代謝工程在工業(yè)微生物育種中的應(yīng)用

1、.代謝工程在工業(yè)微生物育種中的應(yīng)用摘 要：傳統(tǒng)的誘變育種仍是目前發(fā)酵工業(yè)菌種選育中最常用的育種技術(shù)，以基因工程技術(shù)為主的多元化育種方式的發(fā)展，為代謝途徑操作引入了全新的理念和方法，使代謝工程得以發(fā)展。代謝工程是對細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)的代謝流量及代謝控制進(jìn)行定量地、系統(tǒng)地分析，并通過dna重組技術(shù)和相關(guān)的遺傳學(xué)手段對微生物細(xì)胞進(jìn)行代謝改造，提高其目的產(chǎn)物代謝量。本文論述了微生物代謝工程的理論基礎(chǔ)及其在發(fā)酵工業(yè)微生物育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀。關(guān)鍵詞：代謝工程；代謝途徑；菌種選育發(fā)酵工業(yè)自20世紀(jì)40年代發(fā)展至今，在青霉素等抗生素的發(fā)酵生產(chǎn)、賴氨酸等一系列氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)以及核苷酸、有機(jī)酸等物質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)業(yè)發(fā)展中起了

2、極其重要的作用。在工業(yè)微生物育種的過程中，對個別基因進(jìn)行改造的經(jīng)典基因工程技術(shù)不能保證對微生物代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能的準(zhǔn)確分析和高效利用，影響了相關(guān)行業(yè)的生產(chǎn)效率的穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)效益的提高。目前，幾乎所有重要工業(yè)微生物模式菌種的基因組全序列已經(jīng)或即將公布，轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組、通量組等數(shù)據(jù)資源正在迅速擴(kuò)展。充分利用組學(xué)數(shù)據(jù)中包含的有用信息，可以更有效地改造和控制細(xì)胞性能、提高底物利用以及產(chǎn)品的產(chǎn)率、改善微生物工業(yè)適應(yīng)性，促進(jìn)工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展1。菌種篩選和持續(xù)不斷的改良貫徹于發(fā)酵生產(chǎn)過程的始終，以基因工程為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)正越來越顯示出其在菌種改良上的魅力，將最終成為微生物育種的主導(dǎo)技術(shù)2。建立在

3、重組dna技術(shù)基礎(chǔ)之上的代謝工程技術(shù)，可以更容易地選擇菌種的改良靶點，構(gòu)建具有新的代謝途徑的微生物細(xì)胞，提高其發(fā)酵性能，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物，從而可以推動發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。一、代謝工程概述代謝工程（metabolic engineering），又稱途徑工程（pathway engineering），是指利用生物學(xué)原理，系統(tǒng)地分析細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，并通過dna重組技術(shù)合理設(shè)計細(xì)胞代謝途徑，通過遺傳修飾，完成細(xì)胞特性改造的應(yīng)用性學(xué)科。1974年，chakrabarty在假單胞菌屬的兩個菌種中分別引入幾個穩(wěn)定的重組質(zhì)粒，從而提高了對樟腦和萘等復(fù)雜有機(jī)物的降解活性，這成為代謝工程技術(shù)的第一個應(yīng)用實例。代謝工程的

4、概念是1991年由生化工程專家精品.james e. bailey首次提出的。生物體的代謝過程在不打破其平衡的情況下，都是以滿足自身生長發(fā)育為基礎(chǔ)的，利用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)經(jīng)濟(jì)劃算地生成代謝產(chǎn)物。如果需要積累某種代謝產(chǎn)物，就要打破生物體原有的代謝平衡狀態(tài)，從代謝網(wǎng)絡(luò)著手改變細(xì)胞的代謝途徑，代謝網(wǎng)絡(luò)是將細(xì)胞的生化反應(yīng)以網(wǎng)絡(luò)整體來考慮。代謝工程的設(shè)計主要是在對細(xì)胞的整個代謝網(wǎng)絡(luò)代謝流進(jìn)行定性、定量分析的基礎(chǔ)上，改變代謝流、擴(kuò)展代謝途徑、構(gòu)建新的代謝途徑。由于代謝工程的核心內(nèi)容是對細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行功利性修飾，所以要完成這一過程，首先要對細(xì)胞的分解代謝和合成代謝中的多步級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行合理設(shè)計，然后利用重組dna技

5、術(shù)強(qiáng)化和(或)滅活控制代謝途徑的相關(guān)基因。從這一點上來說，代謝工程也是基因工程的一個重要分支，而且通常是一個多基因的基因工程2。近年來，隨著組學(xué)（基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組等）和高通量篩選技術(shù)的大幅發(fā)展，讓人們可以逐漸了解細(xì)胞內(nèi)錯綜的次級代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。大量微生物全基因組序列的測定和功能基因組學(xué)技術(shù)的涌現(xiàn)，能夠從整體上認(rèn)識微生物代謝網(wǎng)絡(luò)；從基因、rna、蛋白質(zhì)、代謝物、代謝通量等多個層次系統(tǒng)地分析微生物代謝，極大地推動了代謝工程和微生物發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。代謝工程的發(fā)展主要體現(xiàn)在高通量組學(xué)分析技術(shù)的產(chǎn)生，基因組水平代謝網(wǎng)絡(luò)模型的建立。代謝工程技術(shù)目前已經(jīng)發(fā)展到可以從全局的角度分析改造細(xì)胞、設(shè)計合成新的

6、生物元件，并且能夠改造已經(jīng)存在的生物系統(tǒng)。二、代謝工程設(shè)計策略代謝工程的主要目標(biāo)是識別特定的遺傳操作和環(huán)境條件的控制，以增強(qiáng)生物技術(shù)過程的產(chǎn)率及生產(chǎn)能力，或?qū)?xì)胞性質(zhì)進(jìn)行總體改造。在代謝工程發(fā)展的初期，代謝工程首先從分析細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)著手，依據(jù)已知的生化反應(yīng)找到代謝過程中的節(jié)點；然后采取合適的分子改造方法進(jìn)行遺傳改造，從而調(diào)整細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)；最后對改造后的細(xì)胞生理、代謝等狀態(tài)進(jìn)行綜合分析，確定后續(xù)代謝工程的相關(guān)工作。經(jīng)典的系統(tǒng)代謝工程的策略有以下3個步驟：1、構(gòu)建起始工程菌。分析了局部代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)后，對其代謝途徑進(jìn)行改造，優(yōu)化細(xì)胞生理性能等。2、基因組水平系統(tǒng)分析和計算機(jī)模擬代謝分析。通過高

7、通量組學(xué)分析技術(shù)的使用精品.，可以將能提高細(xì)胞發(fā)酵性能的基因和代謝途徑有效地鑒定出來?；蚪M水平代謝網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建，也可以模擬分析出另外一些靶點基因。3、對工業(yè)水平發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化，使目的產(chǎn)物代謝達(dá)到較高的工業(yè)化生產(chǎn)水平3。三、代謝工程在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用隨著對微生物代謝網(wǎng)絡(luò)研究的深入及dna重組技術(shù)的日趨完善，通過基因克隆技術(shù)改變微生物代謝途徑的某些關(guān)鍵步驟，大大提高了產(chǎn)物產(chǎn)率；通過基因重組技術(shù)改變微生物的代謝途徑，還生產(chǎn)出傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)無法獲得的新產(chǎn)品。微生物基因組學(xué)和代謝組學(xué)的快速發(fā)展，對代謝工程有極大的推動作用4。代謝工程在工業(yè)微生物育種領(lǐng)域的應(yīng)用，主要體現(xiàn)在以現(xiàn)代基因工程技術(shù)為優(yōu)化手段，

8、對微生物進(jìn)行定向的改造，集中于細(xì)胞代謝流的控制，以提高目的代謝物的產(chǎn)量或產(chǎn)率。根據(jù)微生物的不同代謝特性，代謝工程的應(yīng)用主要表現(xiàn)在以下三個方面： 1、擴(kuò)展代謝途徑在宿主細(xì)胞中引入外源基因，使原來的代謝途徑向后延伸，產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物，或是使代謝途徑向前延伸，能利用新的原料合成代謝產(chǎn)物，提高產(chǎn)量。張勤等5從自然樣品中篩選分離得到一株能在ph 2.5的培養(yǎng)基中生長且不利用乳酸的酵母菌，將外源的乳酸脫氫酶編碼基因ldha插入含有g(shù)418抗性基因的酵母穿梭載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，導(dǎo)入后篩選獲得一株具有產(chǎn)l-乳酸能力的重組菌株；通過發(fā)酵實驗表明，該重組菌產(chǎn)l-乳酸的最適ph為3.5，并在ph 2.5時能正常

9、發(fā)酵產(chǎn)乳酸。從自然界篩選的耐高濃乳酸的耐酸酵母菌，并以此為宿主菌構(gòu)建了具有生產(chǎn)l-乳酸能力的耐酸重組酵母，成功地為以耐酸酵母菌高產(chǎn)l-乳酸進(jìn)行探索。該耐酸酵母菌株不能利用乳酸，采用代謝工程技術(shù)，在耐酸酵母中表達(dá)乳酸脫氫酶基因，使原來的代謝途徑向后延伸，增加了乳酸合成代謝途徑，代謝葡萄糖生成乳酸。2、重新分配代謝流如果要利用微生物細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸以及脂肪酸代謝中間產(chǎn)物生產(chǎn)生物柴油，中斷其-氧化降解途徑是必要的。在大腸桿菌中，編碼-氧化降解途徑第一步的脂酰輔酶a合成酶的基因被稱為fadd。敲除fadd，脂肪酸的產(chǎn)量能大大提高。此外，敲除編碼-精品.氧化降解途徑第二步的脂酰輔酶a脫氫酶的基因fade，

10、對脂肪酸的合成也有很大的影。因此，可以通過抑制-氧化降解途徑以達(dá)到積累脂肪酸的目的6。以上的例子說明了在代謝工程中，改變代謝途徑即改變分支代謝途徑的流向，阻斷其他代謝產(chǎn)物的合成，可以達(dá)到提高目標(biāo)產(chǎn)物的目的。在工業(yè)微生物育種過程中，改變代謝途徑可采用下列不同的方法：1）加速限速反應(yīng)，將編碼限速酶的基因通過基因擴(kuò)增。對青霉素生物合成的代謝控制分析表明，代謝流量的控制主要發(fā)生在- （l-氨基己二酰）-l-半膚氨酰-d-纈氨酸合成酶（acvs）和異青霉素n合成酶（ipns）兩個酶上。要想提高青霉素合成途徑的代謝流量，必須在發(fā)酵的前期增加acvs的活性，而在發(fā)酵后期要增加ipns的活性。而且用代謝工程技

11、術(shù)同時增加編碼acvs和ns的基因劑量及表達(dá)水平，比起單一基因擴(kuò)增來說、有可能取得更好的效果7。lum等8分析泰樂菌素高產(chǎn)菌株的基因組表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)編碼?；o酶a脫氫酶的aco基因和編碼異丁酰輔酶a變位酶的icma基因的轉(zhuǎn)錄水平較野生型菌株有很大提高，增加這兩個基因的拷貝數(shù)能為泰樂菌素的生產(chǎn)提供更多的脂肪酸前體，這種方法相當(dāng)于補(bǔ)加前提類似物。無論是增大限速酶基因的拷貝數(shù)還是增加其表達(dá)活性，都能通過加速限速加大整個代謝流的反應(yīng)速度，提高目的代謝物的產(chǎn)量或產(chǎn)率。2）通過改變分支代謝途徑的流向，提高代謝分支點的某一代謝途徑酶系的活性。在色氨酸的生物合成途徑中存在3-脫氫莽草酸（dhs）、莽草酸（shi

12、k）等一系列具有重要工業(yè)價值的中間產(chǎn)物。對于dhs、shik的生物合成，主要是通過中心代謝途徑改造，增加前體物磷酸烯醇式丙酮酸（pep）和赤蘚糖-4-磷酸（e4p）的供應(yīng)，以及阻斷芳香族氨基酸共有途徑中目標(biāo)產(chǎn)物之后的反應(yīng)而實現(xiàn)的9。通過提高pep和ep4這兩條中酶活性，控制分支代謝途徑的流向，提高了目的代謝中間產(chǎn)物的產(chǎn)量。3）構(gòu)建代謝旁路。在酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的過程中最大的副產(chǎn)物就是甘油。甘油產(chǎn)生的主要原因是在厭氧條件下，呼吸鏈不能起作用，這樣使nadh還原成nad+的唯一途徑就是形成甘油醇，來維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原電勢的平衡。通過轉(zhuǎn)移代謝途徑，在氨基酸合成過程中改變輔助因子的需求，可以降低甘油形成

13、。在野生型的菌株中存在由gdh1編碼的nadph依賴型的谷氨酸脫氫酶催化完成的反應(yīng)；而在酒酵母中存在另外兩種分別由gdh2和gdh3編碼的依賴nadh的谷氨酸脫氫酶催化完成的反應(yīng)，同時在釀酒酵母中存在另外一種合成谷氨酸的系統(tǒng)，由glt1編碼的谷氨酸合酶和gln1精品.編碼的谷氨酰氨合酶催化。趙志軍等10構(gòu)建了一株敲除掉gdh1，但是過量表達(dá)gdh2或glt1和gln1的菌株tn19，結(jié)果乙醇的產(chǎn)率提高了10 %，甘油的產(chǎn)率降低了38%。在整個過程中，以強(qiáng)化銨鹽的代謝流來達(dá)到提高乙醇產(chǎn)量的目的。4）改變能量代謝途徑。li等11敲除了枯草芽孢桿菌的呼吸鏈中的cyd基因，其產(chǎn)能相對較低，從而降低了維

14、持能，提高了能量途徑中的合成效率和磷酸戊糖途徑（pp）的通量，很大程度上調(diào)節(jié)了糖酵解途徑以及tca循環(huán)相關(guān)代謝途徑的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，降低了能量的消耗，核黃素的生物合成的能力得到了有效提高。3、轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑乙醇的生產(chǎn)是由傳統(tǒng)的發(fā)酵工業(yè)發(fā)展而來的，傳統(tǒng)的乙醇生產(chǎn)采用的菌種為釀酒酵母（saccharomyces cerevisiae），由于乙醇對酵母細(xì)胞的毒性、酵母對底物利用的局限性以及大量副產(chǎn)物的生成等原因使得乙醇的產(chǎn)率不高，生產(chǎn)效率低下。羅進(jìn)賢等12克隆了黑曲霉糖化酶基因和 -淀粉酶基因，并用這兩種基因共同和分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母，獲得多株含雙基因和單基因的酵母工程菌。隨后，他們將黑曲霉糖化酶ga

15、i cdna用pcr技術(shù)改造以后，重新引人釀酒酵母，在相同的調(diào)控元件的調(diào)節(jié)下獲得了較高的表達(dá)。改造后的糖化酶基因在酵母中的表達(dá)、分泌水平及水解淀粉的能力都高于未改造的基因。釀酒酵母由于缺少水解淀粉所需的酶類，不能直接利用淀粉作底發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，通過構(gòu)建新的淀粉代謝途徑，突破了酵母對底物利用的局限性。利用代謝工程技術(shù)可以通過構(gòu)建新的代謝途徑，提高工業(yè)微生物對脅迫的抗性。乳酸乳球菌是原核細(xì)菌中一種重要的工業(yè)微生物，其生長依靠發(fā)酵產(chǎn)能，不需要氧的參與，但乳酸乳球菌缺乏高效的抗氧脅迫系統(tǒng)，工業(yè)生產(chǎn)要求乳酸乳球菌提高對氧的耐受性。乳酸乳球菌的抗氧脅迫系統(tǒng)中沒有過氧化氫酶（catalase, cat），但存

16、在超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase, sod）。sod在清除超氧陰離子自由基時會產(chǎn)生h2o2。而cat可以使細(xì)胞免于遭受h2o2的毒害，是細(xì)胞內(nèi)h2o2代謝的關(guān)鍵酶。因此，將編碼cat的外源基因?qū)肴樗崛榍蚓涂梢詷?gòu)建乳酸乳球菌的抗氧脅迫突變株 13。通過構(gòu)建新的代謝途徑合成cat，可以有效地提高乳酸乳球菌抵抗氧脅迫的能力。rochat等14在枯草芽胞桿菌中克隆出編碼過氧化氫酶的基因kate，然后將其插入到乳酸乳球菌nz9000的nisin啟動子和信號肽spusp45上，產(chǎn)生了有活性的kate，通過構(gòu)建新的代謝途徑合成精品.了cat。 總之，代謝工程在工業(yè)微生物育種中

17、的應(yīng)用體現(xiàn)在：將催化某生物反應(yīng)的酶基因，克隆到新的微生物中；利用基因工程手段，克隆或改變少數(shù)基因，改變代謝網(wǎng)絡(luò)。枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)核黃素，通過中心代謝途徑的育種思路主要包括以下幾個方面15：增強(qiáng)菌體對碳源的利用效率；解除核黃素生物合成過程中的反饋調(diào)節(jié)；切斷核黃素生物合成途徑的其它代謝支路；增加前體物的供給和利用；增加核黃素操縱子的劑量或增強(qiáng)其表達(dá)；增加核黃素生物合成中關(guān)鍵基因的表達(dá)；抑制溢流代謝；能量途徑的改造。從代謝工程技術(shù)入手，工業(yè)微生物的育種思路是以網(wǎng)絡(luò)的形式多方面考慮的，目的是對微生物進(jìn)行定向改造代謝流的，獲得更多的目的代謝物。隨著發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，代謝工程的研究也開始向新物質(zhì)、新途徑

18、方向轉(zhuǎn)移。metabolix 公司成功開發(fā)了聚羥基烷酸(poly 3-hydroxyalkanoates, pha)代謝工程生產(chǎn)菌16，能被用來生產(chǎn)可降解塑料。此外，代謝工程還可應(yīng)用到高等生物中，如基因治療中。展望代謝工程應(yīng)用前景十分廣闊，隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)等生物基礎(chǔ)，以及化學(xué)工程、數(shù)學(xué)理論及分析檢測和信息技術(shù)等外源學(xué)科的發(fā)展，新的分子生物學(xué)技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、基因組學(xué)等組學(xué)技術(shù)及高通量分析技術(shù)的發(fā)展，特別是系統(tǒng)生物學(xué)的深入研究及越來越多的生物基因序列的公布，必將大大推動代謝工程的前行。特別是基因識別、基因擴(kuò)增、基因分離及基因功能分析技術(shù)的逐步發(fā)展，使代謝工程有目的、有

19、理性的改造更加可行和應(yīng)用自如。突變育種隨機(jī)性大，在提高了抗生素產(chǎn)量的同時也伴隨著有害突變的產(chǎn)生，原生質(zhì)體融合技術(shù)只局限于兩個菌種之間的融合，沒有擴(kuò)展到兩個以上的菌體的融合。以基因工程為基礎(chǔ)的代謝工程研究了各種抗生素產(chǎn)生菌的代謝途徑，為定向改造菌株提供富的理論基礎(chǔ)和實踐指導(dǎo)。隨著對各種生物產(chǎn)品的合成途徑及其相關(guān)基因的分子生物學(xué)研究的深人，代謝工程為傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的改造和生物高技術(shù)的發(fā)展帶來了前所未有的機(jī)遇，已經(jīng)成為國際生命科學(xué)技術(shù)研究的最重要的熱點之一。未來的代謝工程設(shè)計除了重構(gòu)代謝網(wǎng)絡(luò)，還應(yīng)當(dāng)在認(rèn)識微生物代謝調(diào)控機(jī)理的基礎(chǔ)上，重構(gòu)基因的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，讓代謝工程成為投資最少、收益最大的生物技術(shù)手段。代

20、謝工程的大力發(fā)展，對于全面提升傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的技術(shù)水平和促進(jìn)新興生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義，將會精品.為解決環(huán)境、糧食和能源等當(dāng)今世界面臨的重大問題提供解決思路。參考文獻(xiàn)1張延平,李寅.后基因組時代的工業(yè)生物技術(shù)j.生物工程學(xué)報,2010,25(9):1171-1175.2郝偉麗,劉景芝,趙寶華.微生物代謝工程原理與應(yīng)用j.生物技術(shù)通報,2007(5):18-23.3張學(xué)禮.代謝工程發(fā)展20年j.生物工程學(xué)報,2009,25(9):1285-1295.4朱躍釗,盧定強(qiáng),萬紅貴,等.工業(yè)生物技術(shù)的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢j.化工學(xué)報,2004,12,55(12): 1950-1956.5張勤,張梁,丁重

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