微生物藥物產(chǎn)生菌菌種的保藏與質(zhì)量控制

1、微生物藥物產(chǎn)生菌的保藏和質(zhì)量控微生物藥物產(chǎn)生菌的保藏和質(zhì)量控 制制 2 微生物藥物產(chǎn)生菌微生物藥物產(chǎn)生菌 微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理 微生物藥物產(chǎn)生菌微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化菌種退化 微生物藥物產(chǎn)生菌微生物藥物產(chǎn)生菌菌種保藏與質(zhì)量控制菌種保藏與質(zhì)量控制 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 微生物藥物產(chǎn)生菌微生物藥物產(chǎn)生菌主要包括細(xì)菌、放線 菌和真菌。被描述的微生物藥物大約近 兩萬(wàn)種。 抗細(xì)菌:青霉素(Penicillin) P. notatum 降血脂:他汀類(Statins) P. brevicompactum, A. terreus, Monascus ruber 免疫抑制劑:環(huán)孢素(

2、Cyclosporin A) Tolypocladium inflatum 抗真菌:棘白霉素類(Echinocandins) A. nidulans 一、微生物藥物產(chǎn)生菌微生物藥物產(chǎn)生菌 實(shí)驗(yàn)室必須建立和保存其所有菌種的進(jìn)出、收集、貯藏、確認(rèn)試驗(yàn)以及銷毀 的記錄，應(yīng)有菌種管理的程序文件2015中國(guó)藥典 標(biāo)準(zhǔn)菌種的申購(gòu)記錄； 從標(biāo)準(zhǔn)菌株到工作菌株操作及記錄； 菌種必須定期轉(zhuǎn)種傳代，并做純度、特性等實(shí)驗(yàn)室所需關(guān)鍵指標(biāo)的確認(rèn)，并記錄； 每支菌種都應(yīng)注明其名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期、傳代數(shù)； 菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件； 菌種保藏的位置和條件； 其他需要的程序. 二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理二、微生物藥物

3、產(chǎn)生菌菌種管理 二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理 對(duì)對(duì) 活活 純純 性狀穩(wěn)定性狀穩(wěn)定 微生物菌種實(shí)物管理 微生物菌種信息管理 保證菌種實(shí)物與信息的一致性 菌種菌種 一致一致 菌種相關(guān)信息菌種相關(guān)信息 入庫(kù)入庫(kù)菌株菌株菌種基本信息數(shù)據(jù)庫(kù)菌種基本信息數(shù)據(jù)庫(kù) 保菌方法的研究保菌方法的研究 與完善與完善 確定保藏方式確定保藏方式 -80 -80 低溫凍結(jié)、冷低溫凍結(jié)、冷 凍干燥、液氮保藏凍干燥、液氮保藏 實(shí)物庫(kù)實(shí)物庫(kù) 出庫(kù)出庫(kù) 錄入相關(guān)保藏過程錄入相關(guān)保藏過程 信息如保護(hù)劑、凍干曲線等信息如保護(hù)劑、凍干曲線等 菌種入庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)菌種入庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù) 入庫(kù)信息錄入入庫(kù)信息錄入 菌種入庫(kù)實(shí)物

4、庫(kù)管理菌種入庫(kù)實(shí)物庫(kù)管理 出庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)出庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù) 菌種實(shí)物菌種實(shí)物 入庫(kù)入庫(kù) 復(fù)核復(fù)份 用戶 一致一致 一致一致 純度檢測(cè)純度檢測(cè) 和復(fù)核鑒定等分類鑒定和復(fù)核鑒定等分類鑒定 審核審核 實(shí)物管理 信息管理 二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理 菌種的來(lái)源 應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株， 使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株。 -2015版中國(guó)藥典 菌種菌種 一致一致 菌種相關(guān)信息菌種相關(guān)信息 擬入庫(kù)擬入庫(kù)菌株菌株菌種基本信息數(shù)據(jù)庫(kù)菌種基本信息數(shù)據(jù)庫(kù) 保菌方法的研究保菌方法的研究 與完善與完善 確定保藏方式確定保藏方式 -80 -80 低溫凍結(jié)、

5、冷低溫凍結(jié)、冷 凍干燥、液氮保藏凍干燥、液氮保藏 實(shí)物庫(kù)實(shí)物庫(kù) 出庫(kù)出庫(kù) 錄入相關(guān)保藏過程錄入相關(guān)保藏過程 信息如保護(hù)劑、凍干曲線等信息如保護(hù)劑、凍干曲線等 菌種入庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)菌種入庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù) 入庫(kù)信息錄入入庫(kù)信息錄入 菌種入庫(kù)實(shí)物庫(kù)管理菌種入庫(kù)實(shí)物庫(kù)管理 出庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)出庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù) 菌種實(shí)物菌種實(shí)物 入庫(kù)入庫(kù) 復(fù)核復(fù)份 用戶 一致一致 一致一致 純度檢測(cè)純度檢測(cè) 和復(fù)核鑒定等分類鑒定和復(fù)核鑒定等分類鑒定 審核審核 實(shí)物管理 信息管理 純度檢測(cè)和復(fù)核純度檢測(cè)和復(fù)核 純度檢測(cè)和復(fù)核純度檢測(cè)和復(fù)核 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株 工作菌株 純度檢測(cè)和復(fù)核純度檢測(cè)和復(fù)核 使用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌 株制備工作菌株 標(biāo)

6、準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇、復(fù)壯或培養(yǎng)物的制備應(yīng)按供應(yīng)商提供的說明或按已驗(yàn) 證的方法進(jìn)行; 標(biāo)準(zhǔn)菌株如果經(jīng)過確認(rèn)試驗(yàn)證明已經(jīng)老化、退化、變異、污染等或該菌 株已無(wú)使用需要時(shí)，應(yīng)及時(shí)滅菌銷毀； 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn)。 -2015版中國(guó)藥典 二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理 菌種菌種 一致一致 菌種相關(guān)信息菌種相關(guān)信息 擬入庫(kù)擬入庫(kù)菌株菌株菌種基本信息數(shù)據(jù)庫(kù)菌種基本信息數(shù)據(jù)庫(kù) 保菌方法的研究保菌方法的研究 與完善與完善 確定保藏方式確定保藏方式 -80 -80 低溫凍結(jié)、冷低溫凍結(jié)、冷 凍干燥、液氮保藏凍干燥、液氮保藏 實(shí)物庫(kù)實(shí)物庫(kù) 出庫(kù)出庫(kù) 錄入相關(guān)保藏過程錄入相關(guān)保藏過程

7、 信息如保護(hù)劑、凍干曲線等信息如保護(hù)劑、凍干曲線等 菌種入庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)菌種入庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù) 入庫(kù)信息錄入入庫(kù)信息錄入 菌種入庫(kù)實(shí)物庫(kù)管理菌種入庫(kù)實(shí)物庫(kù)管理 出庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)出庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù) 菌種實(shí)物菌種實(shí)物 入庫(kù)入庫(kù) 復(fù)核復(fù)份 用戶 一致一致 一致一致 純度檢測(cè)純度檢測(cè) 和復(fù)核鑒定等分類鑒定和復(fù)核鑒定等分類鑒定 審核審核 實(shí)物管理 信息管理 微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化 微生物藥物產(chǎn)生菌經(jīng)過多次傳代或長(zhǎng)期保持 菌種的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)良特性逐步減退或消失， 稱為微生物藥物產(chǎn)生菌菌種的退化。 三、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化 在實(shí)際生產(chǎn)中，培養(yǎng)條件的變化也會(huì)導(dǎo) 致菌種形態(tài)和生理上的變化，但是只要培 養(yǎng)條件恢

8、復(fù)正常，菌種原有性能就能恢復(fù) 正常，因此培養(yǎng)條件引起的菌種變化是不 能稱為菌種退化的。 藥用微生物產(chǎn)生菌菌種退化的鑒別 微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化 微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化主要表現(xiàn)在微生物 的形態(tài)、生理特性及微生物藥物生產(chǎn)能力等方 面的變化： 1.細(xì)胞形態(tài)改變，產(chǎn)孢子能力下降。 2.培養(yǎng)特征異常，典型性狀變?yōu)椴坏湫汀?3.對(duì)不良環(huán)境如低溫、高溫條件或噬菌體的侵 染的抵抗力下降。 4.營(yíng)養(yǎng)需求發(fā)生改變。 5.在生產(chǎn)上常見的退化現(xiàn)象有：微生物藥物生 產(chǎn)能力下降，生產(chǎn)的速度變慢。 三、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化 防止微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化的方法 三、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化微生

9、物藥物產(chǎn)生菌菌種退化 1.控制轉(zhuǎn)接傳代次數(shù) 2.采用良好的培養(yǎng)條件 3.采用有效保藏方法 微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化的原因菌種退化的原因 1.自發(fā)突變與回復(fù)突變 2.細(xì)胞本身自我調(diào)節(jié)和修復(fù) 3.環(huán)境條件的影響 適合的菌種保藏方法保證菌種的存活適合的菌種保藏方法保證菌種的存活 并防止菌種退化并防止菌種退化 冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法 -80-80度度低溫冷凍法低溫冷凍法 液氮超低溫保藏法液氮超低溫保藏法 四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制質(zhì)量控制-保藏方法保藏方法 低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低 溫冷凍（低于-30）等方法保存； 低于-70或低溫冷凍干燥方法可 以延長(zhǎng)菌種保存時(shí)間

10、。 -2015版 中國(guó)藥典 四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制質(zhì)量控制-保藏方法保藏方法 冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法 冷凍干燥保藏法是將菌種懸液在凍結(jié)狀態(tài)下升華其中的水分, 使得菌種處于干燥、低溫和缺氧的條件下，從而得以長(zhǎng)期保 存的菌種保藏法。 原理：將含水量大的微生物菌種預(yù)先冷凍在真空條件下利用 升華現(xiàn)象除去水分，細(xì)胞的生理活動(dòng)趨于停止，從而能夠長(zhǎng) 期維持生活狀態(tài)。 適用范圍：大多數(shù)細(xì)菌和放線菌。部分真菌和酵母菌。 優(yōu)點(diǎn)：保存時(shí)間長(zhǎng)、輸送、貯存方便等優(yōu)點(diǎn)。 缺點(diǎn)：冷凍干燥過程對(duì)細(xì)胞有損傷,操作步驟繁多，需要一 定設(shè)備。 四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制

11、質(zhì)量控制-保藏方法保藏方法 冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法 四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制質(zhì)量控制-保藏方法保藏方法 安瓿管準(zhǔn)備安瓿管準(zhǔn)備 酸洗酸洗 水洗水洗 蒸餾水蒸餾水 洗洗 加標(biāo)簽及棉加標(biāo)簽及棉 塞塞 滅菌滅菌 菌種菌種 制備菌制備菌 液液 培養(yǎng)培養(yǎng) （固體或液（固體或液 體）體） 分裝安瓿管分裝安瓿管 安瓿管預(yù)凍安瓿管預(yù)凍 冷凍干燥開冷凍干燥開 始始 適當(dāng)升溫（促進(jìn)適當(dāng)升溫（促進(jìn) 干燥）干燥） 凍干結(jié)束凍干結(jié)束 安瓿管封口安瓿管封口 檢查真空度檢查真空度 保護(hù)劑的選擇與準(zhǔn)保護(hù)劑的選擇與準(zhǔn) 備備 分裝分裝 滅菌滅菌 保藏（低溫避光）保藏（低溫避光） 冷凍干燥過程的影響

12、因素冷凍干燥過程的影響因素 四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制質(zhì)量控制-保藏方法保藏方法 冷凍干燥保藏法的影響因素冷凍干燥保藏法的影響因素 微生物菌種不同發(fā)育階段 菌體濃度 降溫速率 保護(hù)劑、抗誘變劑及修飾劑的使用 合適的凍干曲線 二次抽真空 復(fù)水及培養(yǎng)條件 四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制質(zhì)量控制-保藏方法保藏方法 2021-5-1 -80-80度度低溫冷凍法低溫冷凍法 將欲保存的菌種懸液密封于凍存管后儲(chǔ)藏于-80的冰箱中的保 藏方法。 原理：使微生物處于低溫狀態(tài)下使細(xì)胞的代謝減緩或趨于停止。 適應(yīng)范圍：各種類型微生物。 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便有效，在沒有液氮的地區(qū)

13、購(gòu)置深凍冰箱保藏菌種較易 推廣。 缺點(diǎn)：斷電或機(jī)械故障菌種易融化死亡。 四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制質(zhì)量控制-保藏方法保藏方法 2021-5-1 液氮超低溫保藏法液氮超低溫保藏法 將欲保存的菌種懸液密封于凍存管中，經(jīng)控制速度凍結(jié)后，儲(chǔ)藏 于-196 的液態(tài)氮或-150的氣態(tài)氮中的長(zhǎng)期保藏方法稱為液 氮超低溫保藏法。 原理：微生物在-130以下新陳代謝趨于停止。在此溫度下保藏， 微生物處于休眠狀態(tài)，可減少死亡或變異。 優(yōu)點(diǎn)：保存時(shí)間長(zhǎng),死亡率低,變異少,活性相對(duì)穩(wěn)定。 缺點(diǎn)：某些地方液氮不易得到 適用范圍：各類微生物 四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制質(zhì)

14、量控制-保藏方法保藏方法 -80-80度低溫凍結(jié)與液氮保藏比較度低溫凍結(jié)與液氮保藏比較 四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制質(zhì)量控制-保藏方法保藏方法 -80度低溫凍結(jié)保藏 液氮超低溫保藏 存活率（%）活力（%） 存活率（%） 活力（%） 大觀霉素產(chǎn)生菌69806280 中生菌素產(chǎn)生菌70836788 麥迪霉素產(chǎn)生菌80818777 2021-5-1 -80-80度度低溫冷凍法低溫冷凍法 sm, skim milk; Teut, eutectic temperature; Tg, glass- transition temperature; T prim. Dr. phase,

15、 primary drying phase; tr, trehalose. 共晶點(diǎn)的測(cè)定共晶點(diǎn)的測(cè)定 四、四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制質(zhì)量控制-保藏影響因素 當(dāng)溫度降低時(shí)電阻增大，當(dāng)降到共熔點(diǎn)時(shí)電阻即出現(xiàn)突然增大 現(xiàn)象，此時(shí)的溫度即是該溶液物質(zhì)的共熔點(diǎn)。 1.保藏方法各個(gè)環(huán)節(jié)的細(xì)化和完善 降溫速率的控制 保護(hù)劑 抗誘變劑的種類增多 共晶點(diǎn)測(cè)定 適合的凍干曲線 2.玻璃化速凍 部分真菌保藏 四、四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制質(zhì)量控制-保藏方法新進(jìn)展 網(wǎng)址: http:/ 地址: 北京市天壇西里1號(hào)， 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技 術(shù)研究所 郵編: 100

16、050 微生物菌種購(gòu)買和保藏, email: Tel: 01063161934 微生物菌種鑒定 email: Tel: 01083167110 歡迎與我中心 合作研究！ 38 微生物藥物產(chǎn)生菌微生物藥物產(chǎn)生菌 微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理 微生物藥物產(chǎn)生菌微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化菌種退化 微生物藥物產(chǎn)生菌微生物藥物產(chǎn)生菌菌種保藏與質(zhì)量控制菌種保藏與質(zhì)量控制 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化 微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化主要表現(xiàn)在微生物 的形態(tài)、生理特性及微生物藥物生產(chǎn)能力等方 面的變化： 1.細(xì)胞形態(tài)改變，產(chǎn)孢子能力下降。 2.培養(yǎng)特征異常，典型性狀變?yōu)椴坏湫汀?3.

17、對(duì)不良環(huán)境如低溫、高溫條件或噬菌體的侵 染的抵抗力下降。 4.營(yíng)養(yǎng)需求發(fā)生改變。 5.在生產(chǎn)上常見的退化現(xiàn)象有：微生物藥物生 產(chǎn)能力下降，生產(chǎn)的速度變慢。 三、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化 防止微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化的方法 三、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化 1.控制轉(zhuǎn)接傳代次數(shù) 2.采用良好的培養(yǎng)條件 3.采用有效保藏方法 微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化的原因菌種退化的原因 1.自發(fā)突變與回復(fù)突變 2.細(xì)胞本身自我調(diào)節(jié)和修復(fù) 3.環(huán)境條件的影響 冷凍干燥保藏法冷凍干燥保藏法 四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制質(zhì)量控制-保藏方法保藏方法 安瓿管準(zhǔn)備安瓿管準(zhǔn)備 酸洗酸洗 水洗水洗 蒸餾水蒸餾水 洗洗 加標(biāo)簽及棉加標(biāo)簽及棉 塞塞 滅菌滅菌 菌種菌種 制備菌制備菌 液液 培養(yǎng)培養(yǎng) （固體或液（固體或液 體）體） 分裝安瓿管分裝安瓿管 安瓿管預(yù)凍安瓿管預(yù)凍 冷凍干燥開冷凍干燥開 始始 適當(dāng)升溫（促進(jìn)適當(dāng)升溫（促進(jìn) 干燥）干燥） 凍干結(jié)束凍干結(jié)束 安瓿管封口安瓿管封口 檢查真空度檢查真空度 保護(hù)劑的選擇與準(zhǔn)保護(hù)劑的選擇與準(zhǔn) 備備 分裝分裝 滅菌滅菌 保藏（低溫避光）保藏（低溫避光） 菌體濃度對(duì)于抗生素產(chǎn)生菌存活力的影響菌體濃