洋蔥根尖染色體觀(guān)察

1、大蒜根尖多倍體誘導(dǎo)與染色體觀(guān)察實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解利用秋水仙素誘導(dǎo)植物多倍體的方法。2、掌握大蒜根尖制片的方法。3、通過(guò)對(duì)玻片的觀(guān)察，統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目。4、對(duì)比不同的大蒜根尖染色體數(shù)目，理解二倍體和四倍體的區(qū)別實(shí)驗(yàn)原理：1. 有絲分裂完整的有絲分裂相包括G1期（合成前期）、S期（合成期）、G2期（合成后期） 和M期（分裂期），其中G1期、S期和G2期合稱(chēng)間期，細(xì)胞完成DNA勺復(fù)制以 及有絲分裂的準(zhǔn)備，而M期又可以分為前期、中期、后期和末期，為了形態(tài)觀(guān)察 的方便，本實(shí)驗(yàn)采用后一種分法。觀(guān)察有絲分裂，重點(diǎn)在于觀(guān)察染色體的形態(tài)。 在細(xì)胞分裂前期，細(xì)胞核解體，染色質(zhì)凝聚顯現(xiàn)出染色體的形態(tài)；在前中期，染 色

2、體散亂地分布于細(xì)胞的中部；在中期，紡錘體形成，染色體受到微管的牽引， 著絲粒成行排列于赤道板上；在后期，染色體受到動(dòng)粒微管的牽引，向細(xì)胞兩級(jí) 運(yùn)動(dòng)；在末期，染色體重新解螺旋，細(xì)胞核重新形成。細(xì)胞染色體過(guò)程示意圖見(jiàn) 圖1.圖1:細(xì)胞有絲分裂過(guò)程示意圖2. 大蒜的根尖大蒜根尖的整體結(jié)構(gòu)如圖2,其中只有分生區(qū)的初生分生組織由于細(xì)胞始終其余部分在制片時(shí)都應(yīng)處于持久而強(qiáng)烈的有絲分裂之中而作為我們的觀(guān)察對(duì)象, 當(dāng)盡量剔除來(lái)保證觀(guān)察效果。FWuv. I g Ttw 呼材 rwi 啊血 af In rf e af *tgln grvKHi d a i%eie tm: ih* iwe InniiEd.圖2:大蒜

3、根尖結(jié)構(gòu)示意圖3. 多倍體誘導(dǎo)秋水仙素易溶于冷水、不易溶于熱水、有毒、針狀結(jié)晶或淡黃色粉末，是誘導(dǎo)多 倍體的一種常用試劑，其是從百合科植物秋水仙的鱗莖和種子中提取出來(lái)的一種 生物堿。它的作用機(jī)理是與微管蛋白單體結(jié)合，抑制微管的形成，進(jìn)一步抑制紡錘體的形成，使染色單體分離受阻，形成同源多倍體。因此，秋水仙素作用于正 在分裂的細(xì)胞，如生長(zhǎng)點(diǎn)才能產(chǎn)生作用，誘導(dǎo)多倍體的形成。秋水仙素誘導(dǎo)多倍 體在蔬菜和觀(guān)賞植物的應(yīng)用非常廣泛，但是在大蒜方面的報(bào)道卻很少。colchicine圖3 :秋水仙素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式實(shí)驗(yàn)器材：實(shí)驗(yàn)材料：經(jīng)秋水仙素處理過(guò)的大蒜根。（秋水仙素溶液配制取秋水仙素1g （先 用少量95聽(tīng)醇助

4、溶），溶于250500ml蒸餾水中，配成濃度為0.20.4%的溶 液，冰箱中保存。將大蒜架在盛水的燒杯中進(jìn)行水培。待根尖長(zhǎng)到 1cm時(shí)，將大 蒜盛在0.4%秋水仙素溶液的瓶蓋或小燒杯上， 避光處理24小時(shí)，然后再水培24 小時(shí)加倍后根尖很肥大。）實(shí)驗(yàn)試劑：1mol/L的HCI溶液，改良苯酚品紅溶液。實(shí)驗(yàn)器材：刀片，鑷子，雙目顯微鏡，載玻片，蓋玻片，燒杯，濾紙。實(shí)驗(yàn)步驟：1、取材：取大蒜發(fā)根至0.5-1cm，然后轉(zhuǎn)入盛有0.15%秋水仙素水溶液 的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)到30小時(shí)，待觀(guān)察到根部有膨大時(shí)取 出固定。（一般植物細(xì)胞周期17-18小時(shí)）2、固定：在卡諾固定液中固定24小時(shí)，移至70%

5、乙醇中保存或者備用。3、解離：植物的分生組織需要經(jīng)過(guò)處理以便除去細(xì)胞之間的果膠層并 使細(xì)胞壁軟化，經(jīng)解離的組織才能使得壓片步驟順利進(jìn)行。酸解法：固定的材料用清水洗滌之后，用 1M HCL在 60攝氏度水浴 中恒溫處理5min,在酸解過(guò)程中一定要掌握好溫度和時(shí)間，若解離 不夠，則壓片不易分散。若解離太過(guò)，在下一步處理材料時(shí)由于材 料過(guò)軟而易丟失。4、水洗：水洗三次，每次一到二分鐘。5、染色：切取根尖分生組織區(qū)，用改良苯酚品紅染色10-15分鐘。& 壓片：將染色后的材料蓋上蓋玻片，在蓋玻片上蓋上兩層吸水紙， 用一個(gè)雙面刀片，插到蓋片與玻片之間的一角，用左手食指壓緊蓋 片，防止滑動(dòng)，用右手持解剖針，

6、用針柄輕敲蓋片，使材料均勻分 散開(kāi)，然后將刀片輕輕撤出，再用針柄重敲蓋片，使細(xì)胞分散壓平。7、鏡檢：比較四倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果：一、多倍體觀(guān)察：細(xì)胞內(nèi)染色體被改良苯酚品紅染成紫紅色； 細(xì)胞內(nèi)染色體數(shù)目明顯增多，雜 亂無(wú)章地排列在細(xì)胞內(nèi)部，并未平均移動(dòng)到細(xì)胞兩級(jí)。多倍體（1）10*40倍顯微鏡下觀(guān)察多倍體（2）10*40倍顯微鏡下觀(guān)察2.染色體計(jì)數(shù)實(shí)際值實(shí)際計(jì)數(shù)值相對(duì)偏差二倍體16-0多倍體（1）32299.37%多倍體（232306.25%結(jié)論：實(shí)際計(jì)數(shù)值與實(shí)際值存在偏差，一方面由于壓片不充分，另一方面立體細(xì) 胞使得染色體容易出現(xiàn)重疊現(xiàn)象。 通過(guò)觀(guān)察，細(xì)胞大致分散開(kāi)，沒(méi)有出現(xiàn)堆疊情 況

7、，判斷解離效果良好。六、注意事項(xiàng)1、解離的時(shí)間要適當(dāng)，大約 5mi n,因?yàn)榻怆x時(shí)間的長(zhǎng)短與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的 好壞有非常直接的影響，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則不僅破壞分生組織之間的果膠與纖維素等 物質(zhì)，也使分生組織與伸長(zhǎng)區(qū)脫離，染色效果將會(huì)降低，而過(guò)短，則又達(dá)不到分 離細(xì)胞的結(jié)果。2、在切取根尖時(shí)大約切從根尖開(kāi)始算往上 1.5mm左右，若切得太短，則 只會(huì)看到成熟的根冠細(xì)胞，在視野中看不到分裂期細(xì)胞；若切得太長(zhǎng)，則會(huì)看到 有很多伸長(zhǎng)區(qū)的成熟細(xì)胞，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3、染色時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，染色過(guò)深或過(guò)淺都會(huì)影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4、壓片時(shí)用拇指從上往下垂直用力且要避免載玻片與蓋玻片之間的滑動(dòng)， 否則會(huì)使細(xì)胞之間重

8、疊，影響觀(guān)察。5、觀(guān)察時(shí)先用低倍鏡找到分裂相的位置，再換高倍鏡觀(guān)察。七、實(shí)驗(yàn)拓展秋水仙素應(yīng)用價(jià)值：自1937年布萊克斯和埃佛里采用曼陀羅等植物發(fā)現(xiàn)用秋水仙素誘導(dǎo)多倍體 的方法后，廣大育種工作者開(kāi)始探索多倍性育種技術(shù)手段，多倍體植株葉片大而 厚，顏色深邃，花朵大而質(zhì)地加重，花期延長(zhǎng)等外觀(guān)特征符合現(xiàn)代育種目標(biāo)，增 加了花卉的觀(guān)賞價(jià)值和商品價(jià)值，帶動(dòng)了花卉產(chǎn)業(yè)的迅速崛起?，F(xiàn)有的技術(shù)手段 中,通過(guò)秋水仙素人工化學(xué)誘變的方式仍然被認(rèn)為是最有效、成績(jī)?yōu)轱@著的一條 途徑，其具有經(jīng)濟(jì)方便、誘變作用專(zhuān)一和誘變突變廣泛等特點(diǎn)，一直沿用至今。 如在金絲杜鵑、大波斯菊、草夾竹桃、矮牽牛、毛地黃、紫茉莉、金蓮花、金魚(yú)

9、草、雞冠花、掛竹香等植物中都通過(guò)秋水仙素誘導(dǎo)成功，已獲得了同源四倍體植 株。在提高觀(guān)賞價(jià)值的同時(shí)也獲得了巨大的利益。應(yīng)用前景：隨著研究的進(jìn)一步深入,用秋水仙素加倍還存在著一些亟待解決的問(wèn)題：1、缺陷問(wèn)題。秋水仙素誘變產(chǎn)生的第一代多倍體，基因平衡遭到破壞，存在一 些缺陷，如孕性低、種子不飽滿(mǎn)、生長(zhǎng)期較長(zhǎng)、開(kāi)花較晚等。因此不能直接 用于生產(chǎn), 只能在進(jìn)一步加以改善 , 克服缺陷后才能在生產(chǎn)上發(fā)揮優(yōu)勢(shì)。2、嵌合體問(wèn)題。 由于分生組織細(xì)胞分裂的不同步性 , 用秋水仙素處理時(shí)并不是 所有細(xì)胞都加倍為多倍體 , 也可能有一部分細(xì)胞染色體未加倍 , 染色體未 加倍與加倍的細(xì)胞嵌合在一起 , 從而形成了嵌合體

10、。 由于二倍體細(xì)胞一般生 長(zhǎng)較快 , 如果嵌合體中二倍體較多時(shí) , 二倍體細(xì)胞就包埋了多倍體細(xì)胞而使 得倍性恢復(fù)。 嵌合體現(xiàn)象嚴(yán)重制約多倍體育種發(fā)展 , 如何篩選嵌合體是多倍 體育種有待解決的問(wèn)題。3、毒害問(wèn)題。秋水仙素有劇毒性、對(duì)外植體有毒害作用 , 常常使材料在處理過(guò) 程中死亡 , 而且抑制種子的萌發(fā)和根的生長(zhǎng)。與組織培養(yǎng)結(jié)合時(shí) , 不但使離 體組織受害 , 明顯抑制不定芽分化 , 再生植株生長(zhǎng)緩慢 , 甚至可使外植體 在繼代培養(yǎng)中褐化死亡。4、誘導(dǎo)方法還需要進(jìn)一步完善 , 誘導(dǎo)頻率也有待提高 , 以期待獲得真正非嵌合 體的多倍體類(lèi)型 , 獲得多倍體在遺傳穩(wěn)定上也需要進(jìn)一步研究 , 目前研