土壤酶活性測(cè)定方法

1、土壤酶活性測(cè)定方法 土壤脲酶的測(cè)定方法（苯酚鈉次氯酸鈉比色法） 一、原理 脲酶存在于大多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶作用是極為專性的，它僅 能水解尿素，水解的最終產(chǎn)物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、 有機(jī)物質(zhì)含量、 全氮和速效磷含量呈正相關(guān)。 根際土壤脲酶活性較高， 中性土壤脲酶活性大 于堿性土壤。人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。 土壤中脲酶活性的測(cè)定是以脲素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測(cè)定生成的氨量，也可以通過(guò)測(cè)定 未水解的尿素量來(lái)求得。 本方法以尿素為基質(zhì)， 根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與苯酚次氯酸鈉作用生成 藍(lán)色的靛酚，來(lái)分析脲酶活性。 二、試劑 1）甲苯 2）10%尿

2、素：稱取 10g 尿素，用水溶至 100ml。 3）檸檬酸鹽緩沖液（ PH6.7）：184g 檸檬酸和 147.5g 氫氧化鉀（ KOH ）溶于蒸餾水。將兩 溶液合并，用 1mol/LNaOH 將 PH 調(diào)至 6.7，用水稀釋定容至 1000ml 。 4）苯酚鈉溶液（ 1.35mol/L ）：62.5g 苯酚溶于少量乙醇，加 2ml 甲醇和 18.5ml 丙酮，用乙 醇稀釋至100ml （A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。將A、B溶液 保存在冰箱中。使用前將 A 液、 B 液各 20ml 混合，用蒸餾水稀釋至 100ml。 5） 次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的

3、濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。 6） 氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水并稀釋至 1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的標(biāo)準(zhǔn)液；再將此液稀釋10倍（吸取10ml標(biāo)準(zhǔn)液定容至100ml ）制成氮的工作液 （0.01mg/ml）。 三、操作步驟 稱取5g 土樣于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振蕩均勻，15min后加10ml10%尿素溶 液和20ml PH 6.7檸檬酸鹽緩沖溶液， 搖勻后在37C恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后過(guò)濾， 過(guò)濾后取 1ml 濾液加入 50ml 容量瓶中，再加 4ml 苯酚鈉溶液和 3ml 次氯酸鈉溶液，隨加隨 搖勻。 20min 后顯色，定容。 1h 內(nèi)

4、在分光光度計(jì)與 578nm 波長(zhǎng)處比色。 （靛酚的藍(lán)色在 1h 內(nèi)保持穩(wěn)定） 。 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：在測(cè)定樣品吸光值之前，分別取 0、 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13ml 氮工作 液，移于50ml容量瓶中，然后補(bǔ)加蒸餾水至 20ml。再加入4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉 溶液，隨加隨搖勻。 20min 后顯色，定容。 1h 內(nèi)在分光光度計(jì)上于 578nm 波長(zhǎng)處比色。然 后以氮工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 注意事項(xiàng) : 1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品 實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。 2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置

5、一個(gè)無(wú)土對(duì)照，不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以檢驗(yàn)試劑純 度和基質(zhì)自身分解。 3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣 四、結(jié)果計(jì)算 ： 以 24 小時(shí)后 1g 土壤中 NH3N 的毫克數(shù)表示土壤脲酶活性( Ure)。 Ure= ( a樣品一a無(wú)土一 a無(wú)基質(zhì))x V x n/ m 式中： a 樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的 NH 3N 毫克數(shù)； a無(wú)土為無(wú)土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的 NH 3-N毫克數(shù)； a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的 NH3- N毫克數(shù)； V 為顯色液體積； n 為分取倍數(shù)，浸出液體積/吸取濾液體積； m 表示烘干土重 土壤

6、磷酸酶活性測(cè)定(磷酸苯二鈉比色法) 一、原理 測(cè)定磷酸酶主要根據(jù)酶促生成的有機(jī)基團(tuán)量或無(wú)機(jī)磷量計(jì)算磷酸酶活性。前一種通常稱為有 有機(jī)基團(tuán)含量法， 是目前較為常用的測(cè)定磷酸酶的方法， 后一種稱為無(wú)機(jī)磷含量法。 研究證 明：磷酸酶有三種最適 PH 值：45、67、810。因此，測(cè)定酸性、中性和堿性土壤的磷酸 酶，要提供相應(yīng)的 PH 緩沖液才能測(cè)出該土壤的磷酸酶最大活性。測(cè)定磷酸酶常用的PH 緩 沖體系有乙酸鹽緩沖液(PH5.05.4)、檸檬酸鹽緩沖液(PH7.0)、三羥甲基氨基甲烷緩沖液 (PH7.08.5 )、和硼酸緩沖液(PH910 )。磷酸酶測(cè)定時(shí)常用基質(zhì)有磷酸苯二鈉、酚酞磷酸 鈉、甘油磷酸

7、鈉、a或者3萘酚磷酸鈉等?，F(xiàn)介紹磷酸苯二鈉比色法。 二、試劑 1 )緩沖液： ( 1 )醋酸鹽緩沖液( PH 5.0) 0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至 1L. 0.2mol/L 醋酸鈉溶液16.4g CzHsOzNa 或 27g CzHsOzNaBHzO 溶至 1L. 取 14.8ml 0.2mol/L 醋酸溶液和 35.2ml 0.2mol/L 醋酸鈉溶液稀釋至 1L. ( 2)檸檬酸鹽緩沖液( PH 7.0) 0.1mol/L 檸檬酸溶液19.2g C6H7O8 溶至 1L. 0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液53.63g NazHPO 4.7H 2O 或者

8、71.7g Na 2HPO 4.12H 2O 溶至 1L. 取 6.4ml 0.1mol/L 檸檬酸溶液加 43.6ml 0.2mol/L 磷酸氫二鈉溶液稀釋至 100ml. ( 3)硼酸鹽緩沖液( PH 9.6) 0.05mol/L 硼砂溶液 19.05g 硼砂溶至 1L. 0.2mol/L NaOH 溶液 8g NaOH 溶至 1L. 取 50ml 0.05mol/L 硼砂溶液加 23ml 0.2mol/L NaOH 溶液稀釋至 200ml. 2) 0.5% 磷酸苯二鈉(用緩沖液配制) 3) 氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑：稱取0.125g 氯代二溴對(duì)苯醌亞胺，用 10ml 96%乙醇溶解， 貯于

9、棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。 4) 甲苯 5) 0.3%硫酸鋁溶液 6) 酚標(biāo)準(zhǔn)溶液 酚原液：取1g重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至1L,存于棕色瓶中。 酚工作液(0.01mg/ml )：取10ml酚原液稀釋至1L。 三、操作步驟 稱 5g 土樣置于 200ml 三角瓶中，加 2.5ml 甲苯，輕搖 15min 后，加入 20ml 0.5%磷酸 苯二鈉 (酸性磷酸酶用乙酸鹽緩沖液； 中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液； 堿性磷酸酶用硼酸鹽 緩沖液），仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱，37C下培養(yǎng)24h。然后在培養(yǎng)液加入 100ml 0.3%硫酸鋁 溶液并過(guò)濾。吸取 3ml 濾液于 50m

10、l 容量瓶中，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色。用硼酸緩沖 液時(shí)，呈現(xiàn)藍(lán)色，于分光光度計(jì)上 660nm 處比色。 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取 0、1、3、5、7、9、11、13ml 酚工作液，置于 50ml 容量瓶中，每 瓶加入 5ml 硼酸緩沖液和 4滴氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑，顯色后稀釋至刻度， 30min 后，在 分光光度計(jì)上 660nm 處比色。以顯色液中酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。 注意事項(xiàng) : 1 、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照，以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品 實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。 2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無(wú)土對(duì)照，不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)

11、相同，以檢驗(yàn)試劑純 度和基質(zhì)自身分解。 3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣 四、結(jié)果計(jì)算 以24h后1g 土壤中釋放出的酚的質(zhì)量（ mg）表示磷酸酶活性。 磷酸酶活性=（a樣品a無(wú)土 a無(wú)基質(zhì)）x V x n/ m 式中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)； a 無(wú)土為無(wú)土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)； a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)； V 為顯色液體積； n 為分取倍數(shù)，浸出液體積/吸取濾液體積； m 表示烘干土重 土壤蔗糖酶活性測(cè)定（ 3,5- 二硝基水楊酸比色法） 一、原理 蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性，如與土壤有機(jī)質(zhì)

12、、氮、 磷含量，微生物數(shù)量及土壤呼 吸強(qiáng)度有關(guān)，一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的還原糖 與 3,5- 二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3- 氨基 -5- 硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)， 因而可用測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。 二、試劑 1 ）酶促反應(yīng)試劑：基質(zhì)8%蔗糖， pH5.5 磷酸緩沖液： 1/15M 磷酸氫二鈉（ 11.876g Na2HPO4 2出0溶于1L蒸餾水中）0.5ml力口 1/15M磷酸二氫鉀（9.078g KH 2PO4溶于1L蒸 餾水中） 9.5ml 即成，甲苯 2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ 1mg/mL ） 預(yù)先將分析純葡萄糖置 80C烘箱內(nèi)約1

13、2小時(shí)。準(zhǔn)確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸 餾水溶解后，移至 50mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4C保存期約一星期）。若該溶液 發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制。 3）3,5- 二硝基水楊酸試劑（ DNS 試劑） 稱0.5g二硝基水楊酸，溶于 20ml 2mol/LNaOH 和50ml水中，再加30g酒石酸鉀鈉，用 水稀釋定容至 100ml （保存期不過(guò) 7 天）。 三、操作步驟 （ 1 ）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別吸1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于試管中，再補(bǔ)加蒸餾水至 1mL,加DNS試劑3mL混勻，于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min （從試管

14、放入重新沸騰時(shí)算起），取 出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長(zhǎng) 540nm 處比色，以 OD 值為縱坐標(biāo)，以葡 萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （ 2）土壤蔗糖酶測(cè)定 稱取5 g 土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5ml pH 5.5磷酸緩沖液 和5滴甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37C下培養(yǎng)24h。到時(shí)取出，迅速過(guò)濾。從中 吸取濾液1ml，注入50ml容量瓶中，加3ml DNS試劑，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min，隨 即將容量瓶移至自來(lái)水流下冷卻3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后 用蒸餾水稀釋至 50ml，并在分光光度計(jì)上于508n

15、m處進(jìn)行比色。（為了消除土壤中原有的 蔗糖、 葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無(wú)基質(zhì)對(duì)照， 整個(gè)試驗(yàn)需做無(wú)土壤對(duì)照；如果樣 品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。 ） 四、結(jié)果計(jì)算： 蔗糖酶活性以 24h， 1g 干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。 蔗糖酶活性=（a樣品a無(wú)土 a無(wú)基質(zhì)）x n/ m a樣品、a無(wú)土、a無(wú)機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖毫克數(shù)；n為分取倍數(shù); m 表示烘干土重 土壤纖維素酶活性測(cè)定（ 3,5- 二硝基水楊酸比色法） 一、原理 纖維素是植物殘?bào)w進(jìn)入土壤的碳水化合物的重要組分之一。 在纖維素酶作用下， 它的最 初水解產(chǎn)物是纖維二糖， 在纖二糖酶作用

16、下， 纖維二糖分解成葡萄糖。 所以，纖維素酶是碳 素循環(huán)中的一個(gè)重要的酶。纖維素酶解所生成的還原糖與3,5- 二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙 色的 3-氨基 -5- 硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用測(cè)定還原糖量來(lái)表示蔗糖 酶的活性。 二、試劑 1）甲苯 2）1%羧甲基纖維素溶液： 1g 羧甲基纖維素鈉，用 50%的乙醇溶至 100ml。 3）pH5.5 醋酸鹽緩沖液： 0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至 1L. 0.2mol/L 醋酸鈉溶液 16.4g CzHsOzNa 或 27.22g。2出022.3出0 溶至 1L. 取 11ml 0.2mol/L 醋酸溶

17、液和 88ml 0.2mol/L 醋酸鈉溶液混勻即成 PH 5.5醋酸鹽緩沖液 . 4）3,5-二硝基水楊酸溶液：稱 1.25g 二硝基水楊酸，溶于 50ml 2mol/LNaOH 和 125ml 水中， 再加75g酒石酸鉀鈉，用水稀釋至 250ml （保存期不過(guò)7天）， 5）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（ 1mg/mL ） 預(yù)先將分析純葡萄糖置 80C烘箱內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水 溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4 C保存期約一星期）。若該溶液發(fā)生 混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制。 三、操作步驟 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸 1mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液

18、0、 0.1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8mL 于 試管中，再補(bǔ)加蒸餾水至 1mL ,加DNS溶液3ml混勻，于沸騰水浴中加熱 5min，取出立即 泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長(zhǎng) 540nm 處比色，以 OD 值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖 濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 稱10g 土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，搖勻后放置 15min，再加5ml 1%羧 甲基纖維素溶液和 5ml pH5.5醋酸鹽緩沖液，將三角瓶放在37C恒溫箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié) 束后，過(guò)濾并取 1ml 濾液，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色法比色測(cè)定。 （為了消除土壤中原有的 蔗糖、 葡萄糖而引起的誤差，每一土樣

19、需做無(wú)基質(zhì)對(duì)照， 整個(gè)試驗(yàn)需做無(wú)土壤對(duì)照；如果樣 品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。） 四、結(jié)果計(jì)算 纖維素酶活性以72h, 1g干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。 纖維素酶活性=（a樣品a無(wú)土 a無(wú)基質(zhì)）x n/m a樣品、a無(wú)土、a無(wú)機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖毫克數(shù)；n為分取倍數(shù)； m 表示烘干土重 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定（高錳酸鉀滴定法） 一、原理 過(guò)氧化氫廣泛存在于生物體和土壤中， 是由生物呼吸過(guò)程和有機(jī)物的生物化學(xué)氧化反應(yīng)的結(jié) 果產(chǎn)生的， 這些過(guò)氧化氫對(duì)生物和土壤具有毒害作用。 與此同時(shí)， 在生物體和土壤中存有過(guò) 氧化氫酶，能促進(jìn)過(guò)氧化氫分解為水和氧的反應(yīng)（H

20、2O2T H2O+O2）,從而降低了過(guò)氧化氫 的毒害作用。 土壤中過(guò)氧化氫酶的測(cè)定便是根據(jù)土壤 （含有過(guò)氧化氫酶） 和過(guò)氧化氫作用析 出的氧氣體積或過(guò)氧化氫的消耗量， 測(cè)定過(guò)氧化氫的分解速度， 以此代表過(guò)氧化氫酶的活性。 測(cè)定過(guò)氧化氫酶的具體方法比較多， 如氣量法： 根據(jù)析出的氧氣體積來(lái)計(jì)算過(guò)氧化氫酶的活 性；比色法：根據(jù)過(guò)氧化氫與硫酸銅產(chǎn)生黃色或橙黃色絡(luò)合物的量來(lái)表征過(guò)氧化氫酶的活性； 滴定法： 用高錳酸鉀溶液滴定過(guò)氧化氫分解反應(yīng)剩余過(guò)氧化氫的量，表示出過(guò)氧化氫酶的活 性。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)采用高錳酸鉀滴定法。 二、試劑 2mol/L H 2SO4溶液量取5.43ml的濃硫酸稀釋至500ml，置于冰

21、箱貯存； 0.02mol/L高錳酸鉀溶液：稱取 1.7g高錳酸鉀，加入 400mL水中，緩緩煮沸15min，冷 卻后定容至 500mL ，避光保存，用時(shí)用 0.1mol/L 草酸溶液標(biāo)定； 0.1mol/L草酸溶液：稱取優(yōu)級(jí)純 H2C2O4?2H2O 3.334g,用蒸餾水溶解后，定容至 250ml ； 3%的H2O2水溶液：取30% H2O2溶液25ml,定容至250ml，置于冰箱貯存，用時(shí)用 0.1mol/L KmnO4 溶液標(biāo)定。 三、操作步驟 分別取 5g 土壤樣品于具塞三角瓶中（用不加土樣的作空白對(duì)照） ，加入 0.5mL 甲苯， 搖勻，于4C冰箱中放置30min。取出，立刻加入 25mL冰箱貯存的3% H2O2水溶液，充分 混勻后，再置于冰箱中放置1h。取出，迅速加入冰箱貯存的2mol/L H2SO4溶液25mL，搖 勻，過(guò)濾。取1mL濾液于三角