細(xì)胞工程思考題參考答案

1、第一章 緒論課后習(xí)題答案1. 動(dòng)物細(xì)胞工程主要有哪些內(nèi)容？這些技術(shù)有何用途？答：1. 組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2. 細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)3. 細(xì)胞核移植技術(shù)4. 胚胎工程技術(shù)5. 干細(xì)胞技術(shù)6. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)7. 染色體工程細(xì)胞工程的應(yīng)用有：A. 單克隆抗體的應(yīng)用：疾病診斷與治療、微量大分子物資的檢測(cè)、貴重生物活性物的分離與提純、特殊疾病治療、與藥物交聯(lián)治療疾??；B. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用：建立疾病的動(dòng)物模型、品種改良和抗病育種、“乳腺生物發(fā)應(yīng)器”、基因代替治療、異種器官移植、基因功能研究；C. 細(xì)胞與組織替代治療；D. 治療人類(lèi)不孕癥；E. 優(yōu)良品種繁育；F. 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜；G. 保護(hù)瀕危動(dòng)物。2

2、. 追蹤動(dòng)物細(xì)胞工程研究與應(yīng)用的最新進(jìn)展，并預(yù)測(cè)其發(fā)展趨勢(shì)。第二章 細(xì)胞培養(yǎng)1、體外培養(yǎng)細(xì)胞有哪些類(lèi)型？其生長(zhǎng)特點(diǎn)有什么區(qū)別？答：體外培養(yǎng)的細(xì)胞根據(jù)其生長(zhǎng)方式，主要分為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞和懸浮生長(zhǎng)型細(xì)胞。離體細(xì)胞必須貼附于底物上才能生長(zhǎng)的細(xì)胞稱(chēng)為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞。有機(jī)體的絕大部分細(xì)胞必須貼附在某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，大多數(shù)細(xì)胞必須貼附在固相表面才能生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞布滿(mǎn)表面后即停止生長(zhǎng)。從生長(zhǎng)表面脫落進(jìn)入液體得細(xì)胞通常不再生長(zhǎng)而逐漸退化，這種細(xì)胞稱(chēng)為單層附壁細(xì)胞。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞在活體體內(nèi)時(shí)，形態(tài)各異，而體外培養(yǎng)狀態(tài)下則在形態(tài)上比較單一而失去其在體內(nèi)時(shí)原有的特征。按照培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，主要

3、可分為以下幾類(lèi)：成纖維細(xì)胞型、上皮型細(xì)胞、游走型細(xì)胞、多形型細(xì)胞；少數(shù)細(xì)胞類(lèi)型在體外培養(yǎng)時(shí)不需要附著于底物而于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，包括一些取自血、脾或骨髓的培養(yǎng)細(xì)胞，如血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞等，這些細(xì)胞在懸浮中生長(zhǎng)良好，可以是單個(gè)細(xì)胞或?yàn)榧?xì)小的細(xì)胞團(tuán)，觀察使細(xì)胞呈圓形。由于懸浮生長(zhǎng)于培養(yǎng)液中，因此其生存空間大，具有能夠提供繁殖大量細(xì)胞、傳代方便、易于收獲細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，易于大規(guī)模生產(chǎn)，便于過(guò)程的控制。2、細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程包括哪些主要階段？每一生長(zhǎng)階段各有什么特征？答：進(jìn)行正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，不論細(xì)胞的種類(lèi)和供體的年齡如何，細(xì)胞系的生長(zhǎng)過(guò)程都經(jīng)歷原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)

4、期和衰退期（或永生化）三個(gè)階段。原代培養(yǎng)期也稱(chēng)初代培養(yǎng)期，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)14周，此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)相似性較大，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成率很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。原代細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間后，如是貼附型細(xì)胞就會(huì)連接成片而鋪滿(mǎn)瓶底，這時(shí)需將原代細(xì)胞分開(kāi)至多個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為傳代。初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱(chēng)做細(xì)胞系。此期細(xì)胞增殖旺盛，可見(jiàn)細(xì)胞分裂相，并能維持二倍體核型。傳代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)發(fā)生較大

5、改變。一般情況下當(dāng)傳代1050次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。衰退期的細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)(多發(fā)生在傳代末或衰退期)，由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性或惡性。細(xì)胞永生性也稱(chēng)不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱(chēng)無(wú)限細(xì)胞系，也稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系。3、每代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)包括哪幾個(gè)主要時(shí)期？各期細(xì)胞有何特點(diǎn)？答：每代細(xì)胞從開(kāi)始接種到分離再培養(yǎng)，一般要經(jīng)過(guò)以下階段：潛伏期、指數(shù)(對(duì)數(shù))生長(zhǎng)期和停止期(平臺(tái)期)。細(xì)胞接種培養(yǎng)初期，歷經(jīng)懸浮、貼壁

6、及生長(zhǎng)加速的階段。細(xì)胞接種培養(yǎng) 后，先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱(chēng)貼壁，貼壁出現(xiàn)標(biāo)志懸浮期結(jié)束。細(xì)胞貼附于支持物后，會(huì)發(fā)生一系列變化，然后還要經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí)，可有生長(zhǎng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖，少見(jiàn)分裂相。潛伏期后，細(xì)胞分裂出現(xiàn)，并逐漸增多，標(biāo)志細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。又稱(chēng)對(duì)數(shù)期。此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖旺盛，細(xì)胞成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞分裂相增多。（細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。）在細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停止期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量持平，故也

7、稱(chēng)平臺(tái)期。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，可繼續(xù)存活一段時(shí)間。該時(shí)期細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后開(kāi)始衰退死亡。4、什么是原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)？原代細(xì)胞培養(yǎng)有哪些方法？各自的適用范圍是什么？答：原代培養(yǎng)也稱(chēng)初代培養(yǎng)期，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)14周。傳代培養(yǎng)是指原代細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間后，如是貼附型細(xì)胞就會(huì)連接成片而鋪滿(mǎn)瓶底，這時(shí)需將原代細(xì)胞分開(kāi)至多個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為傳代，初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱(chēng)做細(xì)胞系。（課本55頁(yè)）原代細(xì)胞培養(yǎng)的方法有：組織塊培養(yǎng)法、單層細(xì)胞培養(yǎng)法、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法。組織塊培養(yǎng)法特別適合于組織量少的原代培養(yǎng)；單層細(xì)胞培養(yǎng)法尤其適用于細(xì)胞建系和大

8、量組織的培養(yǎng)，用于少量培養(yǎng)工作時(shí)稍顯繁瑣；懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞如白細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和胸水、腹水等癌細(xì)胞，可直接接種進(jìn)行原代培養(yǎng)。5、常用的組織細(xì)胞分離方法有哪幾種？答：分散組織的方法有機(jī)械法分離和消化分離法兩種；根據(jù)組織種類(lèi)和培養(yǎng)要求，宜采用相應(yīng)的方法。(1). 機(jī)械分離法：A.離心分離法B.切割分離法C.機(jī)械分散法；(2). 消化分離法：A.胰蛋白酶消化法B.膠原酶消化法C.EDTA（螯合劑）消化法6、貼壁細(xì)胞傳代時(shí)采用何種方法？其技術(shù)關(guān)鍵是什么？答：貼壁細(xì)胞傳代時(shí)采用消化分離法，其技術(shù)關(guān)鍵是把握好傳代時(shí)機(jī)，消化時(shí)間要適度，消化液濃度要適宜，傳代的細(xì)胞接種數(shù)量可適當(dāng)多一些，使細(xì)胞能盡

9、快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增殖，部分貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞不經(jīng)消化處理直接進(jìn)行吹打也可使細(xì)胞從壁上脫落下來(lái)，而進(jìn)行傳代。7、常用的細(xì)胞克隆化方法有哪些？簡(jiǎn)述其主要技術(shù)環(huán)節(jié)答：主要方法有：稀釋鋪板法、飼養(yǎng)層克隆法、瓊脂克隆法、毛細(xì)管克隆法、熒光激活分選法等。稀釋鋪板法：也稱(chēng)為有限稀釋法。其原理是通過(guò)適當(dāng)?shù)南♂屵_(dá)到分離單個(gè)細(xì)胞的目的。將培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋到510個(gè)細(xì)胞/ml后，在多孔培養(yǎng)板(一般為96孔板)各孔內(nèi)分別加入細(xì)胞懸液0.10.2 ml，使孔內(nèi)落入細(xì)胞的幾率為每孔一個(gè)細(xì)胞。鏡檢每孔所含細(xì)胞數(shù)，標(biāo)記含單個(gè)細(xì)胞的孔，培養(yǎng)一段時(shí)間后，凡在已標(biāo)記的孔中有生長(zhǎng)增殖的細(xì)胞群即為克隆細(xì)胞。常

10、規(guī)使用中，一般不進(jìn)行鏡檢，多采用多次克隆化培養(yǎng)得到單細(xì)胞的克隆系。飼養(yǎng)層克隆法： 對(duì)一些生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞(如雜交瘤細(xì)胞) ，單個(gè)細(xì)胞或密度極低時(shí)細(xì)胞難以存活和增殖，在培養(yǎng)皿中加入能貼壁生長(zhǎng)的其他細(xì)胞（稱(chēng)為飼養(yǎng)細(xì)胞），這些細(xì)胞不僅能起到飼養(yǎng)作用，還能清除培養(yǎng)體系中的死、傷細(xì)胞及其碎片。飼養(yǎng)細(xì)胞的存在可以促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)為細(xì)胞克隆，達(dá)到克隆化目的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有成纖維細(xì)胞、胸腺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞不僅能起飼養(yǎng)作用，還能清除培養(yǎng)體系中死、傷細(xì)胞及其碎片。瓊脂克隆法：將細(xì)胞培養(yǎng)在軟瓊脂形成的半固體培養(yǎng)基上，單個(gè)細(xì)胞可在半固體的培養(yǎng)基上增殖形成集落。常用的軟瓊脂法是在培養(yǎng)皿中先鋪一層0.5%的瓊脂，

11、待凝固后再鋪一層0.25%的軟瓊脂，加入的細(xì)胞數(shù)要在幾率上使長(zhǎng)出的集落是一個(gè)細(xì)胞的后代。長(zhǎng)出集落后，再轉(zhuǎn)移到其他培養(yǎng)器中進(jìn)行擴(kuò)增分析。毛細(xì)管克隆法：毛細(xì)管克隆細(xì)胞法是最早的單細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)。其基本過(guò)程是：在倒置顯微鏡下，用彎頭毛細(xì)管或借助顯微操作儀將細(xì)胞逐個(gè)吸出，分別放入96孔板內(nèi)培養(yǎng)形成克隆。本法雖比較精確，但過(guò)程較繁瑣，成功率低，現(xiàn)已少采用。熒光激活分選法：將細(xì)胞標(biāo)上熒光，當(dāng)細(xì)胞懸液流經(jīng)激活分選儀噴嘴時(shí)形成含有單細(xì)胞的液滴，細(xì)胞受激光照射發(fā)出熒光和前向散射光。通過(guò)儀器分析，使細(xì)胞帶上電荷并使細(xì)胞流動(dòng)方向發(fā)生偏移，各個(gè)含單細(xì)胞的液滴被分別收集在96孔板各孔內(nèi)，以達(dá)到克隆化的目的。8、常用的

12、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)主要有哪些操作模式？各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？答：操作模式：可采用分批式操作、流加式操作、半連續(xù)式操作、連續(xù)式操作和灌流式操作等多種操作方式進(jìn)行培養(yǎng)。分批式操作：將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性將細(xì)胞和培養(yǎng)液投入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中其體積不變，不添加其他成分，待細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，一次性對(duì)細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基進(jìn)行收獲，從中分離所需物質(zhì)。該操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)周期短、污染和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小，既能直觀地反應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過(guò)程，又可直接放大，是進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝條件研究常用的手段。流加式操作：細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)至較高的密度，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程沒(méi)有流出或回收，細(xì)胞或產(chǎn)物達(dá)到所需指標(biāo)后終止培養(yǎng)，

13、一次性回收整個(gè)反應(yīng)體系，分離純化產(chǎn)品。半連續(xù)式操作：培養(yǎng)物的體積逐步增加；可進(jìn)行多次收獲；細(xì)胞可維持指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過(guò)程可持續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間。連續(xù)式操作：細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)，產(chǎn)物體積不斷增長(zhǎng)，可控制衰退期和下降期。其不足是，由于是開(kāi)放式操作，加上培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，容易造成污染，在長(zhǎng)周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性以及分泌產(chǎn)物容易變異，對(duì)設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。灌流式操作：細(xì)胞截留系統(tǒng)可使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，提高產(chǎn)品的產(chǎn)量；連續(xù)灌流細(xì)胞使細(xì)胞穩(wěn)定地處于較好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物得以及時(shí)清除；反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，

14、目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；產(chǎn)品在灌內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收，有利于保持產(chǎn)品的活性。9、什么是細(xì)胞系、細(xì)胞株？答：細(xì)胞系 (cell line): 原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成細(xì)胞系。如果細(xì)胞系不能繼續(xù)傳代或傳代次數(shù)有限，稱(chēng)為有限細(xì)胞系，它由原代培養(yǎng)中的許多細(xì)胞系列組成；如細(xì)胞系可連續(xù)傳代，則稱(chēng)為連續(xù)細(xì)胞系，即已建成的細(xì)胞系 。 細(xì)胞株 (cell strain)：通過(guò)篩選或克隆化，且有特異標(biāo)記的細(xì)胞，這些特性在以后的培養(yǎng)中必須持續(xù)存在。這些特性包括具有一定的標(biāo)記染色體，對(duì)某種病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。10、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的微生物污染有哪些？如何排除這些污染？答：在組織和細(xì)胞培養(yǎng)中常

15、見(jiàn)的微生物污染包括：細(xì)菌、真菌、支原體和病毒。細(xì)胞培養(yǎng)中用抗生素是殺滅微生物的主要手段，但迄今尚無(wú)對(duì)抗支原體特效抗生素，加溫除菌法，動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法，巨噬細(xì)胞吞噬法。第三章 細(xì)胞融合與單克隆抗體1、簡(jiǎn)述細(xì)胞融合技術(shù)的主要方法與技術(shù)原理。答：促細(xì)胞融合的方法有：病毒融合劑誘發(fā)細(xì)胞融合，化學(xué)融合劑誘發(fā)細(xì)胞融合，電融合法。細(xì)胞融合的基本技術(shù)：細(xì)胞融合實(shí)際上包含多個(gè)過(guò)程：首先是兩個(gè)親本細(xì)胞并列，以后膜組織局部破壞，最終形成包圍融合細(xì)胞的連續(xù)胞膜。融合細(xì)胞表現(xiàn)的特征性變化，有膜成分和胞質(zhì)成分的交流以及細(xì)胞內(nèi)電導(dǎo)率的連續(xù)性。2、簡(jiǎn)述篩選融合細(xì)胞的主要方法與原理（各種方法的原理？）。答：利用酶缺陷型、營(yíng)養(yǎng)

16、缺陷型、溫度敏感性、形態(tài)和行為等標(biāo)志，建立了多種選擇選擇系統(tǒng)，最常用的是酶缺陷型HAT選擇培養(yǎng)法。酶缺陷型：將長(zhǎng)期培養(yǎng)系突變?yōu)镠GPRT或TK酶缺陷型的細(xì)胞系，在和正常細(xì)胞融合后，未經(jīng)融合或自身融合的骨髓瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中死亡；未融合或自身融合的正常細(xì)胞在體外生存能力有限最終也死亡。因此存活下來(lái)的只有融合細(xì)胞。營(yíng)養(yǎng)缺陷型：營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指一些細(xì)胞在合成某些營(yíng)養(yǎng)物上有缺陷，在缺乏必須營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中難以生存。將不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)胞生成雜交細(xì)胞，這些細(xì)胞通過(guò)融合后基因互補(bǔ)得以在缺乏相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)基中得以生存，而未融合細(xì)胞由于代謝受阻而死亡，由此可以將融合細(xì)胞分離出來(lái)。溫度敏感性：培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物

17、細(xì)胞可在3240之間的范圍內(nèi)存活（最適溫度為37），利用突變獲得不能在非許可溫度(如3839)中生長(zhǎng)的溫度突變型細(xì)胞，利用與溫度敏感突變細(xì)胞融合的雜交細(xì)胞，采用非許可溫度下進(jìn)行選擇培養(yǎng)，就可將融合的雜交細(xì)胞篩選出來(lái)。形態(tài)和行為標(biāo)志：若親本細(xì)胞形態(tài)明顯不同，識(shí)別異核細(xì)胞并不困難。例如，雞紅細(xì)胞與HeLa細(xì)胞融合，它們的核不僅大小和形態(tài)不同，而且雞紅細(xì)胞的核相當(dāng)濃縮；HeLa細(xì)胞核染色質(zhì)則比較彌散。由這兩種細(xì)胞融合產(chǎn)生的異核細(xì)胞，就很容易鑒別。利用細(xì)胞生長(zhǎng)或貼壁行為不同的特點(diǎn)，也可用來(lái)篩選雜種細(xì)胞。例如，雞紅細(xì)胞離體時(shí)不再生長(zhǎng)，但可與其它細(xì)胞(如HGPRT的人細(xì)胞)雜交。在HAT培養(yǎng)液中，HGPR

18、T細(xì)胞死亡，雞紅細(xì)胞也不生長(zhǎng)，只有雜種細(xì)胞增殖。3.簡(jiǎn)述單克隆抗體的制備過(guò)程及主要原理。針對(duì)某一抗原物質(zhì)A設(shè)計(jì)一個(gè)研究方案，并制備相應(yīng)的單克隆抗體。答：原理：在體液免疫反應(yīng)中，一個(gè)抗原分子上可能含有許多抗原決定簇(即表位)，每個(gè)淋巴細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生針對(duì)一個(gè)抗原決定簇的特異性抗體，若能把此B細(xì)胞由脾臟中挑出來(lái)，單獨(dú)培養(yǎng)成細(xì)胞株，則可得單一種類(lèi)的抗體，只會(huì)對(duì)一種抗原決定簇反應(yīng)，其專(zhuān)一性極高。 大量培養(yǎng)此細(xì)胞株，即可有質(zhì)量一定、純度均一的抗體，此即為單克隆抗體?；具^(guò)程：先免疫動(dòng)物，分離脾細(xì)胞，準(zhǔn)備骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備，細(xì)胞融合，篩選與克隆融合細(xì)胞，最后大量制備單克隆抗體。方案：免疫動(dòng)物：將處理好的抗原多次

19、注射到BALB/c小鼠體內(nèi)，每隔2天注射一次，第35天進(jìn)行試采血檢驗(yàn)血清中的抗體，同時(shí)可用脾內(nèi)注射培養(yǎng)基輕輕擠壓使淋巴細(xì)胞逸出的方法采集淋巴細(xì)胞（大多為B細(xì)胞）。B細(xì)胞富集：將抗原包被在培養(yǎng)板或其他基質(zhì)上，然后與脾細(xì)胞結(jié)合，那些表面具有特異性抗體的B細(xì)胞與抗原結(jié)合使得B細(xì)胞黏附于培養(yǎng)板或基質(zhì)上，輕輕洗滌除去不黏附的細(xì)胞，留下的細(xì)胞為具有特異性抗體的B細(xì)胞，骨髓癌細(xì)胞的準(zhǔn)備：用BALB/c小鼠的653。 細(xì)胞融合：用PEG誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞間進(jìn)行融合，操作在10 min 內(nèi)完成； 融合后馬上以 HAT 培養(yǎng)，能活下來(lái)的大多為 B 細(xì)胞與 骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞。未融合的骨髓瘤及骨

20、髓瘤細(xì)胞間相互融合的細(xì)胞在HAT中因DNA 合成抑制而死亡。未融合的B細(xì)胞及B細(xì)胞相互融合的細(xì)胞在體外培養(yǎng)因無(wú)法增殖會(huì)漸漸死去。使用抗原結(jié)合法對(duì)雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體專(zhuān)一性進(jìn)行篩選采用有限稀釋法或軟瓊脂法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞克隆化，獲得來(lái)自單個(gè)細(xì)胞的克??；并對(duì)單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)出的群落，再次以 ELISA 篩選專(zhuān)一性抗體，獲得可產(chǎn)生特異性抗體的單克隆細(xì)胞株。用體內(nèi)法大量制備單克隆抗體：可把篩選出來(lái)的雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生大量腹水，然后以針頭收集所產(chǎn)生的腹水，通常每次可取得35 mL左右。4.HAT的選擇原理是什么？答：HAT系統(tǒng)為次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的縮寫(xiě)。

21、它是根據(jù)嘌呤和嘧啶生物合成途徑設(shè)計(jì)的分離雜種細(xì)胞特殊的培養(yǎng)基。細(xì)胞內(nèi)核苷酸的生物合成有兩條途徑：一條是主要途徑，該途徑中葉酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氫葉酸還原酶活性，從而阻斷細(xì)胞中DNA的合成；另外一條是補(bǔ)救途徑，該途徑需要兩種酶參與。一種是HGPRT酶(次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶) ，另一種酶是TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶) 。它們可以分別利用次黃嘌呤催化產(chǎn)生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化產(chǎn)生的脫氧胸苷來(lái)合成DNA。 H、T為應(yīng)急途徑時(shí)提供外源核苷酸“前體”。在氨基喋呤存在時(shí)，阻斷了核苷酸的從頭合成IMP的途徑，細(xì)胞只能通過(guò)HGPRT使次黃嘌呤酸化形成次黃苷酸，再依次轉(zhuǎn)化為AMP及GMP

22、，即通過(guò)“補(bǔ)救途徑”依賴(lài)外源來(lái)合成核苷酸。因此，一個(gè)HGPRT或TK的細(xì)胞株不可能在含HAT的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。但這樣的細(xì)胞與能提供HGPRT或TK酶的細(xì)胞相融合，則雜交細(xì)胞能在含HAT培養(yǎng)液中存活下來(lái)。如果融合細(xì)胞的親本之一是一個(gè)能在體外長(zhǎng)期生存的骨髓瘤細(xì)胞系，而另一個(gè)親本細(xì)胞是體外增殖能力有限的正常細(xì)胞。如將長(zhǎng)期培養(yǎng)系突變?yōu)镠GPRT或TK酶缺陷型的細(xì)胞系，在和正常細(xì)胞融合后，未經(jīng)融合或自身融合的骨髓瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)液中死亡；未融合或自身融合的正常細(xì)胞在體外生存能力有限最終也死亡。因此存活下來(lái)的只有融合細(xì)胞。5.利用細(xì)胞工程制備人源性單克隆抗體的方法主要有哪些？它們的優(yōu)勢(shì)與難點(diǎn)何在？答：主要

23、有：EB病毒轉(zhuǎn)化技術(shù)，人鼠雜交瘤單克隆抗體，人人雜交瘤單克隆抗體，利用基因組工程構(gòu)建轉(zhuǎn)人Ig基因組小鼠，嚴(yán)重免疫缺陷小鼠制備人單克隆抗體。優(yōu)勢(shì)和難點(diǎn)：1、利用類(lèi)似于皰疹病毒的EB病毒在體外直接感染人外周血淋巴細(xì)胞，使之轉(zhuǎn)化獲得永生能力得到人B淋巴細(xì)胞系，這些細(xì)胞可在體外分泌人抗體。2、人鼠雜交瘤的單克隆抗體分泌性能不穩(wěn)定，多數(shù)情況下由于人染色體的丟失導(dǎo)致雜交瘤細(xì)胞失去分泌抗體的能力。3、人人雜交瘤單克隆抗體可供利用的人骨髓瘤細(xì)胞種類(lèi)非常有限，人的骨髓瘤細(xì)胞在融合率、非分泌型方面仍不及小鼠骨髓瘤細(xì)胞，而且人不能像小鼠那樣進(jìn)行高度免疫，B淋巴細(xì)胞常限于取自外周血(小鼠取自動(dòng)物脾臟)，激活狀態(tài)不適合

24、做融合；故人人雜交瘤細(xì)胞在融合、融合后的篩選以及融合細(xì)胞分泌抗體方面仍不理想。4、基因組工程構(gòu)建轉(zhuǎn)人Ig基因組小鼠：改造過(guò)的抗體除了構(gòu)成抗原識(shí)別與抗原結(jié)合部位的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是鼠源的以外，其余部分均是人源的。以后僅需免疫小鼠制作單克隆抗體，但獲得的是人抗體而非小鼠抗體。該技術(shù)難度較大，但已有成功的報(bào)道。5、嚴(yán)重免疫缺陷小鼠制備人單克隆抗體：將人免疫干細(xì)胞移植到SCID小鼠體內(nèi)，SCID小鼠獲得了人的免疫系統(tǒng)。這種小鼠可用任何抗原免疫，從激活的淋巴細(xì)胞中富集抗原特異性人源性B淋巴細(xì)胞，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞融合或制備抗體庫(kù)6.簡(jiǎn)述單克隆抗體在臨床診療中的應(yīng)用。答：理論研究，構(gòu)建B淋巴細(xì)胞雜交瘤

25、可用于分析B細(xì)胞的多樣性及其產(chǎn)生機(jī)理，并能分析免疫應(yīng)答中抗體的多樣性。利用單克隆抗體可進(jìn)行表位分析：利用單克隆抗體的交叉反應(yīng)，能幫助找出大分子之間在重要結(jié)構(gòu)和生物學(xué)上的關(guān)系，因?yàn)閷?duì)一種單克隆抗體起反應(yīng)的幾種大分子一定具有相同和相似的抗原決定簇。診斷試劑中的應(yīng)用，針對(duì)HIV、乙肝等疾病的單克隆抗體，測(cè)定妊娠的hCG單克隆抗體、測(cè)定排卵的LH單克隆抗體在市場(chǎng)上大量供應(yīng)。疾病治療上的應(yīng)用， 單克隆抗體有可能作為體內(nèi)應(yīng)用的單克隆靶向制劑的載體。第四章 哺乳動(dòng)物胚胎工程1.什么是胚胎工程？其主要內(nèi)容包括哪些？答：胚胎工程 (embryonic engineering) 是指對(duì)配子或胚胎進(jìn)行人為地干預(yù)，使

26、其環(huán)境因素、發(fā)育模式或局部組織功能發(fā)生量和質(zhì)的改變。與基因工程、細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程等一樣，是生物工程的一個(gè)分支。研究的對(duì)象主要是雌雄配子（卵和精子）以及早期胚胎。其主要內(nèi)容包括：體外受精技術(shù)，胚胎移植技術(shù)，胚胎分割技術(shù)，早期胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)，胚胎冷凍保存技術(shù)，動(dòng)物性別控制技術(shù)。2.什么是體外受精技術(shù)？它與人工授精技術(shù)有何不同？答：體外受精( IVF)是指在體內(nèi)或體外成熟的卵母細(xì)胞同體內(nèi)或體外獲能的精子，在體外環(huán)境中完成其受精的技術(shù)過(guò)程，受精卵經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)、移植后妊娠產(chǎn)仔。由于精卵結(jié)合的受精過(guò)程是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的，故又稱(chēng)為“試管動(dòng)物” (test tube animal)。包括：卵母細(xì)胞的采

27、集、卵母細(xì)胞的體外成熟、精子的獲能處理、體外受精、受精卵的體外培養(yǎng)、胚胎移植。人工授精 (AI)也稱(chēng)為人工輸精，是指通過(guò)人為的方法將動(dòng)物（或人）的新鮮或冷凍精液輸入到雌性動(dòng)物（或人）的生殖道內(nèi)，使之受孕，以代替自然交配過(guò)程。3.簡(jiǎn)述胚胎移植技術(shù)的原理與一些關(guān)鍵技術(shù)的特點(diǎn)。答：胚胎移植(embryo transfer, ET)是指一頭（只）雌性動(dòng)物（供體）發(fā)情排卵并經(jīng)配種后，在一定時(shí)間內(nèi)從其生殖道（子宮或輸卵管）取出胚胎；或者是由體外受精獲得的胚胎，然后把這些胚胎移植到另外一頭與供體同期發(fā)情，但未經(jīng)配種的受體動(dòng)物生殖道的相應(yīng)部位（子宮或輸卵管），外來(lái)胚胎在受體子宮著床并繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育，最后出生供體

28、的后代，即通常所說(shuō)的“借腹懷胎”。胚胎移植技術(shù)主要技術(shù)環(huán)節(jié)：供體動(dòng)物的超數(shù)排卵，供體、受體動(dòng)物的同步發(fā)情，供體母畜的配種或人工授精（人工輸精），胚胎的采集（包括手術(shù)回收和非手術(shù)回收），胚胎的檢查與質(zhì)量鑒定，胚胎移植（包括手術(shù)移植和非手術(shù)移植），受體動(dòng)物的觀察和飼養(yǎng)管理4.胚胎分割和胚胎嵌合技術(shù)有何不同，這些技術(shù)的原理是什么？答：胚胎分割是哺乳動(dòng)物胚胎工程的重要組成部分。胚胎分割就是將一枚胚胎通過(guò)顯微操作的方法分割為二、四或八，經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)，然后移植入受體，以獲得同卵雙胎或同卵多胎后代。也即把一枚胚胎無(wú)性繁殖為多枚，是最簡(jiǎn)單的動(dòng)物克隆方法。嵌合體技術(shù)在胚胎工程領(lǐng)域中，是指由兩枚或兩枚以上的胚

29、胎（同種或異種動(dòng)物）的全部或部分細(xì)胞聚合在一起，使之構(gòu)成一個(gè)新的胚胎，并將胚胎移植到受體動(dòng)物讓其繼續(xù)發(fā)育形成一個(gè)嵌合體后代的技術(shù)，出生的動(dòng)物具有親本動(dòng)物的全部或部分性狀。胚胎分割主要方法：A. 顯微操作儀分隔法；B. 徒手分割法嵌合體制作方法：A.卵裂球（胚胎）聚合法：該法是用兩枚或兩枚以上發(fā)育階段相同或不同的胚胎卵裂球（或胚胎）相聚合培育嵌合體個(gè)體。該方法要求相互聚合的胚胎發(fā)育時(shí)期不能相差太遠(yuǎn)，ES細(xì)胞無(wú)法用該方法得到嵌合體。B. 細(xì)胞注入法：該法是用顯微操作的方法將供胚細(xì)胞或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)注入受體胚的囊胚腔內(nèi)發(fā)育成嵌合體。該方法操作繁瑣但效率高，可以用于發(fā)育時(shí)期相差甚遠(yuǎn)的胚胎和ES細(xì)胞制作嵌合體

30、。該方法可以用來(lái)定向制作由不同來(lái)源的ICM和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞夠成的嵌合胚。 5. 制備嵌合體動(dòng)物的主要技術(shù)方法有哪些？試述其主要技術(shù)過(guò)程。答：嵌合體制作方法：A. 卵裂球（胚胎）聚合法：該法是用兩枚或兩枚以上發(fā)育階段相同或不同的胚胎卵裂球（或胚胎）相聚合培育嵌合體個(gè)體。該方法要求相互聚合的胚胎發(fā)育時(shí)期不能相差太遠(yuǎn)，ES細(xì)胞無(wú)法用該方法得到嵌合體。B. 細(xì)胞注入法：該法是用顯微操作的方法將供胚細(xì)胞或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)注入受體胚的囊胚腔內(nèi)發(fā)育成嵌合體。該方法操作繁瑣但效率高，可以用于發(fā)育時(shí)期相差甚遠(yuǎn)的胚胎和ES細(xì)胞制作嵌合體。該方法可以用來(lái)定向制作由不同來(lái)源的ICM和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞夠成的嵌合胚。主要有ICM注

31、入法和ICM重組法兩種。(1) ICM注入法通過(guò)顯微操作將供體胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM) 或分離的ICM的單個(gè)細(xì)胞注入受體的囊胚腔，以此培育成嵌合體個(gè)體。(2) ICM重組法為了解ICM的發(fā)育分化潛力及其影響因素，采用從受體囊胚中去掉原有的ICM，移入新的ICM，稱(chēng)為囊胚重組(Reconstitution of blastocyst)，或稱(chēng)ICM置換 (ICM exchange)。6、胚胎培養(yǎng)中：血清是胚胎培養(yǎng)中添加的主要蛋白質(zhì)，在保持細(xì)胞的存活、促進(jìn)生長(zhǎng)、維持細(xì)胞pH及滲透壓的穩(wěn)定、增加細(xì)胞彈性及膜的完整性方面都有重要作用。牛血清白蛋白是培養(yǎng)液中常添加的一種蛋白源物質(zhì)，牛血清白蛋白能結(jié)合培養(yǎng)液中

32、的一些胚胎毒性物質(zhì)，對(duì)胚胎有保護(hù)作用。7、 卵母細(xì)胞和胚胎的冷凍保存，廣義講，就是設(shè)法在體外或體內(nèi)把卵母細(xì)胞或胚胎暫時(shí)貯存起來(lái)而不使其失去活力。狹義講，卵母細(xì)胞和胚胎保存是指把卵母細(xì)胞和胚胎放在低于正常發(fā)育溫度下，使細(xì)胞的新陳代謝和分裂速度減慢，甚至完全停止，使其處于暫時(shí)停頓狀態(tài)；一旦恢復(fù)到正常發(fā)育溫度時(shí)，卵母細(xì)胞和胚胎又能繼續(xù)發(fā)育下去。8、卵母細(xì)胞和胚胎的超低溫冷凍保存主要有四種方法：慢速冷凍、快速冷凍、一步冷凍和玻璃化冷凍。9、 胚胎冷凍效果的鑒定：形態(tài)學(xué)鑒定、染色鑒定、培養(yǎng)鑒定、移植鑒定。10、卵母細(xì)胞和胚胎冷凍保存的意義：1、保存種資資源，對(duì)珍稀、瀕危動(dòng)物的保護(hù)具有重要意義；2、促進(jìn)胚

33、胎移植的應(yīng)用與推廣，使胚胎移植可以在任何時(shí)間、任何地點(diǎn)進(jìn)行3、實(shí)現(xiàn)了胚胎的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，解決了活體大家畜引種的困難，同時(shí)減少了疾病的傳播，促進(jìn)了國(guó)際間良種的交換；4、卵母細(xì)胞的冷凍保存為體外受精、核移植、基因轉(zhuǎn)移等技術(shù)的研究提供了充足的卵母細(xì)胞，促進(jìn)這些技術(shù)的發(fā)展。第五章 干細(xì)胞與組織工程課后習(xí)題答案1. 依據(jù)細(xì)胞的分化潛能干細(xì)胞可分為哪幾種類(lèi)型？各類(lèi)干細(xì)胞有何特性。答：依據(jù)干細(xì)胞的分化潛能，可分為三種類(lèi)型：全能性干細(xì)胞 (Totipotency Stem Cells)、多能性干細(xì)胞 (Multipotency Stem Cells)、單能干細(xì)胞 (Monopotency Stem Cells)

34、 。全能性干細(xì)胞具有形成完整個(gè)體的分化潛能；多能性干細(xì)胞具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制；單能（定向）干細(xì)胞（也稱(chēng)專(zhuān)能或偏能干細(xì)胞），這類(lèi)干細(xì)胞只能向一種類(lèi)型或密切相關(guān)的兩種類(lèi)型的細(xì)胞分化，多數(shù)的組織或器官干細(xì)胞屬于這一類(lèi)。2. 什么是胚胎干細(xì)胞？常用的胚胎干細(xì)胞分離方法有哪些？答：胚胎干細(xì)胞 (Embryonic stem cell)是指受精卵分裂發(fā)育成囊胚時(shí)，內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)(Inner Cell Mass)的細(xì)胞經(jīng)分裂培養(yǎng)，即得到胚胎干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞具有全能性，可以自我復(fù)制（或更新）并具有分化為體內(nèi)所有組織的能力。它是一種高度未分化細(xì)胞，具

35、有發(fā)育的全能性，能分化出成體動(dòng)物的所有組織和器官，包括生殖細(xì)胞。包括畸胎瘤細(xì)胞 (teratocarcinoma cells, EC)胚胎干細(xì)胞 (embryonic stem cells, ES)原始生殖細(xì)胞 (primordial germ cells, PGC或EG)。常用的胚胎干細(xì)胞分離方法有： A. 來(lái)源于早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)；B. 從原始生殖嵴分離培養(yǎng)；C. 利用體細(xì)胞核移植的方法建立；D. 利用細(xì)胞融合方法；E. 利用單個(gè)卵裂球制備胚胎干細(xì)胞；F. 來(lái)源于孤雌生殖胚胎；G. 利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)從成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生。3. 胚胎干細(xì)胞有何特性，如何驗(yàn)證胚胎干細(xì)胞的全能性？答：胚胎干細(xì)胞具

36、有全能性，可以自我復(fù)制（或更新）并具有分化為體內(nèi)所有組織的能力。胚胎干細(xì)胞的鑒定：形態(tài)學(xué)檢測(cè)：細(xì)胞呈圓形、核大、胞漿少；細(xì)胞排列緊密，呈集落形生長(zhǎng)；集落常呈島狀、巢狀。遺傳學(xué)檢測(cè)：為正常的二倍體核型；酶活性檢測(cè)：ES細(xì)胞內(nèi)端粒酶和堿性磷酸酶活性高；細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)：ES細(xì)胞膜表面有特殊的標(biāo)記：如， OCT-4， SSEA-3, SSEA-4等；體內(nèi)分化潛能： 植入裸鼠皮下，可誘發(fā)形成畸胎瘤；可分化為三個(gè)胚層的細(xì)胞；能參與嵌合體的形成；體外分化潛能：可形成類(lèi)胚體，可在體外誘導(dǎo)分化為三個(gè)胚層的細(xì)胞。4. 什么是成體干細(xì)胞的可塑性？成體干細(xì)胞的可塑性有何用途？答：來(lái)源于各種組織的成體干細(xì)胞事實(shí)上并

37、未定型，它們的分化潛能遠(yuǎn)較先前所認(rèn)為的要寬，一旦處于一個(gè)新的微環(huán)境中，它們將有可能分化為其它類(lèi)型的細(xì)胞；干細(xì)胞生物學(xué)家們將這種現(xiàn)象稱(chēng)為成體干細(xì)胞的“可塑性” (plasticity)，也有人稱(chēng)為干細(xì)胞的“橫向分化”或“跨系分化” (transdifferentiation)。 成體干細(xì)胞的可塑性給干細(xì)胞生物學(xué)的研究注入了新的活力。與胚胎性干細(xì)胞相比，它避開(kāi)了胚胎干細(xì)胞研究所面臨得倫理道德問(wèn)題，吸引了更多的人力和財(cái)力，有關(guān)它的研究報(bào)道也日益增多。第六章 核移植與動(dòng)物克隆1.簡(jiǎn)述細(xì)胞核移植技術(shù)的主要類(lèi)型及其主要操作技術(shù)。答：細(xì)胞核移植(nuclear transfer 或nuclear trans

38、plantation)是指通過(guò)顯微操作的方法，將供體細(xì)胞的細(xì)胞核放入預(yù)先去核的成熟卵母細(xì)胞或早期合子內(nèi)，形成一個(gè)新的核質(zhì)重組體，移入的核在受體胞質(zhì)的作用下，發(fā)生發(fā)育程序重編 (reprogramming)，使得核質(zhì)重組體與正常受精卵一樣，經(jīng)細(xì)胞分裂、分化并在母體內(nèi)發(fā)育成一個(gè)新的個(gè)體。 依據(jù)供體細(xì)胞類(lèi)型分為：胚胎細(xì)胞核移植、胚胎干細(xì)胞核移植、體細(xì)胞核移植；依據(jù)供體細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞的來(lái)源分為：同種核移植、種間核移植 。主要操作技術(shù)：1. 受體卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備：超數(shù)排卵、活體采卵、屠宰后母畜卵巢上采卵（體外成熟）2. 供體細(xì)胞的準(zhǔn)備：16-32 期胚胎、供體卵裂球。3. 卵母細(xì)胞的去核與注射4. 重

39、組胚的融合：構(gòu)建的重組體用直流電脈沖進(jìn)行電融合5. 重組胚的激活：電激活、乙醇激活、鈣離子和鈣離子載體激活、離子霉素(ionomycin)激活、Sr2+ 激活6. 重組胚的培養(yǎng)與胚胎移植。2.討論核移植技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀及其發(fā)展前景？答:1. 體細(xì)胞克隆在生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用;2. 體細(xì)胞克隆技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用;3. 商業(yè)性克隆動(dòng)物;4. 體細(xì)胞克隆在珍稀、瀕危動(dòng)物保護(hù)中的應(yīng)用;5. 體細(xì)胞克隆在人類(lèi)再生醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用;6. 體細(xì)胞克隆在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用3.分析影響動(dòng)物核移植成敗的關(guān)鍵因素。答：影響體細(xì)胞核移植成功率的因素有：供體細(xì)胞的因素；受體卵母細(xì)胞的因素；核移植方法的影響；激活方

40、法的影響；體外培養(yǎng)系統(tǒng)的影響；受體動(dòng)物管理及胚胎移植的影響；新生動(dòng)物護(hù)理及管理的影響。第7章 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1、 什么是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物？答： 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 (trnasgenic animal)：是指借用基因工程技術(shù)將外源基因?qū)雱?dòng)物染色體內(nèi)，使外源基因與動(dòng)物基因整合后隨細(xì)胞的分裂而擴(kuò)增，在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)并能穩(wěn)定地遺傳給后代的動(dòng)物。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法主要有原核(顯微)注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法、精子載體導(dǎo)入法、細(xì)胞核移植法等，應(yīng)用較多的方法為原核（顯微）注射法。 2、 制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有哪些主要方法？簡(jiǎn)述其主要原理和技術(shù)過(guò)程。試比較這些方法的優(yōu)劣。答：主要有：生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法

41、主要有原核(顯微)注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法、精子載體導(dǎo)入法、細(xì)胞核移植法等，應(yīng)用較多的方法為原核（顯微）注射法。 顯微注射法：基本原理通過(guò)顯微注射儀將外源基因直接注射到受精卵的雄原核內(nèi)，使使外源基因整合到DNA中，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。步驟：目的基因的制備與純化；卵供體母體和假孕母體的準(zhǔn)備；超排卵與取卵；基因顯微注射；受精卵移植；目的基因的表達(dá)整合鑒定和檢測(cè)；建系。優(yōu)點(diǎn)：外源DNA分子大小基本不受限制，外源DNA在宿主動(dòng)物染色體上整合率高，方法相對(duì)簡(jiǎn)單，導(dǎo)入直觀。但利用DNA顯微注射法得到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物都是隨機(jī)整合的，用該方法很難得到同源重組動(dòng)物。逆轉(zhuǎn)錄病毒法；P144 胚胎干細(xì)胞

42、轉(zhuǎn)導(dǎo)法；P145 精子載體法；P145 細(xì)胞核移植法P1453、追蹤轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的發(fā)展，并預(yù)測(cè)其應(yīng)用前景。答：自1981年，第一次成功地將外源基因?qū)雱?dòng)物胚胎，創(chuàng)立了轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物技術(shù)。1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)入大鼠的生長(zhǎng)激素基因，使小鼠體重為正常個(gè)體的二倍，因而被稱(chēng)為超級(jí)小鼠。以后相繼在10年間報(bào)道過(guò)轉(zhuǎn)基因兔、綿羊、豬、魚(yú)、昆蟲(chóng)、牛、雞、山羊、大鼠等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功。由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體系打破了自然繁殖中的種間隔離，使基因能在種系關(guān)系很遠(yuǎn)的機(jī)體間流動(dòng)，它將對(duì)整個(gè)生命科學(xué)產(chǎn)生全局性影響。因此轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)在1991年第一次國(guó)際基因定位會(huì)議上被公認(rèn)是遺傳學(xué)中繼連鎖分析、體細(xì)胞遺傳和基因克隆之后的

43、第四代技術(shù)，被列為生物學(xué)發(fā)展史上126年中第14個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)。應(yīng)用前景：改良動(dòng)物的性狀，培育新品種制作“生物反應(yīng)器”，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白基因治療和建立人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型，生產(chǎn)人類(lèi)器官移植的代用品，基因治療，基礎(chǔ)理論研究中的應(yīng)用(1). 基因表達(dá)與調(diào)控研究(2). 基因功能的研究5、 動(dòng)物克隆技術(shù)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合將發(fā)揮哪些特殊的優(yōu)勢(shì)？6、 簡(jiǎn)述主要胚胎工程技術(shù)間的聯(lián)系。7、 簡(jiǎn)述近年來(lái)動(dòng)物細(xì)胞工程方面的重大研究進(jìn)展，說(shuō)明其意義何在？第八章 動(dòng)物染色體工程1、什么是染色體工程？動(dòng)物染色體工程主要包括哪些內(nèi)容？答：染色體工程(chromosome engineering)是人們按照一定的設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地應(yīng)用染色

44、體組合并、單條染色體或染色體片段的附加、代換、消除和易位等技術(shù)，實(shí)施對(duì)生物的染色體組或染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，從而達(dá)到定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術(shù)。動(dòng)物染色體工程主要包括：人工誘導(dǎo)多倍體，指每個(gè)體細(xì)胞中含有三個(gè)或更多染色體組的個(gè)體而言。由于多倍體動(dòng)物具有生長(zhǎng)速度快，成活率高及抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，所以人工誘導(dǎo)多倍體、改善動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀倍受重視。雌核發(fā)育，是單性生殖的一種，指卵子依靠自己的細(xì)胞核發(fā)育成個(gè)體的生殖行為。雄核發(fā)育，是指通過(guò)物理和化學(xué)等方法破壞卵核的遺傳物質(zhì)，使其失去活性，依靠精子核發(fā)育成胚胎的生殖方式。人工染色體，基于ARS、CEN、TEL是線(xiàn)性染色體穩(wěn)定的功能序列，人們利用這些序列構(gòu)建載體，重組后的DNA以線(xiàn)性狀態(tài)存在，這樣不僅穩(wěn)定，而且大大提高了插入外源基因的能力，并且可以像天然染色體一樣在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制和遺