合成生物學(xué)中那些不得不說的技術(shù)

1、生物技術(shù)132孟慶猛合成生物學(xué)中那些不得不說的技術(shù)20 世紀(jì)的生物學(xué)研究一直著眼于對(duì)生物系統(tǒng)的不斷分解，解剖至細(xì)胞中單個(gè)蛋白或基因，研究其結(jié)構(gòu)和功能來解釋生命現(xiàn)象。但隨著當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，以系統(tǒng)化設(shè)計(jì)和工程化構(gòu)建為理念的合成生物學(xué)成為新一代生物學(xué)的發(fā)展方向。合成生物學(xué)旨在對(duì)多種天然的或人工設(shè)計(jì)的生物學(xué)元件進(jìn)行合理而系統(tǒng)的組合以獲得重構(gòu)的或非天然的“生物系統(tǒng)”，其涵蓋的研究?jī)?nèi)容可以大體分為 3 個(gè)層次：一是利用已知功能的天然生物模體（motif）或模塊（module）構(gòu)建成新型調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并表現(xiàn)出新功能；二是采用從頭合成（de novo synthesis）的方法，人工合成基因組 DNA

2、 并重構(gòu)生命體；第三個(gè)層次則是在前兩個(gè)研究領(lǐng)域得到充分發(fā)展之后，創(chuàng)建完整的全新生物系統(tǒng)乃至人工生命體（artificial life）。合成生物學(xué)強(qiáng)調(diào)利用工程化的設(shè)計(jì)理念，實(shí)現(xiàn)從元件到模塊再到系統(tǒng)的“自下而上”設(shè)計(jì)。利用生物系統(tǒng)最底層的 DNA、RNA、蛋白質(zhì)等作為設(shè)計(jì)的元件，利用轉(zhuǎn)錄調(diào)控、代謝調(diào)控等生物功能將這些底層元件關(guān)聯(lián)起來形成生物模塊，再將這些模塊連接成系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)所需的功能。這是一門涉及微生物學(xué)、分子生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、遺傳工程、材料科學(xué)以及計(jì)算科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的綜合性交叉學(xué)科。它有別于傳統(tǒng)的基因工程，其目的在于組裝各種生命元件來建立人工生物體系，讓它們能像電路一樣在生物體內(nèi)運(yùn)行，使生物

3、體能按預(yù)想的方式完成各種生物學(xué)功能。合成生物學(xué)的最高境界是靈活設(shè)計(jì)和改造生命，重塑生命體。 本文就目前合成生物學(xué)采用的關(guān)鍵技術(shù)和研究應(yīng)用進(jìn)展兩方面進(jìn)行綜述。 基因組的人工合成技術(shù) 2010 年 5 月 20 日，Science 報(bào)道了 Venter 研究組采用化學(xué)方法合成了一個(gè) 1.08 Mb 的蕈狀支原體基因組，并將其移植入一個(gè)山羊支原體受體細(xì)胞，從而創(chuàng)造了一個(gè)僅由合成基因組控制的新的蕈狀支原體細(xì)胞。這項(xiàng)成果在合成生物學(xué)的發(fā)展史中具有里程碑的意義。在此之前，也有許多基因組合成的成功報(bào)道。2002 年，紐約州立大學(xué) Wimmer 實(shí)驗(yàn)室合成了脊髓灰質(zhì)炎病毒，這是人類歷史上第一個(gè)人工合成的病毒。

4、多年來，Venter 等一直致力于合成基因組的研究。2003 年，合成了長(zhǎng)達(dá) 5386 bp 的 X174 噬菌體基因組，實(shí)現(xiàn)了用寡核苷酸合成的方法精確合成了 5 6 kb 的 DNA 序列；2008 年，Venter 實(shí)驗(yàn)室又合成了生殖支原體基因組，該基因組全長(zhǎng) bp，是已知的生物體中獨(dú)立生存的最小基因組；2010 年 10 月他們又發(fā)明了迄今最簡(jiǎn)單有效的基因合成技術(shù)，并以此合成了實(shí)驗(yàn)小鼠的線粒體基因組。Dymond 等的研究更進(jìn)了一步，他們于 2011 年報(bào)道成功設(shè)計(jì)合成了釀酒酵母的部分染色體，這是釀酒酵母基因組人工合成計(jì)劃（SC2.0 Project）取得的第一個(gè)成果，該項(xiàng)目的最終目標(biāo)是

5、人工合成構(gòu)建釀酒酵母基因組。酵母基因組人工合成將是合成生物學(xué)發(fā)展史上又一重要的里程碑。 DNA 合成是支撐合成生物學(xué)發(fā)展的核心技術(shù)，它不依賴于 DNA 模板，可根據(jù)已知的 DNA 序列直接合成，在基因及生物元件的合成、基因回路和生物合成途徑的重新設(shè)計(jì)組裝，以及全基因組的人工合成中發(fā)揮重大作用。由于化學(xué)合成的 DNA 片段長(zhǎng)度有限，要合成長(zhǎng)的 DNA 片段需要先合成短的寡核苷酸，然后再將寡核苷酸進(jìn)行拼接。因此，基因組合成的基本思路為：按照原始基因組序列設(shè)計(jì)合成寡核苷酸；利用各種方法將寡核苷酸拼接成較長(zhǎng)的 DNA 序列；以較長(zhǎng)的序列為基礎(chǔ)，進(jìn)一步拼接得到更長(zhǎng)的 DNA 序列，拼接成完整的基因組；將

6、合成的基因組移植到細(xì)胞中，并驗(yàn)證其功能。 1、 寡核苷酸的合成 目前寡核苷酸一般采用固相亞磷酰胺三酯法合成。寡核苷酸的長(zhǎng)度是一個(gè)重要的參數(shù)，隨著長(zhǎng)度的延長(zhǎng)，產(chǎn)率下降，純度也降低，積累的合成錯(cuò)誤大大增加。較短的寡核苷酸會(huì)有較少的錯(cuò)誤，但是需要增加組裝所需的重疊序列，使合成成本增加。使用 60-mer 的寡核苷酸，可以最大程度地降低錯(cuò)配率和生產(chǎn)成本。 2、 由寡核苷酸拼接成較長(zhǎng)的 DNA 片段 寡核苷酸可以通過各種方法拼接成幾百 bp 到幾千 bp 的 DNA 片段。常用的體外拼接方法有以下兩種：連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ligase chain reaction，LCR）和快速聚合酶鏈?zhǔn)浇M裝法（polym

7、erase chain assembly，PCA）。LCR 法利用 Taq 連接酶將首尾相連、重疊雜交的寡核苷酸片段連接起來，連接反應(yīng)在較高溫度下進(jìn)行，因而可以排除 DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的干擾；但是基因合成的成本大大 增加。PCA 法是兩條具有部分重疊的寡核苷酸互為引物互為模板進(jìn)行聚合酶的延伸，延伸得到的序列再通過與其他寡核苷酸退火、延伸，進(jìn)行多次循環(huán)后，最終合成目的序列。PCA 法合成成本較連接酶法大大降低。這種方法逐漸得到廣泛使用，并且衍生出一系列的 DNA拼接方法，包括 TBIO 法（thermodynamically balanced inside-out）、雙重不對(duì)稱 PCR（dual

8、asymmetric PCR）、重疊延伸 PCR（overlap extension PCR，OE-PCR）和連續(xù) PCR 等。此外，Venter 小組報(bào)道將兩端帶有重疊序列的寡核苷酸片段和載體轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，利用酵母體內(nèi)的同源重組可以拼接起來并克隆到載體上，可以實(shí)現(xiàn) 38 個(gè)寡核苷酸片段同時(shí)拼接。 3、 DNA 大片段和基因組的組裝 利用 LCR 和 PCA 法一般可將寡核苷酸拼接成幾千 bp 以下的基因序列。更長(zhǎng)的大片段和基因組 DNA 則需要進(jìn)一步拼接。常用的拼接方法有以下幾種：利用限制性內(nèi)切酶和連接酶的連接 這是最簡(jiǎn)單的方法，通過連接將片段連成全長(zhǎng)。但是當(dāng)進(jìn)行多個(gè) DNA 片段連接時(shí)，

9、往往很難找到合適的酶切位點(diǎn)，而且連接片段會(huì)有幾個(gè)堿基的殘留，因此該方法在多個(gè) DNA 片段連接時(shí)有很大的局限性。合成生物學(xué)中的 Biobrick 連接法巧妙地設(shè)計(jì)了 4 個(gè)限制性內(nèi)切酶，通過酶切連接可以將 DNA 片段拼接起來。還有一種篩選連接法（ligation by selection，LBS），使用 IIs 型限制性內(nèi)切酶 Bsa I 和 Bbs I，并通過抗性篩選實(shí)現(xiàn)無痕拼接。Kodumal 等利用這種方法最終組裝成了 32 kb 長(zhǎng)的聚酮合酶基因簇?；谥丿B序列和聚合酶延伸的方法 包括重疊延伸 PCR（OE-PCR）法和環(huán)形聚合酶延伸法（circular polymerase ext

10、ension cloning，CPEC）。 OE-PCR 法是相鄰的具有重疊序列的 DNA 片段變性退火后形成互補(bǔ)雙鏈，通過 DNA聚合酶進(jìn)行延伸，再利用末端引物將其擴(kuò)增出來。該方法方便有效，但依賴于聚合酶的高保真度，合成的大片段長(zhǎng)度有限，約在 20 kb 以下。CPEC 法原理與 OE-PCR 類似，但是不需要擴(kuò)增引物，可將多個(gè)相互重疊的 DNA 片段與載體一步連接成完整的環(huán)狀質(zhì)粒，然后直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。不依賴于基因序列和連接反應(yīng)的克隆方法利用 T4 DNA 聚合酶在無 dNTPs 的情況下發(fā)揮的 3 5 外切酶活性，能將 DNA 片段消化產(chǎn)生含有同源序列的 5-ssDNA 突出

11、端（15 30 個(gè)堿基），DNA 片段之間及 DNA 與載體依靠同源序列退火，形成環(huán)狀中間體，直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞，利用大腸桿菌本身的修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)成完整的環(huán)狀質(zhì)粒。這種克隆方法不需要連接酶，也不需要考慮插入片段的序列，可實(shí)現(xiàn)多個(gè) DNA 片段的一次性連接重組，用途非常廣泛。國(guó)外公司已經(jīng)開始將其用于商業(yè)，比如 Novagen 公司的 Radiance TM系統(tǒng)及 Invitrogen 公司 GatewayTM 系統(tǒng)都是基于此技術(shù)的原理開發(fā)的。Schmid-Burgk 等對(duì)不依賴于基因序列和連接反應(yīng)的克隆方法（sequence and ligation- independent cloning， SLIC

12、）進(jìn)行了改進(jìn)，設(shè)計(jì)一段特殊序列，但是這種方法會(huì)在連接序列中引入多余的堿基，適用于基因之間的拼接，可用于合成生物學(xué)中基因回路的構(gòu)建及生物途徑的組裝。 Gibson 等溫一步拼接法 該法是 SLIC 法的延伸。選用核酸外切酶、DNA 聚合酶和 DNA 連接酶 3 種酶進(jìn)行拼接。相鄰的具有重疊序列的片段，加入上述 3 種酶和 dNTPs 共同孵育。核酸外切酶能從 5降解核苷酸，且不與 DNA 聚合酶競(jìng)爭(zhēng)。雙鏈 DNA 被消化產(chǎn)生突出的單鏈 DNA，重疊序列特異性退火，此時(shí)，外切酶逐漸熱失活。DNA 聚合酶和 DNA 連接酶修復(fù)連接成完整的雙鏈 DNA 分子，從而實(shí)現(xiàn)無痕拼接。Gibson 等利用此方

13、法成功地將 4 個(gè)大于 100 kb 的片段在體外組裝成完整的 583 kb 的生殖支原體基因組。此外，他們還嘗試將 600 個(gè)長(zhǎng) 60-mers 的寡核苷酸（寡核苷酸之間帶有 20 個(gè)重疊序列）成功地合成了小鼠的線粒體基因組（16.3 kb）。這種方法方便、快速、高效，能組裝長(zhǎng)達(dá) 900 kb 的 DNA 大片段，而且出錯(cuò)率會(huì)大大降低。體外重組拼接一般選用細(xì)菌人工染色體（BAC）為載體，但是當(dāng) DNA 片段達(dá)到一定長(zhǎng)度時(shí)（約 300 kb），BAC 在大腸桿菌中不穩(wěn)定，達(dá)到轉(zhuǎn)化的極限，更大的片段需要在微生物體內(nèi)進(jìn)行重組。酵母體內(nèi)同源重組拼接法 利用酵母細(xì)胞內(nèi)高效的同源重組系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)多個(gè)相互存

14、在同源序列的 DNA 片段的組裝。Venter 研究組在 2008 年的 Mycoplasma genitalium JCVI-1.0（ bp）基因組合成中最后一步拼接就是在釀酒酵母中完成的2。雖然利用體外重組系統(tǒng)可以組裝成完整的基因組，但是 BAC 載體在大腸桿菌內(nèi)不穩(wěn)定，為此他們建立了轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的重組克隆方法（transformation-associated recombination，TAR），利用酵母人工染色體（YAC）能大大提高穩(wěn)定性及 TAR 克隆效率。TAR 載體與 1/4 基因組片段同時(shí)轉(zhuǎn)化到酵母中，這些片段之間的重疊序列使它們發(fā)生同源重組。由于 YAC 帶有著絲粒、自主復(fù)制序

15、列及篩選標(biāo)記，因此不需整合到酵母染色體中進(jìn)行重組，通過設(shè)計(jì)同源臂可以得到環(huán)狀的完整的基因組，便于與酵母染色體分離。同樣地，Venter 研究組利用酵母同源重組完成 1078 條平均 1080 bp 的 DNA 片段的組裝，最終合成了 1.08 Mb 的 M. mycoides JCVI-syn1.0 基因組。選用 Ycp 型的酵母-大腸桿菌穿梭載體，在酵母體內(nèi)拼接，然后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增。酵母同源重組拼接法是目前報(bào)道的最高效的組裝 DNA 大片段的方法，在合成更長(zhǎng)的 DNA 如細(xì)菌基因組時(shí)有很大的優(yōu)勢(shì)。但隨著要組裝的片段不斷延長(zhǎng)，要合成比酵母還大的基因組時(shí)，這種方法是否可行還不清

16、楚。綜上，幾種常用的大片段和基因組 DNA 組裝方法。4、 基因組的移植 基因組合成以后，需要人工轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，實(shí)現(xiàn)其功能，這是一項(xiàng)非常有挑戰(zhàn)的工作。體外有一些方法可以用來將基因組導(dǎo)入細(xì)胞，包括電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、使用基因槍等。Venter 研究組在完成基因組的人工合成之前進(jìn)行了大量的探索，首先獲得了不含蛋白的完整 M. mycoides 基因組，并采用 PEG 介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將其移植到 M. capricolum 中，通過四環(huán)素抗性篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞，最終得到了與供體菌表型相同的細(xì)胞13。但是當(dāng)組裝完 M. mycoides 基因組后，從酵母中分離出完整基因組后轉(zhuǎn)化到 M

17、. capricolum 中，開始并沒有得到任何移植成功的細(xì)胞，經(jīng)過分析可能是由于 M. mycoides 和 M. capricolum 共用同一套限制酶系統(tǒng)，其基因組是經(jīng)甲基化修飾的。而在酵母體內(nèi)拼接后的基因組是沒有甲基化的，需在體外用甲基化酶進(jìn)行修飾，或者破壞 M. capricolum 的限制性內(nèi)切酶基因，從而避免受體細(xì)胞限制酶系統(tǒng)的阻礙。最終將合成基因組移植入 M. capricolum 體內(nèi)，得到由合成 DNA 控制的人工細(xì)胞。5、 基因組合成中的錯(cuò)誤糾正 在基因組合成過程中，由于合成方法本身的限制，不可避免地會(huì)引入錯(cuò)誤堿基，而且在 DNA 組裝過程中用到的 PCR 等方法也會(huì)引入突變。為了得到高保真的合成 DNA，必須對(duì)錯(cuò)誤和突變進(jìn)行糾正，這是個(gè)耗時(shí)耗力的過程?？梢允褂玫募m錯(cuò)方法有： 修飾、標(biāo)記和分離錯(cuò)配的核苷酸從而可以防止擴(kuò)增錯(cuò)誤的 DNA；使用核酸酶來識(shí)別和剪切 DNA 中