HPLC色譜柱選擇與維護保養(yǎng)

1、agilent technologies 1頁頁 hplc色譜柱選擇與維護保養(yǎng)色譜柱選擇與維護保養(yǎng) sa 安捷倫科技安捷倫科技 agilent technologies 2頁頁 安捷倫安捷倫hplc色譜柱選擇色譜柱選擇 agilent technologies 3頁頁 分離模式的選擇分離模式的選擇 樣品樣品 溶于有機溶劑溶于有機溶劑 溶于水溶于水 溶于四氫呋喃溶于四氫呋喃 非離子化非離子化 離子化離子化 溶于有機溶劑溶于有機溶劑 溶于水溶于水 溶于正己烷溶于正己烷 溶于甲醇或甲醇溶于甲醇或甲醇/水水 或乙腈或乙腈或乙腈或乙腈/水水 用硅膠的正相模式用硅膠的正相模式 用鍵合相的正相模式用鍵合相的

2、正相模式 用鍵合相的反相模式用鍵合相的反相模式 用鍵合相的反相模式用鍵合相的反相模式 低分子凝膠滲透色譜低分子凝膠滲透色譜 用鍵合相的反相模式用鍵合相的反相模式 抑制電離反相鍵合相色譜抑制電離反相鍵合相色譜 離子對鍵合相的反相模式離子對鍵合相的反相模式 用硅膠的正相模式用硅膠的正相模式 離子交換模式離子交換模式 凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜 凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜 大孔填料的離子交換模式大孔填料的離子交換模式 用大孔填料的反相模式用大孔填料的反相模式 分子量分子量2, 000 分子量分子量2, 000 agilent technologies 4頁頁 反相分配色譜反相分配色譜 極性極性:固定相固

3、定相 流動相流動相 固定相固定相 - 極性極性 流動相流動相(己烷己烷, 庚烷庚烷)- 非極性非極性 極性極性物質(zhì)后出峰物質(zhì)后出峰 正相色譜正相色譜 20% 反相色譜反相色譜 80% 正相正相 &反相色譜反相色譜 agilent technologies 5頁頁 硅膠基質(zhì)硅膠基質(zhì)- ph 38 al2o3 . nh2o - ph114 聚合物基質(zhì)聚合物基質(zhì) - ph114 高或低高或低ph下下, 硅膠會溶解硅膠會溶解 化學(xué)修飾困難化學(xué)修飾困難 孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 孔徑不均勻?qū)е轮Р粔蚋呖讖讲痪鶆驅(qū)е轮Р粔蚋? 有有 機溶劑可能導(dǎo)致聚合物基質(zhì)溶漲而受損機溶劑可能導(dǎo)致聚合物基質(zhì)溶漲而受損

4、柱填料基質(zhì)柱填料基質(zhì) agilent technologies 6頁頁 c-18柱柱-性能影響因素性能影響因素 鍵合類型鍵合類型 碳覆蓋率碳覆蓋率 封端封端 化學(xué)性質(zhì)化學(xué)性質(zhì) 物理性質(zhì)物理性質(zhì) 硅膠純度硅膠純度 色譜柱尺寸色譜柱尺寸 顆粒形狀顆粒形狀 粒徑粒徑 表面積表面積 孔徑孔徑 agilent technologies 7頁頁 硅膠純度硅膠純度 填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度 色譜柱尺寸色譜柱尺寸 填料床的長度和內(nèi)徑填料床的長度和內(nèi)徑 顆粒形狀顆粒形狀 球型或不規(guī)則型球型或不規(guī)則型 粒徑粒徑 平均顆粒直徑平均顆粒直徑, 通常通常3-10m 表面積表面積

5、顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和, 以以m2/gram 表示表示 孔徑孔徑 顆粒的孔或腔的平均尺寸顆粒的孔或腔的平均尺寸, 范圍范圍80-300 色譜柱物理性質(zhì)色譜柱物理性質(zhì) c-18柱柱-性能影響因素性能影響因素 agilent technologies 8頁頁 鍵合類型鍵合類型 單體鍵合單體鍵合 - 鍵合相分子與基體單點相連鍵合相分子與基體單點相連 聚合體鍵合聚合體鍵合 - 鍵合相分子與基體多點相連鍵合相分子與基體多點相連 碳覆蓋率碳覆蓋率 與基體物質(zhì)相連的鍵合相的量與基體物質(zhì)相連的鍵合相的量 封端封端 鍵合步驟之后鍵合步驟之后, 用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起用

6、短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起 來來 色譜柱化學(xué)性質(zhì)色譜柱化學(xué)性質(zhì) c-18柱柱-性能影響因素性能影響因素 agilent technologies 9頁頁 二氧化硅二氧化硅 nanak km gm galalcacatitifefezrzrcucucrcrznzn zorbax rx-si lzorbax rx-si l1010 3 34 41. 51. 52 2ndnd3 3ndndndndndnd1 1 zorbax si lzorbax si l1717ndndndnd57579 9323221218888 1 1ndnd8888 nucl eosi lnucl eosi l5656n

7、/an/a n/an/andnd13013057577676ndndn/an/a n/an/andnd hypersi lhypersi l29002900 n/an/a404030030038386565230230 n/an/a n/an/a n/an/a n/an/a nd = nd = 未檢出未檢出 金屬濃度（金屬濃度（ppm ) ppm ) a類硅膠類硅膠 original zorbax sil (1970s) 由于帶負電荷的殘留硅羥基和酸性表由于帶負電荷的殘留硅羥基和酸性表 面上金屬含量高面上金屬含量高 (硅羥基的硅羥基的pka低低), 導(dǎo)致堿性化合物發(fā)生拖尾導(dǎo)致堿性化合物發(fā)生拖尾

8、 b類硅膠類硅膠 (高純高純) zorbax rx-sil (1987) 由于金屬含量低由于金屬含量低, 硅羥基硅羥基pka高高, 堿性化合物不發(fā)生拖尾堿性化合物不發(fā)生拖尾 zorbax rx-sil: 11種金屬種金屬 35 ppm (未檢出其他雜質(zhì)未檢出其他雜質(zhì), 4, 000, 選擇選擇 300 的孔徑的孔徑 agilent technologies 14頁頁 大孔徑填料適用于大分子分析大孔徑填料適用于大分子分析 *大孔徑大孔徑300 全多孔色譜柱全多孔色譜柱 可用于分離蛋白質(zhì)和多肽可用于分離蛋白質(zhì)和多肽 分子量雖小但分子量雖小但hydrodynamic volume(水動力學(xué)體積水動力

9、學(xué)體積)較大的較大的 分子分子 *poroshell 色譜柱色譜柱 高流速下高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白質(zhì)和多肽高柱效分析大分子的蛋白質(zhì)和多肽 色譜柱填料孔徑必須適合色譜柱填料孔徑必須適合 待測物分子自由進出填料待測物分子自由進出填料 孔孔, 與孔內(nèi)表面的鍵合與孔內(nèi)表面的鍵合 相進行分離分配相進行分離分配 agilent technologies 15頁頁 300 孔徑可改善蛋白質(zhì)和多肽峰形孔徑可改善蛋白質(zhì)和多肽峰形 0.2 0 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 300sb-c18 (300) sb-c18 (80) pw 1/

10、2 leu enkephalin m.w. = 556 angiotensin ii(血管緊張素血管緊張素 ii) m.w. = 1046 insulin b m.w. = 3, 496 cyt c m.w. = 12, 327 rnase(核糖核酸酶核糖核酸酶) m.w. = 13, 684 lysozyme(溶菌酶溶菌酶) m.w. = 13, 900 孔徑孔徑, 分子量對峰寬的影響分子量對峰寬的影響(梯度分離梯度分離) 選擇合適的選擇合適的 填料孔徑分析填料孔徑分析 大分子可獲得大分子可獲得 最佳峰形最佳峰形 agilent technologies 16頁頁 300 孔徑可改善大分子的

11、峰形孔徑可改善大分子的峰形 色譜柱色譜柱: 4.6 x 150 mm, 5 mm 流動相流動相: 60% meoh: 40% 0.1% 三氟乙酸三氟乙酸 流速流速: 0.75 ml/min 溫度溫度: rt 檢測器檢測器: uv 282 nm 溶液中的分子尺寸決定適宜的色譜柱孔徑溶液中的分子尺寸決定適宜的色譜柱孔徑 窄的峰寬表明待測分子進入填料孔沒有受到阻礙窄的峰寬表明待測分子進入填料孔沒有受到阻礙 sb-c3 (80) 300sb-c3 (300) pw 1/2 = 0.442 pw 1/2 =0.125 o o n ho ho cho ho o h o h o o o o oo o ch

12、3 ch 3 och 3 och 3 ch 3 ch 2 ch 2 ch 2 ch 3 ch 3 ch 3 h 3c h 3c h 3c 0 5 10 time (min) 0 5 10 time (min) tylosin(泰樂菌素泰樂菌素) mw. 926 分子量雖小但分子量雖小但 hydrodynamic volume (水動力學(xué)體積水動力學(xué)體積)較大的分子較大的分子 agilent technologies 17頁頁 鍵合類型鍵合類型 - 對色譜分離的影對色譜分離的影 響響 單齒鍵合：單齒鍵合： 提高傳質(zhì)速率提高傳質(zhì)速率, 加快色譜柱平衡加快色譜柱平衡 雙齒鍵合：雙齒鍵合： 增加色譜柱

13、穩(wěn)定性增加色譜柱穩(wěn)定性, 增加色譜柱的載樣增加色譜柱的載樣 量量 c-18柱柱-性能影響因素性能影響因素 ch ch ch ch ch ch o sio o o o si si si ch ch ch ch ch ch si 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 si si o o si si o o agilent technologies 18頁頁 碳覆蓋率碳覆蓋率- 對色譜分離的影響對色譜分離的影響 高碳覆蓋率：提高分辨率高碳覆蓋率：提高分辨率, 分析時間長分析時間長 低碳覆蓋率：縮短運行時間低碳覆蓋率：縮短運行時間 封端封端 - 對色譜分離的影響對色譜分離的影響 封端：減輕待

14、測組份與硅膠表面殘留的酸封端：減輕待測組份與硅膠表面殘留的酸 性硅羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象性硅羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象 對于極性樣品對于極性樣品, 未封端與經(jīng)過封端處理未封端與經(jīng)過封端處理 的色譜柱在選擇性上有明顯差異的色譜柱在選擇性上有明顯差異 c-18柱柱-性能影響因素性能影響因素 agilent technologies 19頁頁 固定相鍵合固定相鍵合 二甲基硅烷二甲基硅烷 封端封端 四甲基硅烷四甲基硅烷 si o oh o o ch 3 sir ch 3 ch 3 si ch 3 ch 3 sir ch 3 r = c8, c18, etc . o oh oh o ch 3

15、 sir ch 3 ch 3 sir ch 3 + cl ch 3 si ch 3 ch 3 oh oh oh oh ch 3 clr ch 3 (tms) 傳統(tǒng)鍵合及封端技術(shù)傳統(tǒng)鍵合及封端技術(shù) agilent technologies 20頁頁 取代基：五個取代基：五個 旁側(cè)基團旁側(cè)基團: 異丙基異丙基 zorbax stablebond 空間位阻保護空間位阻保護-抗水解能力抗水解能力 鍵合相鍵合相 流失流失, 保留減弱保留減弱 另一個裸露的硅羥基另一個裸露的硅羥基 , 潛在的拖尾因素潛在的拖尾因素 普通硅膠柱低普通硅膠柱低 ph 2 不穩(wěn)定不穩(wěn)定, 發(fā)生水解發(fā)生水解 安捷倫專利的空間位阻保

16、護安捷倫專利的空間位阻保護 agilent technologies 21頁頁 液相柱液相柱-保留值與保留值與ph的關(guān)系的關(guān)系 ph變化值變化值 0.1 rs變化值變化值 1.6 色譜柱：色譜柱：zorbax stablebond c18 4.6 x 250mm, 5um 部件號：部件號：880975-906 流動相：流動相：27%甲醇：甲醇：73%磷酸磷酸 ph 2.5 & 2.6 溫度：溫度：500c 流速：流速： 1.0ml/min. agilent technologies 22頁頁 1 2 3 4 67 5 0123456 time (min) 0123456 12 3 4 6 7

17、5 time (min) ph 7.00 ph 7.25 色譜柱色譜柱: zorbax eclipse xdb-c8 4.6 x 75 mm, 3.5 m 流動相流動相: 44% 25 mm磷酸磷酸, ph 7.00 : 56% 甲醇甲醇 流速流速: 1.0 ml/min 溫度溫度: 25c 檢測檢測: uv 250 nm 可電離的組份的分離可能會隨可電離的組份的分離可能會隨ph變化發(fā)生顯著變化變化發(fā)生顯著變化 甚至很小的甚至很小的 0.050.25 個個ph變化單位變化單位. 樣品樣品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. hydrocortisone 4.

18、fenoprofen 5. propyl paraben 6. propranolol 7. ibuprofen 液相柱液相柱-保留值與保留值與ph的關(guān)系的關(guān)系 0.25 個個ph agilent technologies 23頁頁 液相柱液相柱-保留值與保留值與ph的關(guān)系的關(guān)系 ph變化：變化： 0.2個個ph(7.07.2) 保留時間改變：保留時間改變： 1.2分鐘分鐘 (13.614.8分鐘分鐘 ) 保留時間隨保留時間隨ph 改變不明顯改變不明顯 保留時間隨保留時間隨ph改變改變 不明顯不明顯(酸性環(huán)境中酸性環(huán)境中) agilent technologies 24頁頁 保留時間保留時間

19、酸性組份酸性組份 中性組份中性組份 堿性組份堿性組份 方法穩(wěn)定區(qū)方法穩(wěn)定區(qū) 方法波動區(qū)方法波動區(qū)(pka+1.5) 方法穩(wěn)定區(qū)方法穩(wěn)定區(qū) 液相柱液相柱-保留值與保留值與ph的關(guān)系的關(guān)系 agilent technologies 25頁頁 液相柱液相柱-保留值與保留值與ph的關(guān)系的關(guān)系 stablebond c18 ph 18 bonus-rp ph 29 extend c18 ph 211.5 eclipse xdb c18 ph 29 agilent technologies 26頁頁 復(fù)雜組分的流動相復(fù)雜組分的流動相ph選擇技巧選擇技巧 色譜柱色譜柱: zorbax extend- c18

20、 4.6 x 150 mm, 5 mm 流動相流動相: 30% 緩沖液緩沖液: 70% meoh ph 7 緩沖液緩沖液20 mm na2hpo4 ph 11緩沖液緩沖液 20 mm tea 流速流速: 1.0 ml/min 溫度溫度: rt 檢測器檢測器: uv 254 nm 0 5 1 2, 3 4 5 time (min) 7 6 extend-c18 ph 7 1. maleate 馬來酸鹽馬來酸鹽 2. scopolamine 東莨菪堿東莨菪堿 pka 7.6 3. pseudoephedrine 假麻黃堿假麻黃堿 pka 9.8 4. doxylamine 抗敏安抗敏安(多西拉敏多

21、西拉敏) pka 9.2 5. chlorpheniramine 氯苯吡胺氯苯吡胺pka 9.1 6. triprol內(nèi)徑內(nèi)徑ine 苯丙烯啶苯丙烯啶pka 6.5 7. diphenhydramine 苯海拉明苯海拉明 pka 9.0 extend-c18 ph 11 0 5 10 1 2 3 4 time (min) 6 5 7 高高ph下下, 堿性成分的保留增加堿性成分的保留增加 待測物待測物pka+1.5以外以外 的流動相的流動相ph 可保證方法的穩(wěn)定性可保證方法的穩(wěn)定性 agilent technologies 27頁頁 zorbax 色譜柱發(fā)展史色譜柱發(fā)展史 1973 zorbax

22、 sil發(fā)明專用于發(fā)明專用于hplc分離的球狀、小顆粒硅膠分離的球狀、小顆粒硅膠(專利專利) 1977 zorbax ods單官能團單官能團, 單層鍵合相發(fā)明者之一單層鍵合相發(fā)明者之一 1978 zorbax column首先推出色譜柱的質(zhì)量信譽保證首先推出色譜柱的質(zhì)量信譽保證 1982 zorbax gf-250 改善了蛋白質(zhì)尺寸分離的穩(wěn)定性改善了蛋白質(zhì)尺寸分離的穩(wěn)定性 1987 zorbax rx-sil推出適合堿性化合物的推出適合堿性化合物的hplc分離的全新硅溶膠技術(shù)分離的全新硅溶膠技術(shù)(專利專利) 1990 zorbax stablebond增強了低增強了低ph條件下鍵合相的穩(wěn)定性條

23、件下鍵合相的穩(wěn)定性(專利專利) 1996 zorbax eclipse xdb雙封端技術(shù)提高了中等雙封端技術(shù)提高了中等ph條件下鍵合相的穩(wěn)定性條件下鍵合相的穩(wěn)定性(專專 利利) 1997 zorbax lc/ms column 15和和30 mm(3.5um)快速快速, 高分辨率高分辨率, 高通高通 量量lc/ms色譜柱色譜柱 1998 zorbax bonus-rp 極性鍵合技術(shù)使堿性化合物的分離得到改善極性鍵合技術(shù)使堿性化合物的分離得到改善(專利專利) 1999 zorbax combiht 專為小規(guī)模組合化學(xué)樣品制備設(shè)計的高通量色譜柱專為小規(guī)模組合化學(xué)樣品制備設(shè)計的高通量色譜柱 1999

24、 zorbax eclipse dsdna 用于分析雙鏈用于分析雙鏈dna的多孔硅膠柱的多孔硅膠柱 1999 zorbax carbohydrate 分析單分析單, 雙雙, 三糖和糖醇的專用柱三糖和糖醇的專用柱 1999 zorbax extend c18獨特寬獨特寬ph跨度跨度, 高高ph下使用的硅膠基質(zhì)色譜柱下使用的硅膠基質(zhì)色譜柱(專專 利利) 2001 zorbax sb-aq可在低可在低ph下下(18)使用使用100%水相的填料水相的填料(專利專利) 2002 zorbax poroshell 300sb蛋白質(zhì)高速蛋白質(zhì)高速, 高效反相分離新填料高效反相分離新填料 2002 zorba

25、x 3.0mm 內(nèi)徑內(nèi)徑.3-mm 柱徑溶劑節(jié)省柱柱徑溶劑節(jié)省柱 2003 zorbax sub 2 micron1.8um粒徑的高通量粒徑的高通量, 超高速色譜柱超高速色譜柱 (5月月1日上日上 市市) 2003 zorbax prepht 高通量全系列制備柱高通量全系列制備柱-分析柱向制備柱直接放大分析柱向制備柱直接放大 (6月月1日上日上 市市) agilent technologies 28頁頁 鍵合相鍵合相-適用適用ph范圍范圍 stablebond, ph 1-8 1. 使用空間位阻大的硅烷使用空間位阻大的硅烷 2. 未未-封端封端 eclipse xdb, ph 2-9 1. 致

26、密鍵合的二甲基烷基硅烷致密鍵合的二甲基烷基硅烷 2. 專利技術(shù)雙專利技術(shù)雙 - 封端封端 bonus-rp, ph 2-9 1. 極性烷基固定相極性烷基固定相 2. 使用空間位阻大的硅烷使用空間位阻大的硅烷 3. 三封端三封端 extend-c18, ph 2-11.5 1. 獨特的雙齒鍵合結(jié)構(gòu)獨特的雙齒鍵合結(jié)構(gòu) 2. 雙封端雙封端 si o si o silica support c18c18 si o nh o silica-based 色譜柱 packing with alkyl/am內(nèi)徑e stationary phase o r r si oh si o si r r r o oh

27、r ch ch ch ch ch ch o sio o o o si si si ch ch ch ch ch ch si 3 3 3 3 3 3 33 3 3 3 3 or si si o si or r 1 ch3 ch3 ch3 ch3 r r 1 ch3 r1 r1 r1 ch3 r1 1 1 si si pg pg pg r 1 r 1 極性官能團極性官能團 低低ph下下, 分析酸分析酸 性性, 堿性和中性組堿性和中性組 分分, 峰形優(yōu)異峰形優(yōu)異, 柱壽命長柱壽命長 中等中等ph下下, 分析酸性分析酸性 , 堿性和中性組分堿性和中性組分, 尤其堿性組分峰形優(yōu)異尤其堿性組分峰形優(yōu)異,

28、柱壽命長柱壽命長 中等中等ph下下, 分析酸性分析酸性, 堿性和中性組分堿性和中性組分, 可用可用 于于100%全水相全水相, 尤其尤其 極性組分峰形優(yōu)異極性組分峰形優(yōu)異, 柱柱 壽命長壽命長 中中高高ph下下, 分析酸性分析酸性, 堿性和中性組分堿性和中性組分, , 尤其堿性組分峰形優(yōu)異尤其堿性組分峰形優(yōu)異, 柱壽命長柱壽命長 agilent technologies 29頁頁 sb-c18 80 a & 300 a ph: 18 sb-c8 80 a & 300 a ph: 18 sb-苯基苯基 80 a ph: 18 反相色譜柱反相色譜柱 bonus-rp 空間位阻保護空間位阻保護 +

29、三封端三封端 80 a ph: 29 extend-c18 80 a & 300 a ph: 211.5 eclipse xdb 雙封端雙封端 eclipse xdb-c18 80 a ph: 29 eclipse xdb-c8 80 a ph: 29 eclipse xdb-苯基苯基 80 a ph: 29 stablebond 空間位阻保護空間位阻保護 poroshell 300sb-c18 實心核多孔殼實心核多孔殼 ph: 18 sb-cn 80 a & 300 a ph: 18 sb-c3 80 a & 300 a ph: 18 zorbax 產(chǎn)品系列產(chǎn)品系列 sb-aq 空間位阻保護

30、空間位阻保護 80 a ph: 18 可使用可使用 100%水相水相 extend 雙齒鍵合雙齒鍵合+雙封端雙封端 低低ph中中ph高高ph agilent technologies 30頁頁 安捷倫安捷倫hplc色譜柱維護保養(yǎng)色譜柱維護保養(yǎng) agilent technologies 31頁頁 zorbax色譜柱色譜柱=高柱效高柱效 +長壽命長壽命 min00.511.52 norm. 0 10 20 30 40 50 色譜柱色譜柱: zorbax sb-c18 4.6 x 30 mm, 1.8um 流動相流動相: 60% 甲醇甲醇: 40 水水 流速流速: 1ml/min 溫度溫度: 室溫室

31、溫 檢測檢測: uv 254 nm 柱效柱效 進樣次數(shù)進樣次數(shù) #3 #4 16635 6138 100 6857 6372 200 6882 6381 300 6895 6381 400 6883 6294 500 6815 6312 600 6687 6236 700 6653 6115 800 6695 6221 900 6781 6300 1050 6810 6302 1300 6858 6528 20346823 6343 1 2 3 4 樣品樣品 1. 尿嘧啶尿嘧啶 2. 苯酚苯酚 3. 4-cl-硝基硝基 苯苯 4. 甲苯甲苯 agilent technologies 32頁頁

32、色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時間色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時間 單次樣品運行時間單次樣品運行時間 = 分析時間分析時間 + 色譜柱平衡時間色譜柱平衡時間 色譜柱平衡時間色譜柱平衡時間 = 10倍柱內(nèi)體積倍柱內(nèi)體積 流速流速 4.6 x 500.5 ml5 min 4.6 x 300.3 ml3 min 4.6 x 150.15 ml1.5 min 4.6 x 1501.54 ml15 min 2.1 x 500.10 ml5 min 60 sec 2.1 x 300.06 ml3 min 36 sec 2.1 x 150.03 ml1.5 min 18 sec 色譜柱色譜柱柱內(nèi)柱內(nèi) 平衡時間平衡時間 尺寸尺

33、寸體積體積 流速流速 (mm)(vm) 1.0 ml/min 色譜柱色譜柱柱內(nèi)柱內(nèi) 平衡時間平衡時間 尺寸尺寸體積體積 流速流速 (mm)(vm) 0.2 ml/min 1.0 ml/min agilent technologies 33頁頁 清洗液相色譜柱清洗液相色譜柱 沖洗色譜柱沖洗色譜柱-用比用比流動相更強的溶劑流動相更強的溶劑 反相色譜柱反相色譜柱 用以下溶劑至少各用以下溶劑至少各25ml沖洗色譜柱沖洗色譜柱(分析柱分析柱) 不含緩沖鹽的流動相不含緩沖鹽的流動相 100%甲醇甲醇 100%乙腈乙腈 75%乙腈乙腈+25%異丙醇異丙醇 100%異丙醇異丙醇 100%二氯甲烷二氯甲烷 *

34、100%己烷己烷* *若使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱若使用己烷或二氯甲烷沖洗色譜柱, 則在重新使用反相則在重新使用反相 流動相以前流動相以前, 必須用異丙醇沖洗色譜柱必須用異丙醇沖洗色譜柱 ! 正相色譜柱正相色譜柱 用以下溶劑至少各用以下溶劑至少各50ml沖洗色譜柱沖洗色譜柱(分析柱分析柱) 50%甲醇甲醇+50%三氯甲烷三氯甲烷 100%乙酸乙酯乙酸乙酯 agilent technologies 34頁頁 0.12mm內(nèi)徑管線用于毛細管內(nèi)徑管線用于毛細管hplc中中2.1內(nèi)徑色內(nèi)徑色 譜柱譜柱 0.17mm內(nèi)徑管線用于分析型內(nèi)徑管線用于分析型hplc中中2.14.6內(nèi)徑內(nèi)徑 色譜柱色譜柱 0

35、.25mm內(nèi)徑管線用于半制備型內(nèi)徑管線用于半制備型hplc中中9.4內(nèi)徑色內(nèi)徑色 譜柱譜柱 0. 5mm內(nèi)徑管線用于制備型內(nèi)徑管線用于制備型hplc中中21.2內(nèi)徑色譜內(nèi)徑色譜 柱柱 連接管線與接頭連接管線與接頭 色譜柱色譜柱: stablebond sb-c18, 4.6 x 30 mm, 3.5 mm 流動相流動相: 85% h2o with 0.1% 三氟乙酸三氟乙酸 : 15% acn 流速流速: 1.0 ml/min 溫度溫度: 35c 50 m ml 柱外體積（管線）柱外體積（管線） 4 3 2 1 time (min) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 10 m ml 柱外

36、體積柱外體積 time (min) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 4 3 2 1 樣品樣品: 1. 苯丙胺酸苯丙胺酸 2. 5-苯基苯基-3, 6-二氧二氧-2-哌嗪乙哌嗪乙 酸酸 3. asp-phe 4. 天冬甜素天冬甜素 agilent technologies 35頁頁 hplc常用的色譜柱接頭常用的色譜柱接頭 troubleshooting lc fittings, part ii. j. w. dolan and p. upchurch. lc/gc magazine 6:788 (1988) 0.09 in. = 2.33 mm swagelok 安捷倫安捷倫1100液

37、液 相相 parke r valco uptigh t 0.09 in. = 2.33 mm 0.08 in. = 2.07 mm 0.09 in. = 2.33 mm 0.13 in. = 3.37mm 0.17 in. = 4.40mm waters rheodyne agilent technologies 36頁頁 如果伸出的管線長度過長，可能漏液如果伸出的管線長度過長，可能漏液 螺母坡度不匹配，密封性差螺母坡度不匹配，密封性差 死體積區(qū)死體積區(qū) 如果伸出的管線長度不夠，可能產(chǎn)生死體積如果伸出的管線長度不夠，可能產(chǎn)生死體積 hplc常用的色譜柱接頭常用的色譜柱接頭 agilent te

38、chnologies 37頁頁 活塞桿與密封圈活塞桿與密封圈 藍寶石活塞桿藍寶石活塞桿 1/包裝包裝部件號：部件號：5063- 6586 活塞桿密封圈活塞桿密封圈 （vespel聚酰亞胺用于聚酰亞胺用于反相反相） 2/包裝包裝部件號：部件號：5063-6589 *己烷對己烷對vespel聚酰亞胺有溶漲作用聚酰亞胺有溶漲作用 活塞桿密封圈活塞桿密封圈 （聚乙烯用于（聚乙烯用于正相正相）2/包裝包裝部件號：部件號：0905-1420 agilent technologies 38頁頁 樣品樣品: 1.尿嘧啶尿嘧啶 2.苯酚苯酚 3.n, n-二甲基苯胺二甲基苯胺 更換前更換前 更換后更換后 色譜柱

39、色譜柱: bonus - rp 4.6 x 75 mm, 3.5 mm 流動相流動相: 30% h2o : 70% meoh 流速流速: 1.0ml/min溫度：室溫溫度：室溫 檢測器檢測器: uv 254nm 0.0 0.5 1.0 1.5 time (min) 2 1 3 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 time (min) 2 1 3 塔板數(shù)塔板數(shù) usp拖尾因子拖尾因子 (5%) 1. 22351.72 2. 34911.48 3. 54321.15 塔板數(shù)塔板數(shù)usp拖尾因子拖尾因子 (5%) 1.36701.45 2.104571.09 3.100851.00 活塞桿與密封

40、圈活塞桿與密封圈 agilent technologies 39頁頁 檢測器用燈檢測器用燈 agilent technologies 40頁頁 檢測器用燈檢測器用燈 agilent technologies 41頁頁 檢測器用燈檢測器用燈 agilent technologies 42頁頁 1. dad的氘燈替代的氘燈替代vwd的氘燈的氘燈 * 關(guān)閉燈電源關(guān)閉燈電源, 冷卻冷卻5min以上以上 * 將將lamp設(shè)定的設(shè)定的vwd configuration的燈類型改為的燈類型改為2140-0590 2. 燈能量測試燈能量測試 * 以水為流動相以水為流動相 * 燈預(yù)熱燈預(yù)熱10min以上以上 *

41、 在化學(xué)工作站在化學(xué)工作站diagnosis狀態(tài)下進行波長校準狀態(tài)下進行波長校準, 將紫外燈的使用時間歸零將紫外燈的使用時間歸零 dad的氘燈替代的氘燈替代vwd的氘燈的氘燈 agilent technologies 43頁頁 dad故障診斷與維護故障診斷與維護 要進行要進行dad故障診斷故障診斷, 單擊單擊dad圖標圖標, 然后選擇然后選擇show module test選項選項, 進入進入dad測試測試 選項畫面選項畫面 dad故障診斷測試共有故障診斷測試共有8項內(nèi)項內(nèi) 容：容： dad self-test dad intensity test dad cell test 常做的常做的da

42、d維護：維護： 更換燈更換燈 清洗或更換流動池窗清洗或更換流動池窗 agilent technologies 44頁頁 diagnosis界面故障原因分析界面故障原因分析 故故 障障 選選 擇擇 框框 可能原因框可能原因框 診斷過程故障分析診斷過程故障分析 樣品分析過程中故障分析樣品分析過程中故障分析 在在diagnosis畫面中為用戶提供了在診斷過程畫面中為用戶提供了在診斷過程 或樣品分析過程中出現(xiàn)的問題以及可能的原因或樣品分析過程中出現(xiàn)的問題以及可能的原因 agilent technologies 45頁頁 樣品溶劑溶解強度樣品溶劑溶解強度 樣品溶劑溶解能力強于流動相導(dǎo)致色譜峰峰形問題：裂

43、分峰或?qū)挿鍢悠啡軇┤芙饽芰娪诹鲃酉鄬?dǎo)致色譜峰峰形問題：裂分峰或?qū)挿?色譜柱色譜柱: zorbax stablebond sb-c8, 4.6 x 150 mm, 5 mm 流動相流動相: 82% h2o : 18% acn 進樣體積進樣體積: 30 ml a.樣品溶劑樣品溶劑 100% 乙腈乙腈 0 10 time (min) 1 2 b.樣品溶劑樣品溶劑 流動相流動相 0 10 time (min) 1 2 樣品樣品: 1. caffeine (咖啡因咖啡因) 2. salicylamide (水楊酰胺水楊酰胺) agilent technologies 46頁頁 中性分析時為何要使用緩沖

44、液？中性分析時為何要使用緩沖液？ 色譜柱色譜柱: zorbax eclipse xdb-c8, 4.6 x 75 mm, 3.5 m 流動相流動相: 44% a : 56% 甲醇甲醇 流速流速: 1.0 ml/min 溫度溫度: 25c 檢測檢測: uv 250 nm 含緩沖液的流動相可改善保留含緩沖液的流動相可改善保留, 分離和色譜峰峰形分離和色譜峰峰形. 樣品樣品: 1. ketoprofen 2. ethyl paraben 3. hydrocortisone 4. fenoprofen 5. propyl paraben 6. propranolol 7. ibuprofen a =

45、ph 7.0 水水 a = ph 7.0 水水+25 mm 磷酸緩磷酸緩 沖液沖液 012345 time (min) 1 2 3 4 6 7 5 01234 1, 4, 6, 7 2 3 5 time (min) agilent technologies 47頁頁 0 2.5 5.0 7.5 time (min) 1 2 3 4 5 6 0 2.5 5.0 time (min) 1 2 3 4 5 6 增加緩沖液濃度減少拖尾增加緩沖液濃度減少拖尾 色譜柱色譜柱:zorbax eclipse xdb- c8 4.6 x 150 mm, 5 mm 流動相流動相:40% 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液

46、60% acn 流速流速:1.5 ml/min. 溫度溫度:40c usp tf 1.1.62 2.1.65 3.1.63 4.1.77 5.1.83 6.1.12 10 mm 磷酸鹽磷酸鹽 ph 7.0 usp tf 1.1.41 2.1.50 3.1.33 4.1.39 5.1.36 6.1.00 25 mm 磷酸鹽磷酸鹽 ph 7.0 在中等在中等ph下下, 離子強度較高離子強度較高, 能有效掩蔽硅羥基的二次作用減少拖尾能有效掩蔽硅羥基的二次作用減少拖尾 樣品樣品: tricyclic antidepressants （三環(huán)抗抑郁劑）三環(huán)抗抑郁劑） 1. desipramine（脫甲丙咪

47、嗪）脫甲丙咪嗪） 2. nortriptyline（去甲替林）去甲替林） 3. doxepin（多塞平）多塞平） 4. imipramine（丙咪嗪）丙咪嗪） 5. amitriptyline（阿米替林）阿米替林） 6. trimipramine（三甲丙咪嗪）三甲丙咪嗪） agilent technologies 48頁頁 tea對堿性成分峰形的影響對堿性成分峰形的影響 0 2.5 5.0 time (min) 1 2 3 4 5 色譜柱色譜柱: zorbax eclipse xdb-c8, 4.6 x 150 mm, 5 mm 流動相流動相: 85% 25 mm na2hpo4 : 15%

48、acn 流速流速: 1.0 ml/min. 溫度溫度: 35c usp tf 5% 1. 1.29 2. 1.33 3. 1.63 4. 2.35 5. 1.57 no tea 10 mm tea usp tf 5% 1. 1.19 2. 1.18 3. 1.20 4. 1.26 5. 1.14 time (min) 0.02.55.0 3 5 4 2 1 ph 7 樣品樣品: 1. phenylpropanolamine （去甲麻黃堿）去甲麻黃堿） 2. ephedrine（麻黃素）麻黃素） 3. amphetamine（苯丙胺）苯丙胺） 4. methamphetamine（脫氧麻黃堿）脫

49、氧麻黃堿） 5. phenteramine （苯丁胺）苯丁胺） agilent technologies 49頁頁 競爭酸對酸性組分的峰形的影響競爭酸對酸性組分的峰形的影響 色譜柱色譜柱:zorbax stablebond sb-c18 4.6 x 150 mm, 5 mm 流動相流動相:40% a: 60% acn 流速流速:1.0 ml/min. 溫度溫度:室溫室溫 樣品樣品: ibuprofen（異丁苯丙酸）異丁苯丙酸） pka 4.4 ph 3 5 mm nah2po4 tf = 1.8 ph 3 5 mm nah2po4 1% 乙酸乙酸 ph 2.5 0.1% 三氟乙酸三氟乙酸 tf

50、 = 1.0tf = 1.09 a: 乙酸和三氟乙酸均能作為競爭酸填加至流動相中乙酸和三氟乙酸均能作為競爭酸填加至流動相中 三氟乙酸由于所需濃度較低三氟乙酸由于所需濃度較低, 可作為首選可作為首選 agilent technologies 50頁頁 色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù) 5988-6467en 流動相對色譜的影響流動相對色譜的影響(te40) 液相色譜柱液相色譜柱: zorbax eclipse xdb-c8 色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 50 mm 3.5m 部件號部件號: 935967-906 uv: 254 nm 流速流速: 1 ml/ min. 室溫室溫 1. uracil 2.

51、 butylparaben 3. naphthalene 4. dipropylphthalate 5. acenaphthene 1.尿嘧啶 尿嘧啶 2.尼帕爾金丁酯 尼帕爾金丁酯 3.萘 萘 4.二丙基鄰苯二甲酸酯 二丙基鄰苯二甲酸酯 5.苊 苊 刻度混合刻度混合: dial-a-mix a: 水水 b: 甲醇甲醇, 用泵抽取用泵抽取50% b 體積比混合體積比混合: vol/vol 250 ml水水 + 250 ml甲醇甲醇, 用泵用泵 抽取抽取100%混合液混合液 定容混合定容混合: mix-to-mark 250 ml甲醇甲醇, 用水定容至用水定容至500 ml, 用泵抽取用泵抽取1

52、00%混合液混合液 預(yù)混合（重量比混合）預(yù)混合（重量比混合）: premixed (w/w) 200 g甲醇甲醇 + 200 g水水, 用泵抽取用泵抽取 100%混合液混合液 改變流動相配比方改變流動相配比方 式式, 可增加柱效可增加柱效 （提高靈敏度）（提高靈敏度） agilent technologies 51頁頁 液相分析液相分析-小訣竅小訣竅 1.提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度） 2.減小柱內(nèi)徑，可增加柱效（提高靈敏度）減小柱內(nèi)徑，可增加柱效（提高靈敏度） 3.縮短檢測器響應(yīng)時間，可增加柱效（提高靈敏度）縮短檢測器響應(yīng)時間，可增加柱效（提高靈敏度）

53、4.減小柱外體積，可增加柱效（提高靈敏度）減小柱外體積，可增加柱效（提高靈敏度） 5.使用超純硅膠，可增加柱效（提高靈敏度）使用超純硅膠，可增加柱效（提高靈敏度） 6.使用高能量氘燈，可增加柱效（提高靈敏度）使用高能量氘燈，可增加柱效（提高靈敏度） 7.使用中孔透光氘燈，可增加柱效（提高靈敏度）使用中孔透光氘燈，可增加柱效（提高靈敏度） 8.改變流動相改變流動相ph ，可增加柱效（提高靈敏度），可增加柱效（提高靈敏度） 9.改變有機相改變有機相% ，可增加柱效（提高靈敏度），可增加柱效（提高靈敏度） 10. 改變鍵合相改變鍵合相 ，可增加柱效（提高靈敏度），可增加柱效（提高靈敏度） 11. 改

54、變有機添加劑改變有機添加劑 ，可增加柱效（提高靈敏度），可增加柱效（提高靈敏度） 12. 改變流動相配比方式改變流動相配比方式 ，可增加柱效（提高靈敏度），可增加柱效（提高靈敏度） agilent technologies 52頁頁 生化生化 多肽多肽- 5988-6316en 升溫對于反相升溫對于反相 hplc分離強疏水肽的影響分離強疏水肽的影響 (b27) polypeptide 流動相流動相: a: 含含0.05%三氟乙酸的水三氟乙酸的水 b: 含含0.05%三氟乙酸的乙腈三氟乙酸的乙腈 2% b / min 進樣量進樣量: 100l (50g的的6m脲脲/5% 乙酸乙酸) uv: 21

55、0 nm 流速流速: 1 ml/min 室溫室溫 液相色譜柱液相色譜柱: zorbax stablebond-c18 色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m 部件號部件號: 880975-902 室溫室溫 300c 400c 500c 600c 700c 提高柱溫，可增加柱提高柱溫，可增加柱 效（提高靈敏度）效（提高靈敏度） agilent technologies 53頁頁 環(huán)保環(huán)保 樣品樣品: 除草劑除草劑 流動相流動相: 52/48 0.1 m乙酸乙酸 鈉鈉/甲醇甲醇, ph 6 流速流速: 0.45 ml/min 溫度溫度: 40, 90 檢測檢測: uv 除草劑除草劑

56、: 柱溫的影響柱溫的影響 herbicides: effect of column temperature 1. 西瑪津西瑪津 2. 敵草隆敵草隆 3. 撲滅津撲滅津 4. 撲滅凈撲滅凈 5. 異丙甲草胺異丙甲草胺 1. simazine 2. diuron 3. propazine 4. promet ryn 5. metolac hlor 液相色譜柱液相色譜柱: zorbax stablebond-c18 色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m 部件號部件號: 883975-902 目錄目錄p625 40 90 提高柱溫，可增加柱提高柱溫，可增加柱 效（提高靈敏度）效（提

57、高靈敏度） agilent technologies 54頁頁 生物制藥生物制藥液相色譜柱液相色譜柱: zorbax 300 stablebond-c3 色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 4.6 x 150 mm, 5m 部件號部件號: 883995-909 肽類肽類/蛋白質(zhì)蛋白質(zhì): 升溫對分離的影響升溫對分離的影響 peptides/proteins: effect of elevated temperature 樣品樣品: 多肽多肽 流動相流動相: a = 5: 95, 乙腈乙腈 : 水水, 0.10%三氟乙酸三氟乙酸 (v/v%) b = 95: 5, 乙腈乙腈 : 水水, 0.085%三氟乙酸三

58、氟乙酸 (v/v%) 梯度梯度: 在在 20 min內(nèi)內(nèi) 15-53%, 后運行時間后運行時間 12 min 流速流速: l.0 ml/min 溫度溫度: 室溫室溫 -60 檢測檢測: uv 215 nm 1. 亮氨酸腦啡亮氨酸腦啡 呔呔 2. 血管緊張素血管緊張素ii 3. 核糖核酸酶核糖核酸酶a 4. 牛胰島素牛胰島素 5. 細胞色素細胞色素c 6. 溶菌酶溶菌酶 7. 肌紅蛋白肌紅蛋白 8. 碳酸酐酶碳酸酐酶 1 . l e u c i n e enkephalin 2. angiotensin ii 3. rnase a 4. insulin(bov) 5. cytochrome c

59、6. lysozyme 7. myoglobin 8 . c a r b o n i c anhydrase 目錄目錄p611 提高柱溫，提高柱溫， 可增加柱效可增加柱效 （提高靈敏度）（提高靈敏度） agilent technologies 55頁頁 生物制藥生物制藥液相色譜柱液相色譜柱: zorbax stablebond-c8 色譜柱尺寸色譜柱尺寸: 150 mm, 5m減小毛細管內(nèi)徑來提高減小毛細管內(nèi)徑來提高 低濃度樣品的檢測靈敏度低濃度樣品的檢測靈敏度 reducing capillary id to improve sensitivity for concentration-lim

60、ited samples 流動相流動相: 60%乙腈乙腈/40%水水 流速流速: 內(nèi)徑內(nèi)徑 0.3 mm-4 ul/min 內(nèi)徑內(nèi)徑 0.5 mm-10 ul/min 內(nèi)徑內(nèi)徑 1.0 mm-50 ul/min 內(nèi)徑內(nèi)徑 4.6 mm-1.0 ul/min 溫度溫度: 室溫室溫 檢測器檢測器: uv 254 nm 樣品樣品: 200 ng聯(lián)二苯聯(lián)二苯 (100 nl) 目錄目錄p611 減小柱徑，可增減小柱徑，可增 加柱效（提高靈加柱效（提高靈 敏度）敏度） agilent technologies 56頁頁 色譜柱技術(shù)色譜柱技術(shù) 5988- 6454en 使用小體積色譜柱對于檢測器使用小體積