低溫誘導(dǎo)植物細(xì)胞染色體數(shù)目加倍

1、低溫誘導(dǎo)植物細(xì)胞染色體數(shù)目加倍、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解人工誘導(dǎo)植物多倍體的原理、方法及其在植物育種中的作用。2應(yīng)用植物染色體制片技術(shù)，鑒別誘導(dǎo)后染色體數(shù)目變化。3學(xué)會(huì)探究性實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理通過低溫阻礙細(xì)胞內(nèi)酶促反映的進(jìn)行， 從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂時(shí)形成紡錘體所需 ATP 的供應(yīng) 途徑受阻，使細(xì)胞分裂過程中完成染色體加倍而細(xì)胞不能分裂，達(dá)到染色體數(shù)目加倍。從理論上講，觀察染色體數(shù)目的最佳時(shí)期是分列中期，可當(dāng)紡錘體的行成受到抑制時(shí)， 細(xì)胞分裂就停止在了前期，不再出現(xiàn)中期、后期，只有當(dāng)細(xì)胞分裂進(jìn)入到第二周期的中期時(shí)， 才能確保低溫誘導(dǎo)染色體數(shù)目變化的成功。因此，低溫處理的時(shí)間至少要有一個(gè)半周期的時(shí) 間

2、。低溫抑制了紡錘體的形成，同時(shí)也降低了酶的活性，細(xì)胞分裂的速度減慢，細(xì)胞周期會(huì) 延長(zhǎng)。三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1. 材料：蠶豆2.試劑：秋水仙素3.儀器：超低溫冰箱四、實(shí)驗(yàn)步驟與方法(1) 培養(yǎng)根尖 蠶豆種子于30 C40 C水浴中浸種34h后，取出放入帶有濕 潤(rùn)紗布的培養(yǎng)皿中于10 C培養(yǎng)，每2d換一次水。注意水要浸過蠶豆種子體積的1/3。(2) 低溫誘導(dǎo)處理 待實(shí)驗(yàn)材料長(zhǎng)出約 1cm 左右根時(shí)，將實(shí)驗(yàn)材料平均分兩組 : 實(shí)驗(yàn)組于 2 C的冰箱中進(jìn)行低溫誘導(dǎo)培養(yǎng) 36h后(換水時(shí)注意用2 C的水，減小實(shí)驗(yàn)的誤差)，于 15 C20 C恢復(fù)常溫培養(yǎng)1012h(即小于實(shí)驗(yàn)材料一個(gè)細(xì)胞周期的時(shí)間 )。對(duì)

3、照組于 15 C 20 C 常溫進(jìn)行培養(yǎng)，注意經(jīng)常換水。(3) 取材、固定、解離、漂洗與染色 常規(guī)“植物細(xì)胞有絲分裂”制片方法 1。(4) 顯微觀察與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 隨機(jī)觀察并統(tǒng)計(jì) 10 個(gè)視野中分裂期和非分裂期細(xì)胞，計(jì)算 分裂指數(shù)(mitotic index ，Ml)。細(xì)胞分裂指數(shù)=分裂期細(xì)胞數(shù)/全部細(xì)胞數(shù) X100%。統(tǒng) 計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。五、實(shí)驗(yàn)記錄（1）培養(yǎng)根尖 蠶豆種子于30 C40 C水浴中浸種34h后，取出放入帶有濕潤(rùn)紗布的培養(yǎng)皿中于10 C培養(yǎng)，每2d換一次水。注意水要浸過蠶豆種子體積的1/3。（2）低溫誘導(dǎo)處理 待實(shí)驗(yàn)材料長(zhǎng)出約 1cm 左右根時(shí)，將實(shí)驗(yàn)材料平均分兩組 : 實(shí)

4、驗(yàn)組于 2 C的冰箱中進(jìn)行低溫誘導(dǎo)培養(yǎng) 36h后（換水時(shí)注意用2 C的水，減小實(shí)驗(yàn)的誤差），于 15 C20 C恢復(fù)常溫培養(yǎng)1012h（即小于實(shí)驗(yàn)材料一個(gè)細(xì)胞周期的時(shí)間 ）。對(duì)照組于 15 C20 C常溫進(jìn)行培養(yǎng)，注意經(jīng)常換水。3. 取材：待蠶豆根尖長(zhǎng)至 2cm 時(shí)取其根尖頂端（ 0.5-1cm ）4. 預(yù)處理:將取下的根尖置于盛有對(duì)二氯笨飽和水溶液的青霉素瓶中，浸泡處理3-4 h 。5. 固定：經(jīng)過預(yù)處理的根尖，用水清洗，用甲醛 -冰醋酸（ 3： 1 ）固定溶液固定 6-24h, 固定材料可轉(zhuǎn)入70%酒精中，于4 C冰箱中保存?zhèn)溆谩?. 解離：倒去固定液，用蒸餾水漂洗 2-3 次。7. 染色

5、：將根尖放在載玻片上，切下頂端 1-2mm, 滴加石炭酸品紅溶液進(jìn)行染色， 5min 左右即可。8. 壓片：蓋上蓋玻片，用鑷子柄輕輕敲打蓋玻片，分生組織細(xì)胞即鋪成薄薄一層；然后 用濾紙吸取多余染液，用鉛筆的橡皮頭敲打，使細(xì)胞和染色體分散。9. 鏡檢觀察：在顯微鏡下仔細(xì)觀察，尋找染色體輪廓清晰、適中、分散而不重疊的分裂 中期相。10. 封片：拔壓好的染色體標(biāo)本放在冰箱冷凍室，然后用刀片將蓋玻片快速掀開，蓋玻片和載玻片同時(shí)于37 C左右的烘箱中烘干。載玻片、蓋玻片經(jīng)二甲苯透明，滴中性樹膠，即制 成永久制片。載玻片、蓋玻片分別用新的蓋玻片、載玻片封片。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論1.本實(shí)驗(yàn)根據(jù)低溫誘導(dǎo)染色體加

6、倍和細(xì)胞同步化原理進(jìn)行改進(jìn)，即在常規(guī)低溫誘導(dǎo)后， 恢復(fù)常溫培養(yǎng)，時(shí)間小于實(shí)驗(yàn)材料一個(gè)細(xì)胞周期，再進(jìn)行后續(xù)有絲分裂臨時(shí)裝片制作。鏡檢 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組有絲分裂指數(shù)明顯高于對(duì)照組 （ 圖 1、表 1） 。結(jié)果提示低溫處理抑制紡 錘體形成，細(xì)胞分裂就停止在了分裂前期，相當(dāng)于細(xì)胞同步化過程。恢復(fù)常溫培養(yǎng)一個(gè)細(xì)胞可編輯周期內(nèi)，原本阻滯在分裂前期的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行分裂，便出現(xiàn)一個(gè)明顯的細(xì)胞分裂高峰，可見數(shù)量較多的分裂期細(xì)胞圖1蠶豆根尖實(shí)驗(yàn)組有絲分裂圖及分裂期細(xì)胞表1蠶豆根尖常溫培養(yǎng)與低溫誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂指數(shù)處理方法10個(gè)視野 細(xì)胞數(shù)10個(gè)視野細(xì)胞 處丁分裂期數(shù)分裂扌斤數(shù)帯E E姿524214%低溫誘導(dǎo)71613

7、47%注：經(jīng)卡方數(shù)據(jù)檢驗(yàn)得：P v 0.05，蠶豆根尖實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞分裂差異顯著。2. 討論(1)恢復(fù)常溫培養(yǎng)步驟的改進(jìn) 根據(jù)上述低溫誘導(dǎo)染色體加倍和細(xì)胞同步化原理14，對(duì)本實(shí)驗(yàn)現(xiàn)有方案改進(jìn)后，通過比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞分裂指數(shù)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀 化、數(shù)據(jù)化，結(jié)果檢驗(yàn)更加合理可信。在中學(xué)教學(xué)中，學(xué)生通過該實(shí)驗(yàn)方案的操作，加深對(duì) 低溫誘導(dǎo)染色體數(shù)目變化本質(zhì)的理解，并進(jìn)一步延伸其在生產(chǎn)實(shí)踐例如細(xì)胞同步化中的應(yīng)用， 從而在真正意義上達(dá)成知識(shí)與技能、過程與方法、情感態(tài)度與價(jià)值觀三維目標(biāo)。(2)關(guān)于實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)問題 具體討論如下：選材 前期工作通過比較多種實(shí)驗(yàn)材料，發(fā) 現(xiàn)洋蔥、蠶豆為本實(shí)驗(yàn)的理想材料。

8、首先兩種常見植物為學(xué)生所熟知的，選取其作為實(shí)驗(yàn)材 料，符合課程標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于“注重與現(xiàn)實(shí)生活的聯(lián)系”的課程理念；其次蠶豆、洋蔥的染色體數(shù)目較少，染色體形態(tài)明顯，易在顯微鏡下觀察。再者兩者的根尖易培養(yǎng)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單。以 蠶豆為實(shí)驗(yàn)材料的須注意：5注意購(gòu)買渠道。建議從正規(guī)的種子公司購(gòu)買當(dāng)年的蠶豆種子， 以保證種子的萌發(fā)率。根據(jù)農(nóng)作經(jīng)驗(yàn)，蠶豆一般在暮春收種，當(dāng)年入冬之后再次播種。因此， 在播種當(dāng)年的秋天才可能購(gòu)買到當(dāng)年收獲的新種。教師應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)開展的時(shí)間，提前準(zhǔn)備好 蠶豆種子；注意培養(yǎng)溫度。蠶豆在初冬播種，因此其種子萌發(fā)的適宜溫度大約是10 C。而根據(jù)多數(shù)中學(xué)的教學(xué)進(jìn)度，一般在入夏時(shí)開展本實(shí)驗(yàn)。因此蠶豆培

9、養(yǎng)需要在冷柜中保持 10C 左右進(jìn)行;蠶豆在培養(yǎng)之前需要放在 30 C40 C的水浴鍋中進(jìn)行浸種，有利于蠶豆種子 快速萌發(fā)。待胚根萌發(fā)至 1cm 左右，即根尖細(xì)胞分裂旺盛時(shí)，進(jìn)行低溫處理。( 2) 低溫誘導(dǎo)溫度和時(shí)間及常溫的恢復(fù)培養(yǎng) 以洋蔥和蠶豆為實(shí)驗(yàn)材料， 低溫處理的的最 佳溫度應(yīng)控制在2 C4 C。關(guān)于低溫誘導(dǎo)時(shí)間，應(yīng)視具體實(shí)驗(yàn)材料而定?，F(xiàn)有資料對(duì)同一 種材料說法也不一。就本實(shí)驗(yàn)方案選用的蠶豆而言，低溫誘導(dǎo) 36h ，細(xì)胞同步化效果最佳。 本實(shí)驗(yàn)方案關(guān)鍵步驟是低溫誘導(dǎo)后恢復(fù)常溫培養(yǎng)?；謴?fù)培養(yǎng)的時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制在實(shí)驗(yàn)材料一 個(gè)細(xì)胞周期以內(nèi)。這樣，經(jīng)前期低溫處理同步化的細(xì)胞，在恢復(fù)常溫培養(yǎng)后，才

10、會(huì)出現(xiàn)一個(gè) 明顯的細(xì)胞分裂高峰。如果恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間超過一個(gè)細(xì)胞周期， 樣品的細(xì)胞分裂指數(shù)將恢復(fù)為 3% 4%。就本實(shí)驗(yàn) 方案，由于蠶豆根尖分生區(qū)細(xì)胞細(xì)胞周期為 17 . 3h，因此建議常溫恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)間為 10 12h 。( 3) 取材、固定、解離和染色 建議取材后將根尖固定。固定液能迅速穿透細(xì)胞，將細(xì)胞 的形態(tài)固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，達(dá)到優(yōu)良的染色效果1。用固定液固定之后的材料要用 95% 的酒精進(jìn)行充分沖洗， 否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)材料的解離。 解離充分但不能過度。 具體時(shí) 間根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)材料區(qū)別對(duì)待。 例如，蠶豆的根尖由于細(xì)胞壁比較厚， 解離的時(shí)間要 25 30min，也可以在30 C左右的

11、水浴鍋中進(jìn)行解離。 洋蔥根尖細(xì)胞常溫解離的時(shí)間為 20min。 染色之前要用蒸餾水將解離液沖洗干凈，必要時(shí)可用05mol/L 氫氧化鈉略洗以中和解離液，再用蒸餾水充分沖洗，以確保染色的效果。建議使用改良苯酚品紅染液，能夠特異對(duì)細(xì) 胞核染色，而細(xì)胞質(zhì)幾乎無色透明，易于觀察。染色時(shí)間一般為 5min 。七、參考文獻(xiàn)1徐作英，王重力 2009 中學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)論 北京: 北京師范大學(xué)出版社， 321 3222馮立新，肖桂芝，岳雪玲 2005 低溫對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞的同步化作用 承德醫(yī) 學(xué)院學(xué)報(bào)，22( 2) : 96983毛春娜，張愛民，薛建平 2011 低溫處理對(duì)半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞同步化的影響 中 國(guó)中藥雜志， 36( 8) :