 DNase 1 或者用超聲波進(jìn)行隨機(jī)切割產(chǎn)生隨機(jī)大小片段，再從正突變

37、基因庫中分離出來所需 DNA片段，得到的片段在不加引物的多次PCR循環(huán)中，彼此之間互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增，直到連接成為接近目的片段長度的DNA分子，然后再利用基因兩端序列為引物擴(kuò)增獲得全長基因，這是來自不同基因之間的重組。6、簡(jiǎn)述交錯(cuò)延伸PCF技術(shù)的原理和特點(diǎn)。這是一種簡(jiǎn)化的DNA改組法，它在PCF反應(yīng)中，將含不同點(diǎn)突變的模板混合，隨之進(jìn)行多 輪變性、短暫的復(fù)性 / 延伸，反復(fù)重復(fù)直到形成全長基因片段。水相酶催化它的主要特點(diǎn)在于能將PCR反應(yīng)中的常規(guī)的退火和延伸合二為一 ，大大縮短反應(yīng)時(shí)間，結(jié) 果得到非常短的新生鏈，又將經(jīng)過變性的新生鏈作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火， 繼續(xù)延伸。由此生

38、成的新生 DNA分子中含有大量的突變組合，有利于酶的新性質(zhì)的產(chǎn)生。第七章一、名詞解釋最適水含量：在特定的有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系中， 催化速度達(dá)到最大 時(shí)的含水量。 水活度Aw在一定的溫度與壓力下，反應(yīng)體系中水的蒸汽壓與同樣狀態(tài)下純水蒸汽壓的比值。疏水參數(shù)igP： igP是某有機(jī)溶劑在正辛醇/水體系中分配系數(shù)P的對(duì)數(shù)，igP可以定量 描述溶劑的極性，可作為有機(jī)溶劑的選擇標(biāo)準(zhǔn)。pH記憶：有機(jī)溶劑中酶能夠保持其冷凍干燥或沉淀前所在緩沖液中的pH.分子印跡：由競(jìng)爭(zhēng)抑制劑導(dǎo)致在酶構(gòu)象改變?cè)诔ヒ种苿┖笤诘退畻l件下仍能保持。這種 酶分子記憶原來在水相中的一些特性的現(xiàn)象稱為分子印記。酶的區(qū)域選擇性：在酶促反應(yīng)中，

39、底物某一位置上的基團(tuán)被被酶選擇性的轉(zhuǎn)化，而另一位 置上的相同基團(tuán)沒有被轉(zhuǎn)化。溶劑工程：有機(jī)介質(zhì)條件下，酶所處溶劑系統(tǒng)的改變會(huì)改變酶的催化活性。這種通過改變 反應(yīng)介質(zhì)，實(shí)現(xiàn)酶催化性質(zhì)改變的技術(shù)稱為溶劑工程。二、問答題1、酶催化反應(yīng)的介質(zhì)有哪些？（一）水介質(zhì)（二）非水介質(zhì)有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系 超臨界流體反應(yīng)體系 氣相介質(zhì)反應(yīng)體系 離子液介質(zhì)反應(yīng)體系2、非水介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的特點(diǎn)。1）在非水系統(tǒng)內(nèi)，絕大多數(shù)有機(jī)化合物溶解度高，尤其是能提高非極性底物的溶解度。（2）非水介質(zhì)的參與可以改變反應(yīng)平衡，使酶可以催化在水中不能進(jìn)行的反應(yīng)。3）能抑制依賴于水的某些不利反應(yīng)和副產(chǎn)物。4）從有機(jī)溶劑中分離純化產(chǎn)物比從水

40、中容易， 從低沸點(diǎn)的溶劑中可以更容易地分離純化產(chǎn)物。（5）酶在非水體系中的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性增加，而且可以有效減少反應(yīng)過程中的微生物污 染。6）可以控制底物的特異性，區(qū)域選擇性和立體選擇性。（7）在很多情況下，可以實(shí)現(xiàn)游離酶的回收與再利用。（8）有機(jī)溶劑的凝固點(diǎn)一般遠(yuǎn)低于水，使一些對(duì)溫度非常敏感的酶在適宜的溫度下進(jìn)行催化反 應(yīng)。3、簡(jiǎn)述酶促反應(yīng)的有機(jī)介質(zhì)體系種類。根據(jù)酶和水的分布特性可以將有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系分為以下幾種類型： 酶在與水共融的有機(jī)介質(zhì)體系中催化反應(yīng)； 酶在有機(jī)介質(zhì)和水組成的兩項(xiàng)體系中催化反應(yīng)；包括非極性有機(jī)溶劑 - 酶懸浮體系和非極性有機(jī) 酶在近乎無水的有機(jī)溶劑中催化反應(yīng)，溶劑-

41、PEG修飾酶單相體系 酶在反膠束體系中催化反應(yīng)酶的空間構(gòu)象、 反應(yīng)速率、 平衡及立體選擇性）4、水對(duì)有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的影響有哪些？有機(jī)介質(zhì)中水的含量與酶的空間構(gòu)象、反應(yīng)速率、平衡及立體選擇性等都有直接關(guān)系。1）水對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響（ 2）水對(duì)有機(jī)介質(zhì)酶促反應(yīng)速率的影響（ 3）水對(duì)酶催化反應(yīng)平衡及立體選擇性的影響（ 4）有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系中水含量的調(diào)控5、有機(jī)溶劑對(duì)有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的影響有哪些？（影響的三個(gè)方面及其對(duì)酶活性、效應(yīng)物 分配、溶劑結(jié)構(gòu)的影響）有機(jī)溶劑主要通過三個(gè)方面來影響酶促反應(yīng)。首先有機(jī)溶劑與酶分子直接發(fā)生作用，通過 干擾氫鍵和疏水鍵等改變酶的構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶的活性受到抑

42、制或者失活；其次有機(jī)溶劑直接 與酶分子周圍的水相互作用，造成酶分子必須水的變化和重新分布；再次是有機(jī)溶劑影響到底 物和產(chǎn)物的分配與擴(kuò)散，影響反應(yīng)的進(jìn)行。6、有機(jī)介質(zhì)體系中酶活性顯著降低的原因是什么？（1）傳質(zhì)障礙是造成酶活性下降的主要原因之一（2）有機(jī)溶劑可以增加酶促反應(yīng)的活化能，導(dǎo)致酶活性的下降（3）有機(jī)介質(zhì)中酶分子活性中心剛性的增加，也是造成酶活性下降的主要原因7、簡(jiǎn)述有機(jī)介質(zhì)中酶的穩(wěn)定性發(fā)生了哪些變化？有機(jī)介質(zhì)中酶分子的剛性增加， 同時(shí)有機(jī)溶劑的引入使一些與水相關(guān)的酶蛋白不穩(wěn)定因素大大降低， 使得酶分子在有機(jī)介質(zhì)中的熱穩(wěn)定性、 儲(chǔ)存穩(wěn)定性以及對(duì)變性劑的耐受性顯著 提高。8、試述有機(jī)介質(zhì)中酶的熱穩(wěn)定性提高的原因。 在惰性有機(jī)溶劑中許多酶的熱穩(wěn)定性顯著增加，酶的熱穩(wěn)定性與溶劑的含水量密切相關(guān)，一般 隨著含水量的增加熱穩(wěn)定性降低。第八章 酶反應(yīng)器和酶?jìng)鞲衅饕?、名詞解釋 酶反應(yīng)器：以酶作為催化劑進(jìn)行酶促反應(yīng)的設(shè)備稱為酶反應(yīng)器。 酶?jìng)鞲衅鳎阂悦缸鳛榉肿幼R(shí)別元件上的敏感材料，同各種不同的轉(zhuǎn)換器結(jié)