中國藥典微生物限度檢查修訂內(nèi)容

1、1 2005版中國藥典 微生物限度檢查 修訂內(nèi)容 遼寧省藥品檢驗(yàn)所遼寧省藥品檢驗(yàn)所 赫愛平、張雅杰赫愛平、張雅杰 2 一、一、2005年版藥典微生物限度標(biāo)準(zhǔn)修訂 情況 二、二、2005年版藥典微生物限度檢查法的 修訂情況 三、三、藥品微生物限度檢查法的驗(yàn)證 3 一、一、20052005年版藥典微生物年版藥典微生物 限度標(biāo)準(zhǔn)修訂情況限度標(biāo)準(zhǔn)修訂情況 4 v20002000年版：細(xì)菌數(shù)、酵母菌數(shù)和霉菌數(shù)按劑型制訂；年版：細(xì)菌數(shù)、酵母菌數(shù)和霉菌數(shù)按劑型制訂； 控制菌（致病菌）按給藥途徑制訂?？刂凭ㄖ虏【┌唇o藥途徑制訂。 v20052005年版：均按給藥途徑制訂。年版：均按給藥途徑制訂。 v理由：

2、同一劑型有不同的給藥途徑；新劑型的出現(xiàn)；理由：同一劑型有不同的給藥途徑；新劑型的出現(xiàn)； 國外藥典的限度標(biāo)準(zhǔn)制訂原則國外藥典的限度標(biāo)準(zhǔn)制訂原則 5 本版藥典明確指出本版藥典明確指出:藥品的生產(chǎn)、貯存、藥品的生產(chǎn)、貯存、 銷售過程中的檢驗(yàn)銷售過程中的檢驗(yàn),原料及輔料原料及輔料(中藥提中藥提 取物取物及輔料及輔料)的檢驗(yàn)的檢驗(yàn), 新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂,進(jìn)口進(jìn)口 藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核,考察藥品質(zhì)量及仲裁等考察藥品質(zhì)量及仲裁等, 除另有規(guī)定外，除另有規(guī)定外，其微生物限度均以本標(biāo)其微生物限度均以本標(biāo) 準(zhǔn)為依據(jù)。準(zhǔn)為依據(jù)。 6 雜菌數(shù)：雜菌數(shù)：細(xì)菌數(shù)細(xì)菌數(shù) 霉菌和酵母菌數(shù)霉菌和酵母菌數(shù) 控制菌（致病

3、菌）控制菌（致病菌）: :大腸埃希菌大腸埃希菌 大腸菌群（含藥材原粉及大腸菌群（含藥材原粉及 豆豉、神曲等發(fā)酵成分制劑）豆豉、神曲等發(fā)酵成分制劑） 沙門菌沙門菌 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 梭菌（陰道、尿道給藥制劑）梭菌（陰道、尿道給藥制劑） 7 1. 制劑通則、品種項(xiàng)下要求無菌的制劑制劑通則、品種項(xiàng)下要求無菌的制劑 及標(biāo)示無菌的制劑，應(yīng)符合無菌檢查及標(biāo)示無菌的制劑，應(yīng)符合無菌檢查 法規(guī)定。法規(guī)定。 8 2.2.口服給藥制劑口服給藥制劑 不含藥材原粉的制劑不含藥材原粉的制劑 含藥材原粉的制劑含藥材原粉的制劑 含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑

4、9 用于手術(shù)、燒傷及嚴(yán)重?fù)p傷的局部給藥制劑（無菌）用于手術(shù)、燒傷及嚴(yán)重?fù)p傷的局部給藥制劑（無菌） 用于表皮或黏膜不完整的含藥材原粉的局部給藥制劑用于表皮或黏膜不完整的含藥材原粉的局部給藥制劑 用于表皮或黏膜完整的含藥材原粉的局部給藥制劑用于表皮或黏膜完整的含藥材原粉的局部給藥制劑 眼部給藥制劑（由眼部給藥制劑（由100，不得檢出，不得檢出10，不得檢出），不得檢出） 耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑 陰道、尿道給藥制劑（含生藥原粉的深部用藥，破傷風(fēng)桿菌陰道、尿道給藥制劑（含生藥原粉的深部用藥，破傷風(fēng)桿菌梭菌）梭菌） 直腸給藥制劑直腸給藥制劑 其它局部給藥制劑其它局部給藥制劑

5、 10 v4、兼用給藥途徑的制劑，應(yīng)符合各給藥 途徑的標(biāo)準(zhǔn) 11 （五）、2005版制劑通則項(xiàng)下 的 微生物限度要求 12 1、2005版化學(xué)藥制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求版化學(xué)藥制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求 無菌檢查：注射劑、植入劑、沖洗劑。 無菌檢查及微生物限度檢查：軟膏劑、眼用制劑、氣霧 劑 、噴霧劑、散劑、耳用制劑、鼻用制劑、凝膠劑 、 乳膏劑 。 微生物限度檢查：粉霧劑、口服溶液劑、口服混懸劑 、 口服乳劑、搽劑、洗劑、局部用片劑、酊劑、栓劑、 糖漿劑、膜劑、貼劑 、灌腸劑 、糊劑 、涂劑、涂膜 劑 。 原則性要求：丸劑、口服片劑、膠囊劑、顆粒劑。 13 2、2005版中藥制劑通則項(xiàng)

6、下的微生物限度要求版中藥制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求 無菌檢查：注射劑。 無菌檢查及微生物限度檢查：散劑、軟膏劑、眼用制 劑、鼻用制劑、氣霧劑、噴霧劑。 微生物限度檢查：丸劑、顆粒劑、片劑、錠劑、煎膏 劑、膠劑、糖漿劑、合劑、滴丸劑、膠囊劑、酒劑、 酊劑、流浸膏劑、浸膏劑、露劑、茶劑、栓劑、貼膏 劑(貼劑)、凝膠劑、搽劑、洗劑、涂膜劑. 不要求：膏藥。 14 3、2005版三部制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求版三部制劑通則項(xiàng)下的微生物限度要求 v無菌檢查：注射劑、外用溶液劑、灌洗劑。 v微生物限度檢查：片劑、栓劑、膠囊劑、散劑、 顆粒劑、氣霧劑。 v無菌檢查或微生物限度檢查：軟膏劑、乳膏劑、 凝膠

7、劑、噴霧劑、眼用制劑、鼻用制劑。 15 （六）、品種項(xiàng)下的微生物限度要求（六）、品種項(xiàng)下的微生物限度要求 v輔料：乳糖、淀粉、糊精、玉米朊、精制玉米油等。 v純化水：純化水：微生物限度 取本品，采用薄膜過濾法處理后， 依法檢查（附錄 j），細(xì)菌、霉菌和酵母菌總數(shù)每1ml 不得過100個(gè)。 v 注射用水：注射用水：微生物限度 取本品至少200ml，采用薄膜 過濾法處理后，依法檢查（附錄 j），細(xì)菌、霉菌和 酵母菌總數(shù)每100ml不得過10個(gè)。 16 二、二、20052005年版藥典年版藥典 微生物限度檢查法微生物限度檢查法 的修訂情況的修訂情況 二二 0 0 四四 年年 十十 月月 17 起草的

8、指導(dǎo)思想起草的指導(dǎo)思想: 完善檢查法. 增加試驗(yàn)的可操作性. 使方法更具科學(xué)性，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性. 與國際接軌. 18 （二）增、修訂內(nèi)容（二）增、修訂內(nèi)容（1）總則）總則 操作環(huán)境 潔凈度：微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí) 下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。 檢驗(yàn)全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染。 潔凈度定期檢測(cè):單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境 應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮 游菌、和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn) 行潔凈度驗(yàn)證。 19 細(xì)菌培養(yǎng)溫度:3035。 霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度:23（25） 28。 控制菌培養(yǎng)溫度:3537 結(jié)果報(bào)告：以1g、

9、1ml、10g、10ml 或 10cm2 為單位報(bào)告。 20 （2）檢驗(yàn)量）檢驗(yàn)量 抽樣量 ：隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)量（兩個(gè) 以上最小包裝單位）的3倍。 檢驗(yàn)量：一次試驗(yàn)所用的供試品的量。 一般為10g或10ml；中藥膜劑50 cm2， 化學(xué)藥膜劑為100cm2；貴重或微量包 裝的藥品酌減（不得少于3g）。 檢查沙門菌的供試品其檢驗(yàn)量改為10g 或10ml。從2個(gè)包裝以上取樣。 21 （3）供試液制備）供試液制備 表面活性劑、中和劑或滅活劑：應(yīng)證明其有 效性及對(duì)微生物的生長(zhǎng)和存活無影響。 供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超 過1小時(shí)。 供試液制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超 過45。 供試液的

10、體積：100ml。 22 供試品分類 v液體供試品 v固體、半固體或黏稠液性供試品 v需用特殊供試液制備方法的供試品 非水溶性供試品 膜劑供試品 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品 氣霧劑、噴霧劑供試品 具抑菌活性的供試品 23 非水溶性供試品 ：增加“十四烷酸異丙酯法” （如油溶膏劑等） 。 結(jié)腸溶制劑供試品 ：用ph7.6無菌磷酸鹽 緩沖液溶解。 氣霧劑、噴霧劑供試品：冷凍1小時(shí)，放盡拋射劑， 藥液加ph7.0無菌氯化鈉-蛋白胨b.s。 具抑菌活性的供試品：增加方法的可操作 性（細(xì)化）。 24 （4）滅菌）滅菌 培養(yǎng)基及稀釋劑等滅菌:采用驗(yàn)證合格 的滅菌程序進(jìn)行滅菌。 25 （5）稀釋劑）稀釋劑 稀釋

11、劑：稀釋劑：ph7.0氯化鈉氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液蛋白胨緩沖溶液（增（增 加檢出率，對(duì)被破壞的微生物有加檢出率，對(duì)被破壞的微生物有 復(fù)復(fù) 蘇作用）蘇作用） ph6.8ph6.8無菌磷酸鹽緩沖液無菌磷酸鹽緩沖液 ph7.6ph7.6無菌磷酸鹽緩沖液無菌磷酸鹽緩沖液 26 （6）細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)）細(xì)菌、霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)平皿法平皿法 培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間: :必要時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至必要時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至57天天 . 點(diǎn)計(jì)：逐日點(diǎn)計(jì)點(diǎn)計(jì)：逐日點(diǎn)計(jì). . 同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15時(shí)，則兩個(gè)平板菌落數(shù)不能時(shí)，則兩個(gè)平板菌落數(shù)不能 相差相差1倍或

12、以上。倍或以上。 培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)特殊菌落：培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)特殊菌落：以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為記數(shù)結(jié)以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為記數(shù)結(jié) 果。果。 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：（菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：（1 1）、（）、（2 2）、（）、（3 3）、（）、（4 4）。）。 27 薄膜過濾法薄膜過濾法 方法：濾膜、材質(zhì)、過濾等相關(guān)要求。方法：濾膜、材質(zhì)、過濾等相關(guān)要求。 操作注意：避免微生物受損，降低檢出。操作注意：避免微生物受損，降低檢出。 取相當(dāng)于取相當(dāng)于1g或或1ml供試品的供試液供試品的供試液lml直接過濾，或加至直接過濾，或加至 100ml稀釋劑中，混勻，過濾。用稀釋劑中，混勻，過濾。用ph7.0無菌氯化鈉

13、無菌氯化鈉-蛋白胨緩蛋白胨緩 沖液或其它適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同沖液或其它適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“方方 法的驗(yàn)證法的驗(yàn)證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板 上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。 28 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：以相當(dāng)于菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：以相當(dāng)于1g1g或或1ml1ml供試品的菌落供試品的菌落 數(shù)報(bào)告；若濾膜上無菌落生長(zhǎng)，以數(shù)報(bào)告；若濾膜上無菌落生長(zhǎng)，以1 1報(bào)告

14、菌報(bào)告菌 數(shù)（每張濾膜過濾數(shù)（每張濾膜過濾1g1g或或1ml1ml供試品），或乘以供試品），或乘以 稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。 29 （7）控制菌檢查）控制菌檢查 修訂特點(diǎn)修訂特點(diǎn): : 減少篇幅減少篇幅 不作具體生化試驗(yàn)的規(guī)定不作具體生化試驗(yàn)的規(guī)定 增加鑒定方法增加鑒定方法 適應(yīng)微生物分類變化要求適應(yīng)微生物分類變化要求 增加控制菌檢查項(xiàng)增加控制菌檢查項(xiàng) 30 修訂的檢查法修訂的檢查法 大腸埃希菌檢查法、銅綠假單胞菌檢查法、 沙門菌檢查法、金黃色葡萄球菌檢查法。 新增的檢查法新增的檢查法 大腸菌群檢查法（近期、遠(yuǎn)期污染）、梭菌檢 查法檢查法。 31 供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗(yàn)

15、證的方法 進(jìn)行，增菌培養(yǎng)基的實(shí)際用量同控制 菌檢查方法的驗(yàn)證。 32 三、藥品微生物限度檢查法的驗(yàn)證 33 （一）概述（一）概述 驗(yàn)證的目的驗(yàn)證的目的: 確認(rèn)所采用的方法適合于確認(rèn)所采用的方法適合于 供試品的微生物限度檢查。供試品的微生物限度檢查。 驗(yàn)證的意義：驗(yàn)證的意義：保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、 可靠及檢驗(yàn)方法的完整性?？煽考皺z驗(yàn)方法的完整性。 34 驗(yàn)證的必要性 理論上要求、試驗(yàn)結(jié)果要求 驗(yàn)證的內(nèi)容 準(zhǔn)確性(回收率)、專屬性 35 驗(yàn)證的類型驗(yàn)證的類型 前驗(yàn)證: 建立藥品的微生物限度檢查法時(shí). 再驗(yàn)證: 修訂的檢驗(yàn)方法;供試品的組分或 原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果 時(shí)

16、 ;定期的方法驗(yàn)證. 36 驗(yàn)證用菌株：驗(yàn)證用菌株：大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠 菌、黑曲霉、枯草桿菌。 菌株選擇的原則菌株選擇的原則: :代表性,普遍性,低或非致病性,標(biāo)準(zhǔn) 菌株(或該藥品中常見的污染菌)。 菌種的要求：菌種的要求：不得超過5代。采用適宜的方法保存。 菌液制備菌液制備: :5050100cfu/ml100cfu/ml。 37 菌液的制備 v1取經(jīng)37培養(yǎng)18-24小時(shí)，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯 草桿菌、銅綠假單胞菌 10104肉湯培養(yǎng)物、 生孢梭菌 64941硫 乙醇酸鹽培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水10倍稀釋至10-5 10-7為50100個(gè) /ml，做活菌計(jì)數(shù)備用

17、v2取經(jīng)25 培養(yǎng)1824小時(shí)的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物 1ml+9 ml鹽水10倍稀釋至10-5 10-6為50100個(gè)/ml，做活菌計(jì)數(shù) 備用 v3取經(jīng)25 培養(yǎng)1周的黑曲霉菌斜面培養(yǎng)物，加35ml鹽水洗 下霉菌孢子，吸取出菌液， 用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，與濁度相當(dāng)后， 取1 ml +9 ml鹽水=10-1，逐管10倍稀釋為10-4約50100個(gè)/ ml， 做活菌計(jì)數(shù)備用 38 驗(yàn)證方法：至少進(jìn)行驗(yàn)證方法：至少進(jìn)行3 3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)次獨(dú)立的平行試驗(yàn) 試驗(yàn)組試驗(yàn)組 菌液組菌液組 供試品對(duì)照組供試品對(duì)照組 稀釋劑對(duì)照組稀釋劑對(duì)照組 39 結(jié)果判斷：結(jié)果判斷：供試品組的菌回收率、稀釋劑對(duì)照組的供試

18、品組的菌回收率、稀釋劑對(duì)照組的 菌回收率。菌回收率。 v試驗(yàn)組的菌回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)供試品 對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù) 100% v稀釋劑對(duì)照組的菌回收率=（稀釋劑對(duì)照組的平均 菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)）100% 判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷標(biāo)準(zhǔn): : 菌回收率均不低菌回收率均不低70% 70% 。 40 （三）控制菌檢查法的驗(yàn)證 試驗(yàn)菌株：試驗(yàn)菌株：按規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株。 陰性對(duì)照菌株陰性對(duì)照菌株:設(shè)立陰性對(duì)照菌是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法 的專屬性。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌用大腸埃 希菌；大腸埃希菌、沙門菌、大腸菌群用金黃色葡萄球菌。 菌種的要求：菌種的要求：不

19、得超過5代。采用適宜的方法保存。 菌液制備菌液制備: :1010100cfu/ml100cfu/ml。 41 驗(yàn)證方法：驗(yàn)證方法：試驗(yàn)組試驗(yàn)組 陰性菌對(duì)照組陰性菌對(duì)照組 結(jié)果判斷：結(jié)果判斷：試驗(yàn)組應(yīng)檢出試驗(yàn)組應(yīng)檢出 陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性菌對(duì)照組不得檢出 42 （四）藥品微生物限度檢查法驗(yàn)證試驗(yàn)（四）藥品微生物限度檢查法驗(yàn)證試驗(yàn) 結(jié)果不符合要求的處理方法結(jié)果不符合要求的處理方法 中和法 培養(yǎng)基稀釋法 薄膜過濾法 離心沉淀法 聯(lián)合方法 43 四、藥品微生物限度檢查法驗(yàn)證示例四、藥品微生物限度檢查法驗(yàn)證示例 44 銀翹解毒片銀翹解毒片- -金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌(常規(guī)法常規(guī)法) -試驗(yàn)次數(shù)

20、供試品濃度回收率% 試驗(yàn)組稀釋劑對(duì)照組 11:1092.596.3 21:1090.194.4 31:1091.193.3 45 銀翹解毒片銀翹解毒片- -大腸埃希菌大腸埃希菌(常規(guī)法常規(guī)法) -試驗(yàn)次數(shù)供試品濃度回收率% 試驗(yàn)組稀釋劑對(duì)照組 11:1091.897.9 21:1089.894.4 31:1090.196.7 46 銀翹解毒片銀翹解毒片- -白色念珠菌白色念珠菌(常規(guī)法常規(guī)法) -試驗(yàn)次數(shù)供試品濃度回收率% 試驗(yàn)組稀釋劑對(duì)照組 11:1091.594.9 21:1092.396.2 31:1091.597.1 47 銀翹解毒片銀翹解毒片- -黑曲霉黑曲霉(常規(guī)法常規(guī)法) -試驗(yàn)次