2.2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)(高中生物選修一教案系列)

1、課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、課題目標(biāo)研究培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用，進(jìn)行微生物數(shù)量的測(cè)定。二、課題重點(diǎn)與難點(diǎn)課題重點(diǎn)：對(duì)土樣的選取和選擇培養(yǎng)基的配制。課題難點(diǎn)：對(duì)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)。學(xué)生活動(dòng)教師組織與引導(dǎo)教學(xué)意圖引導(dǎo)學(xué)生閱讀教材p21-22引導(dǎo)學(xué)生閱讀教材p22教師安排學(xué)生討論。引導(dǎo)學(xué)生閱讀教材p22（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目引導(dǎo)學(xué)生觀察教材p23圖2-7樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養(yǎng)流程示意圖引導(dǎo)學(xué)生閱讀教材p25操作提示通過(guò)上一節(jié)課的學(xué)習(xí)，我們知道，微生物和我們?nèi)祟?lèi)的關(guān)系非常緊密。目前，微生物在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)和醫(yī)療衛(wèi)生方面有廣泛的應(yīng)用。我們也知道研究微生物最基本的方法是對(duì)微生物

2、進(jìn)行培養(yǎng)、分離和計(jì)數(shù)。在上一個(gè)課題中，我們已經(jīng)學(xué)習(xí)了微生物培養(yǎng)的原理和方法。在本節(jié)課中，我們將繼續(xù)學(xué)習(xí)微生物的分離和計(jì)數(shù)。但是，微生物種類(lèi)有很多，我們選擇哪一種微生物來(lái)分離和計(jì)數(shù)呢？-引導(dǎo)學(xué)生閱讀p21請(qǐng)看：co(nh2)2這是大家都知道的一種物質(zhì)：尿素。今天，我們就學(xué)習(xí)一下從土壤中分離尿素細(xì)菌，并且計(jì)算1g土壤中尿素細(xì)菌到底含有多少個(gè)？并以它為載體來(lái)學(xué)習(xí)微生物的分離和計(jì)數(shù)的原理和方法。這就是我們今天學(xué)習(xí)的課題2的學(xué)習(xí)目標(biāo)(板書(shū)展示)一、 尿素細(xì)菌的分離；二、尿素細(xì)菌的計(jì)數(shù)。師：要完成尿素細(xì)菌的分離，我們需要配制一個(gè)培養(yǎng)基。在上一課中我們學(xué)習(xí)了一個(gè)培養(yǎng)基的配制，叫什么培養(yǎng)基？生答：牛肉膏蛋白胨

3、固體培養(yǎng)基。師：我們選用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，能夠從土壤中分離出尿素細(xì)菌嗎？生答：不能。師：為什么呢？生答：略師總結(jié)：因?yàn)榕Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基上不僅有尿素細(xì)菌的生長(zhǎng)，還有其他的微生物的生長(zhǎng)，所以不可能分離出尿素細(xì)菌。（補(bǔ)充：含有多種微生物都能生長(zhǎng)的培養(yǎng)基稱(chēng)為普通培養(yǎng)基）。師：我們?cè)鯓硬拍軓耐寥乐蟹蛛x出尿素細(xì)菌呢？生答:需要配制一種選擇性培養(yǎng)基:只有尿素細(xì)菌能夠在上面生長(zhǎng)，而土壤中其他微生物是不能生長(zhǎng)的。師：根據(jù)剛才的分析，你能給選擇性培養(yǎng)基下一個(gè)定義嗎？生答：選擇性培養(yǎng)基是指在微生物學(xué)中，允許特定種類(lèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類(lèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。師展示(或引導(dǎo)學(xué)生閱讀教材p22(二)統(tǒng)計(jì)

4、菌落數(shù)目一面一小段并學(xué)生閱讀明確定義)：討論1：培養(yǎng)基配方一： 培養(yǎng)基配方二： 培養(yǎng)基配方三：kh2po3 3g kh2po3 3g na2hpo3 1.4g na2hpo3 1.4g mgso47h2o 3g mgso47h2o 0.2gnano3 2g nano3 2g 尿素 1.0gmgso47h2o 3g 葡萄糖 10.0g na2hpo3 2.1g葡萄糖 10.0g 尿素 3.0g 葡萄糖 10.0g瓊脂 15.0g 瓊脂 15.0g 瓊脂 15.0g分別加蒸餾水定容至于1000ml。 師：你認(rèn)為，以上三個(gè)培養(yǎng)基配方中，哪個(gè)可以分離出尿離細(xì)菌？哪些不能分離出尿素細(xì)菌？原因是什么？生分

5、析配方一：任何細(xì)菌都能在上面生長(zhǎng)。因?yàn)榕囵B(yǎng)基配方中既提供了c源，又提供了n源，還有無(wú)機(jī)鹽和水。生分析配方二：不可以。因?yàn)槟蛩丶?xì)菌利用的唯一n源是尿素，而該培養(yǎng)基配方中有nano3存在，也提供了n源。其他以no3-作n源的微生物也能生長(zhǎng)。生分析配方三：不可以。因?yàn)槟蛩丶?xì)菌可以把尿素分解成氨。而固n細(xì)菌又能利用空氣中的n，我認(rèn)為固n細(xì)菌也能在上面生長(zhǎng)。因此，也分離不出尿素細(xì)菌。師：我們說(shuō)，每種微生物的生長(zhǎng)，都有特定的條件，需要特定的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。我們配制的培養(yǎng)基也可能有利于固n微生物的生長(zhǎng)，也可能不能。但它只要有尿素提供n源，肯定能保證尿素細(xì)菌生長(zhǎng)。這涉及選擇性培養(yǎng)基的有沒(méi)有選擇性的問(wèn)題。（為了降

6、低難度，固n菌問(wèn)題可不作分析，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中固n菌都無(wú)法排除）引入-引言：剛才，有的同學(xué)懷疑它沒(méi)有選擇性，不能選擇出尿素細(xì)菌，還有其他的微生物。那你怎樣設(shè)計(jì)一個(gè)簡(jiǎn)單的對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)證明呢？討論2：怎樣設(shè)計(jì)一個(gè)簡(jiǎn)單的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明配制的選擇性培養(yǎng)基具有選擇性？生答：將第三個(gè)培養(yǎng)基配方中的尿素去掉，其他的營(yíng)養(yǎng)成分都保持不變，看一看，沒(méi)有尿素的培養(yǎng)基有沒(méi)有雜菌生長(zhǎng)。如果有的話，證明第三個(gè)培養(yǎng)基中也會(huì)有雜菌生長(zhǎng)。師分析：根據(jù)同學(xué)的回答，對(duì)選擇性培養(yǎng)基設(shè)置對(duì)照：一個(gè)涂布土壤溶液，一個(gè)不涂布土壤溶液說(shuō)明培養(yǎng)基是否被污染。僅僅設(shè)計(jì)這樣一組對(duì)照，能體現(xiàn)出選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的就是尿素細(xì)菌嗎？我懷疑涂布土壤溶液的培養(yǎng)基

7、上長(zhǎng)出的菌是土壤中所有的微生物。你說(shuō)，是嗎？生：應(yīng)該做一個(gè)普通培養(yǎng)基作對(duì)照，能夠滿足多數(shù)微生物的生長(zhǎng)(如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)。師總結(jié)：如果對(duì)照組是一個(gè)普通培養(yǎng)基，相對(duì)于選擇性培養(yǎng)基，微生物的數(shù)量呢？(答：多)種類(lèi)呢？(答：多)師：這樣，數(shù)量多，種類(lèi)多，而選擇性培養(yǎng)基可能只有尿素細(xì)菌的生長(zhǎng)。引言：通過(guò)這樣一組實(shí)驗(yàn)，可以簡(jiǎn)單地證明分離出的就是尿素細(xì)菌。但今天我們的課題不僅僅從土壤中分離出尿素細(xì)菌，還要統(tǒng)計(jì)1g土壤中到底含有多少尿素細(xì)菌？師：在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足、環(huán)境適宜的條件下，一個(gè)細(xì)菌經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)繁殖形成一個(gè)菌落。換句話說(shuō)，一個(gè)菌落對(duì)應(yīng)著一個(gè)活菌，菌落數(shù)反應(yīng)了活菌的數(shù)量。所以我們可通過(guò)統(tǒng)計(jì)菌落的數(shù)目獲取平

8、板上尿素細(xì)菌的數(shù)量。在前面課題中，我們學(xué)習(xí)了稀釋涂布平板法。對(duì)土壤樣品進(jìn)行稀釋的目的是什么呢？生答：平板上菌落密度太大、很難計(jì)數(shù)。師總結(jié)：就是說(shuō)：獲得在平板上的菌落數(shù)在30300之間，便于統(tǒng)計(jì)。如果低于30個(gè)，存在的誤差較大，因?yàn)槠桨迳现灰幸粋€(gè)菌落的誤差，那么考慮土壤樣品稀釋倍數(shù)，實(shí)際的微生物種群數(shù)量的誤差將會(huì)非常大）；如果高于300個(gè)，統(tǒng)計(jì)起來(lái)比較困難，存在的誤差也較大。師：如果要分離土壤中的微生物，為了便于統(tǒng)計(jì)，又減少誤差，一些研究者對(duì)土壤的稀釋倍數(shù)做了研究，結(jié)果如表格所示（微生物統(tǒng)計(jì)時(shí)土壤稀釋倍數(shù)）：微生物的種類(lèi)土壤稀釋倍數(shù)目的分離土壤中所有細(xì)菌104105106平板上的菌落數(shù)應(yīng)為30

9、-300個(gè)，便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。（學(xué)生完成）分離土壤中的放線菌103104105分離土壤中的真菌102103104分離土壤中的尿細(xì)菌104105106107師：為什么，針對(duì)不同的微生物稀釋的倍數(shù)不一樣呢？針對(duì)同一微生物做微生物計(jì)數(shù)時(shí)，土壤的稀釋倍數(shù)也不一樣呢？生答：在土壤中微生物的種群密度不一樣；不同的地方，環(huán)境不同，同一微生物的數(shù)量也存在差異。（師：研究表明：1g表層干土壤中的細(xì)菌的數(shù)量是2000多萬(wàn)，放線菌的數(shù)量是500萬(wàn)左右；霉菌的數(shù)量約是20萬(wàn)左右。）師：尿素細(xì)菌的數(shù)量肯定比所有細(xì)菌的數(shù)量要少，稀釋倍數(shù)是104-107師：對(duì)土壤進(jìn)行稀釋?zhuān)覀儜?yīng)該怎么做呢？（觀察圖2-7，試用自己的話說(shuō)出稀釋

10、的流程）生答：首先，取1g土樣，將土樣倒入試管中，加9ml無(wú)菌水，振蕩，就可得到稀釋101倍的稀釋液。然后從1號(hào)試管中移取1ml土壤稀釋液，倒入2號(hào)試管，依次類(lèi)推。我們可以得到101、102、103、104、105、106的稀釋液師：經(jīng)過(guò)稀釋?zhuān)覀兊玫搅瞬煌瑵舛鹊耐寥老♂屓芤?，就可涂布接種了。是不是某一濃度的土壤稀釋液只要涂布一個(gè)平板，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)就可作為計(jì)算1g土壤樣品中尿素細(xì)菌的依據(jù)呢？為什么？（生答：我認(rèn)為，每一個(gè)稀釋倍數(shù)應(yīng)涂布2-3個(gè)。如果只涂布一個(gè)培養(yǎng)基，容易產(chǎn)生誤差。）師：每一個(gè)稀釋倍數(shù)下的土壤溶液應(yīng)涂布3-5個(gè)，例如我們選擇了稀釋了104倍的土壤溶液進(jìn)行涂布接種時(shí)涂布3-5

11、個(gè)。將這三個(gè)平板上的尿素細(xì)菌的菌落數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并計(jì)算其平均值，就是計(jì)算樣品中所含尿素細(xì)菌數(shù)目的依據(jù)。這一設(shè)計(jì)遵循了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的什么原則呢？生答：平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。師：四位同學(xué)針對(duì)不同的土壤稀釋度進(jìn)行涂布接種。以下數(shù)據(jù)為各平板上菌落數(shù)，分析涂布情況，計(jì)算其平均值。平板1平板2平板3平板值平板1平板2平板3平板值24225031020286198統(tǒng)計(jì)一統(tǒng)計(jì)二平板1平板2平板3平板值平板1平板2平板3平板值2132251029 8120統(tǒng)計(jì)三統(tǒng)計(jì)四平板一分析：生答：應(yīng)舍去平板3，平板1和2相加除以2即可。因?yàn)榈?組超過(guò)了統(tǒng)計(jì)允許的最大值。師：獲得在平板上的菌落數(shù)在30300之間，便于統(tǒng)計(jì)。平板2分析：生答：

12、應(yīng)舍去平板2。因?yàn)槠桨?和其他兩個(gè)相差太大。師：肯定。平板3分析：生甲答：三組相加除以3即可，因?yàn)樗鼈兌枷嗖畈淮蟆Ｉ掖穑翰豢梢?，因?yàn)榻y(tǒng)計(jì)數(shù)應(yīng)在30-300之間，而平板1和3超過(guò)了這一范圍，誤差較大。師：只有平板2介于30-300之間，是否說(shuō)明菌落的平均數(shù)就是32呢？這一數(shù)值說(shuō)明了什么？生答：不能。造成這一結(jié)果的原因是稀釋度太大，誤差很大。師：怎樣才能得到準(zhǔn)確的菌落呢？生答；降低稀釋倍數(shù)。師:觀察時(shí)記錄(出示記錄表格，課下完成記錄) 培養(yǎng)基類(lèi)型日期平板細(xì)菌數(shù)(土壤稀釋度： )選擇性培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基涂布接種未涂布接種第一天第二天計(jì)算公式p22旁欄知識(shí)拓展：師：試計(jì)算：在稀釋106倍的條件

13、下，三個(gè)平板培養(yǎng)基上的菌落數(shù)平均是2.54個(gè)。（生答:2.54109個(gè)）師：請(qǐng)大家預(yù)測(cè)一下，第一天和第二天的菌落比較有何區(qū)別？生答：第一天的菌落比較??；第二天的菌落比較大。師：有同學(xué)在做實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)：普通培養(yǎng)基上菌落幾乎長(zhǎng)滿了；選擇培養(yǎng)基上菌落較少；空白對(duì)照培養(yǎng)基未出現(xiàn)菌落，這一結(jié)果說(shuō)明了什么？生答：實(shí)驗(yàn)是成功的，菌落應(yīng)該是尿素細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的結(jié)果。師：有同學(xué)在做實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)：在普通培養(yǎng)基上，菌落數(shù)少于選擇性培養(yǎng)基。試分析其中原因。生答：略。師總結(jié)：普通培養(yǎng)基在涂布時(shí)，涂布器溫度太高，殺死了大量的菌種。師：普通培養(yǎng)基上菌落比選擇性培養(yǎng)基上的大的多。為什么？生答：略師總結(jié)：涂布時(shí)沒(méi)有將微生物分開(kāi)，涂布

14、不均勻。師：我在觀察選擇培養(yǎng)基上的尿素細(xì)菌的菌落時(shí)，發(fā)現(xiàn)有大有小，統(tǒng)計(jì)時(shí)，是否只統(tǒng)計(jì)大的，還是只統(tǒng)計(jì)小的，或大小都統(tǒng)計(jì)呢？生答：略師總結(jié)：大小都統(tǒng)計(jì)，因?yàn)榉纸饽蛩氐募?xì)菌可能不只一種。師：在操作的時(shí)候，應(yīng)該注意哪些問(wèn)題呢？-引導(dǎo)學(xué)生閱讀教材p25操作提示師總結(jié)：1、稀釋土樣時(shí)，應(yīng)注意將裝有稀釋液的試管及時(shí)編號(hào)，用棉塞塞好試管口，同時(shí)注意不同讓土壤稀釋液沾上棉塞2、涂布時(shí)應(yīng)在火焰旁邊進(jìn)行，還要完全打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，用滴管滴兩滴土壤稀釋液(0.1ml)在培養(yǎng)基上，再進(jìn)行涂布，要特別注意涂布均勻。3、涂布完成后，用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿蓋上寫(xiě)上培養(yǎng)基的類(lèi)型、土壤稀釋倍數(shù)，涂布接種的時(shí)間和涂布接種人等。并將所有的平

15、板放在32的恒溫箱中培養(yǎng)。師：接種時(shí)為何要在火焰旁邊進(jìn)行呢？生答：防止雜菌污染。師：涂布不均勻會(huì)出現(xiàn)什么情況？生答：出現(xiàn)菌落不均勻，難于統(tǒng)計(jì)。由于條件所限，我們不能到實(shí)驗(yàn)室親自體驗(yàn)生物技術(shù)實(shí)踐這門(mén)課操作的規(guī)范性、技術(shù)的含量及注意事項(xiàng)等。這個(gè)實(shí)驗(yàn)操作時(shí)同學(xué)易出現(xiàn)的問(wèn)題總結(jié)起來(lái)有以下幾點(diǎn)：涂布時(shí)，一些同學(xué)將培養(yǎng)皿蓋打的太開(kāi)，造成空氣中的微生物進(jìn)入培養(yǎng)皿，污染培養(yǎng)基；在涂布過(guò)程中，用力太大，將培養(yǎng)基弄破；有些同學(xué)涂布不均勻，微生物長(zhǎng)到一起，不便于統(tǒng)計(jì)。分組實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示：甲組乙組平板1平板2平板3平均值平板1平板2平板3平均值138613251570493454542師：在稀釋度相同的情況下甲、乙兩同

16、學(xué)得到了相差很大的兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果.就這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，他們甲、乙兩組同學(xué)共同出現(xiàn)的問(wèn)題是什么？ 學(xué)生分析：稀釋濃度太低，造成單位面積上尿素細(xì)菌數(shù)量太高。師：這告訴我們，下一次再做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，應(yīng)把稀釋倍數(shù)再提高一些。師：這兩組稀釋倍數(shù)是一樣的，為什么會(huì)出現(xiàn)這么大的誤差。生答：涂布器可能溫度太高，殺死了一部分微生物；吸取提取液時(shí)，振蕩不均勻。師總結(jié)：取的土樣不一樣，微生物的數(shù)目不一樣；稀釋土樣時(shí)，稀釋的程度不均勻也會(huì)出現(xiàn)偏差；涂布器可能溫度太高，殺死了一部分微生物；計(jì)數(shù)也是很關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。師：甲組(稀釋104生答：2.5108)、乙組 (稀釋105生答：1.54109)烷丙組：(稀釋106倍生答：2.

17、23109)師：稀釋倍數(shù)不同，平板上尿素細(xì)菌的數(shù)目不同，隨著稀釋倍數(shù)的加大，平板上尿素細(xì)菌的數(shù)目多了一些，是什么原因造成這一結(jié)果呢？生答：統(tǒng)計(jì)時(shí)有誤差。師總結(jié)：稀釋倍數(shù)低的培養(yǎng)基上菌落有些菌落大很多，稀釋倍數(shù)低的培養(yǎng)基上菌落小一些，統(tǒng)計(jì)時(shí)菌落大的作為一個(gè)來(lái)統(tǒng)計(jì)，菌落小的也作為一個(gè)來(lái)統(tǒng)計(jì)，而菌落大的很可能是多個(gè)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的結(jié)果，于是稀釋倍數(shù)小的就出現(xiàn)了較大的誤差。師總結(jié)：統(tǒng)計(jì)可見(jiàn)，1g土壤尿素細(xì)菌的數(shù)量還是很多的。1g土壤中不僅僅只有尿素細(xì)菌，還有其他的微生物。所以說(shuō)，土壤中的微生物是非常豐富的?，F(xiàn)在，我們一定確信這個(gè)平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌就是尿素細(xì)菌嗎？我們還需要通過(guò)后緒的工作來(lái)鑒定它？例如：我們

18、可以觀察這個(gè)菌落的形態(tài)，這個(gè)菌落的顏色。是否與尿素細(xì)菌的顏色、形態(tài)是一樣的；也可以通過(guò)化學(xué)的方法來(lái)鑒定它：尿素細(xì)菌的代謝產(chǎn)物是氨。而氨溶解在水中呈堿性。于是，我們可以將酚紅滴在菌落上，過(guò)一會(huì)兒，觀察它的顏色。如果培養(yǎng)基出現(xiàn)顏色是紅色的，我們可以氨的產(chǎn)生確認(rèn)細(xì)菌是尿素細(xì)菌。如果沒(méi)有紅色，說(shuō)明不是尿素細(xì)菌。思考：我們將課題完成了，在課題目標(biāo)中，我們以尿素細(xì)菌為載體，學(xué)習(xí)微生物的分離和計(jì)數(shù)的原理和方法。這個(gè)課題的工作流程包括哪些具體的環(huán)節(jié)呢（或?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)的流程是什么）？答：根據(jù)微生物的特性配制選擇性培養(yǎng)基，取土樣，稀釋土樣，涂布接種，觀察計(jì)數(shù)，計(jì)算鑒定。師：應(yīng)用這個(gè)原理和方法，我們能不能從土壤中分離出

19、其他的微生物？生答：分離出硝化細(xì)菌。生答：分離的是具有特殊性質(zhì)的，在某一培養(yǎng)基只有它能生長(zhǎng)，而其他微生物受抑制的微生物。師總結(jié)：除了細(xì)菌，還可以分離出其他的微生物嗎？如真菌，放線菌。總之，土壤中有什么微生物，我們都可以根據(jù)它的特殊的性質(zhì)，配制選擇性培養(yǎng)基就可以把它分離出來(lái)。通過(guò)今天的學(xué)習(xí)：我們不僅僅滿足于分離出尿素細(xì)菌，而是學(xué)習(xí)了一種方法。這種方法可以使我們從土壤中分離出很多很多我們需要的微生物。僅僅從土壤中分離出微生物是不夠的。我們生活中有很多地方都會(huì)用到這種方法。隨堂練習(xí)：大家最?lèi)?ài)吃的冰激凌，某個(gè)商店的冰激凌，大家懷疑它大腸桿菌的數(shù)量超標(biāo)了。運(yùn)用今天你學(xué)習(xí)的這種原理和方法，你怎樣拿到證據(jù)說(shuō)明它確實(shí)超標(biāo)了呢？(說(shuō)出工作流程即可)生答：買(mǎi)一盒冰激凌，取出少量，稱(chēng)出質(zhì)量，溶化，濃度稀釋?zhuān)谄胀ㄅ囵B(yǎng)基上培養(yǎng)，然后用伊紅-美藍(lán)染色，觀