內科學(消化系病)專業(yè)畢業(yè)論文[精品論文]原發(fā)性膽汁性肝硬化比較蛋白質組學的基礎與臨床研究

1、內科學(消化系病)專業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 原發(fā)性膽汁性肝硬化比較蛋白質組學的基礎與臨床研究關鍵詞：原發(fā)性膽汁性肝硬化 分子標志物 蛋白組學 早期診斷 發(fā)病機制摘要：研究背景及目的: 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，pbc)是一種主要以肝內中小膽管的非化膿性進行性炎性損傷為特征的自身免疫性疾病。pbc起病隱匿，進展緩慢，最終可導致肝硬化等終末期肝病，其確切的發(fā)病機制至今尚不清楚。目前，pbc的診斷主要依據(jù)臨床生化及抗線粒體抗體(ama)的檢測，但是臨床上仍有部分ama陰性的pbc患者容易漏診。熊去氧膽酸(udca)是其主要治療藥物，但是其對某些pbc的遠期

2、治療效果并不理想。 因而如何早期診斷pbc，如何進行有效的干預處理是pbc研究的一個方向。由于人體諸多生命功能最終是通過蛋白質來完成的，在疾病的發(fā)生過程中，人體內蛋白質的種類和含量也會發(fā)生相應的改變，這就為我們對pbc的研究提供了一個思路。而蛋白質組學(proteomics)正是以蛋白質組為研究對象，分析細胞內、外動態(tài)變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質分子之間的相互作用與聯(lián)系。迄今國內外有關蛋白質組學技術研究pbc的相關報道較少。我們從蛋白質組學的角度出發(fā)，利用同位素標記相對和絕對定量(itraq)聯(lián)合液帽色譜-質譜(lc-ms/ms)技術通過比較pbc、hbv肝纖維化、hbv肝

3、硬化患者和正常對照人群的血清蛋白質，篩選、鑒定pbc患者血清差異表達蛋白，并進行驗證，旨在對pbc發(fā)病機制和診治研究提供某些理論依據(jù)。 與此同時，疾病的動物模型也是研究疾病的一個重要方法。目前pbc動物模型大致分為三類：抗原免疫、化學物質誘導和基因缺陷。但是這些動物模型在肝臟病理變化和/或血清學生化以及自身抗體的表達等方面與人類：pbc總是存在一定差異。國外有文獻報道部分肝炎患者在利用ifn-治療的過程中會繼發(fā)pbc，而我們在臨床工作中也有類似發(fā)現(xiàn)，這給了我們一個建立pbc動物模型的啟示-通過poly i：c腹腔注射，誘導小鼠體內ifn-水平升高，進而建立pbc動物模型。同時，利用itraq和

4、lc-ms/ms技術對不同階段pbc動物模型及其對照組血清及肝臟組織中的蛋白質進行比較，篩選、鑒定pbc動物模型血清及肝組織差異表達蛋白，并進行驗證，以期通過pbc動物模型的研究對人pbc可能的發(fā)病機制和診斷有所啟示。 方法: 一、pbc動物模型建立 1、6-8周齡c57bl/6雌性小鼠80只，體重約20g，隨機分為pbs對照組和poly i：c模型組，spf級飼養(yǎng)。pbs液稀釋poly i：c至1mg/ml。模型組給予poly i：c5mg/kg腹腔內注射2次/周，對照組給予pbs5mg/kg腹腔內注射2次/周；每組分別與第4周、8周、12周和16周各處死10只。 2、血清樣品制備眼球摘除取

5、血，41400g離心5分鐘，取血清，部分血清行生化及自身抗體檢測，部分血清立即置于-80保存?zhèn)溆谩?3、肝臟組織樣品制備斷頸處死后，取肝臟于冰生理鹽水中清洗，部分肝臟置入4福爾馬林液固定，石蠟包埋，行he染色和ck19免疫組化染色，光鏡下觀察肝臟病理變化及肝內膽管變化；部分肝臟立即置于-80保存?zhèn)溆谩?二、pbc動物模型血清及肝臟組織差異表達蛋白篩選、鑒定 1、血清及肝臟組織樣品制備將每組血清各自混合，41400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白；肝臟組織于pbs中剪碎洗去血液；液氮研磨混合；按照裂解液體積：組織重量(v：w)=5：1的關系加入裂解液(7m尿素，2m硫脲，0.1pmsf，0.5d

6、tt)，混懸，冰上裂解半小時。 2、樣品蛋白質定量通過bradford法測定各組樣品中的總蛋白含量。 3、蛋白質的消化和標記加入還原試劑，60反應1小時；加入半胱氨酸封閉試劑，室溫處理10分鐘；每管各加入預冷的丙酮(丙酮：樣品體積比=5：1)，-20沉淀1小時后，12000 rpm，4，離心20分鐘，取沉淀；加入溶解液20l，混懸，充分溶解樣品；按照酶：蛋白質=1：20的比例加入胰蛋白酶，37酶解過夜；itraqtm reagent114，115，116，117分別標記正常對照、4周、12周和16周模型組，共4管，各管標記試劑中加入70l乙醇，混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應一小時，之后各加

7、入三倍體積水，使標記試劑分解；合并各管標記好的樣品，真空冷凍干燥。 4、差異表達蛋白質譜分析、篩選及鑒定不同標記的itraq標記蛋白樣品混合，經(jīng)第一維強陽離子柱(scx)分離，共收取14個梯度進行第二維分析；第二維反相色譜-質譜聯(lián)用(rplc-ms)，色譜分離70分鐘后行質譜鑒定，ms掃描范圍m/z400-1800，ms/ms掃描范圍m/z100-2000。經(jīng)生物信息學處理，篩選出統(tǒng)計學上差異明顯的蛋白質峰進行搜庫、鑒定。 三、人pbc血清差異表達蛋白篩選、鑒定及驗證 1、血清樣品制備正常人群對照、pbc、hbv肝纖維化和hbv肝硬化患者各20例，清晨空腹取血，4靜置1小時，41400g離心5

8、分鐘，取上清，分裝后立即置于-80保存?zhèn)溆茫粚⒚拷M血清各自混合成1管，41400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白。 2、樣品蛋白質定量參見動物模型樣品蛋白質定量。 3、蛋白質的消化和標記參見動物模型的蛋白質消化及標記。 4、差異表達蛋白質譜分析、篩選及鑒定參見動物模型質譜分析方法。 5、利用western免疫印跡技術驗證淋巴管內皮透明質酸受體1(lyve-1)和鋅-2糖蛋白(azgp1)在pbc患者與正常人群血清中的表達差異；利用elisa法驗證視黃醇結合蛋白4(rbp4)在pbc患者與正常人群血清中的表達差異。 結論: 1、poly i：c腹腔注射c57bl/6小鼠能夠成功構建與人pbc在組

9、織病理和血清學表現(xiàn)類似的pbc動物模型。 2、itraq結合lc-ms/ms技術能夠快速、有效地進行差異蛋白質組學研究，同時，我們利用western免疫印跡技術和elisa方法對部分鑒定蛋白進行驗證的結果也證明了itraq結合lc-ms/ms技術在蛋白定性及半定量的蛋白質組學研究方面的可靠性。 3、pbc動物模型與對照組動物之間在血清及肝組織的蛋白質表達上均存在明顯差異，在蛋白質生物學功能上分別涉及脂質轉運和代謝、免疫應答、細胞粘附和運動、能量代謝等諸多方面；而且部分差異蛋白表達水平與pbc動物模型的進程呈現(xiàn)出明顯的正相關或負相關性，這對于后續(xù)對該pbc模型的發(fā)生機制進行進一步的功能蛋白質組學

10、研究打下了基礎。 4、pbc患者、hbv肝纖維化患者、hbv肝硬化患者及正常人群其相互之間在血清蛋白質表達上均存在顯著差異，在蛋白質生物學功能上分別涉及脂質轉運及代謝、載體類、細胞粘附及運動、免疫應答、凝血相關、蛋白水解酶類等諸多方面；特別是相對于正常人群、hbv肝纖維化及hbv肝硬化患者，我們發(fā)現(xiàn)fn1、gc、lyve1、a2m、agt、albg、apoc-、apoc-和ighm等9個蛋白質在pbc患者血清中與上述三組均存在顯著的表達差異，這些蛋白質可能與pbc的發(fā)病機制密切相關，有待于進一步研究。 5、通過對pbc患者血清差異蛋白質組學與：pbc動物模型血清和肝組織差異蛋白質組學的比較研究

11、，我們發(fā)現(xiàn)，諸如apoc等載脂蛋白家族蛋白在pbc患者及pbc動物模型中均呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，提示脂質代謝紊亂與人：pbc和pbc動物模型的進展關系密切。 6、本研究通過比較生理和不同病理條件下血清蛋白質組在表達水平上的改變情況，從而發(fā)現(xiàn)和鑒定出pbc疾病相關的蛋白質，為在整體水平發(fā)掘和尋求潛在藥物靶標以及早期診斷、治療的分子標志物提供了可能，同時也為pbc的病理機制研究提出了一個新的研究思路和方法。 7、目前有關差異表達蛋白的驗證及功能研究還在進一步進行中。正文內容 研究背景及目的: 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，pbc)是一種主要以肝內中小膽管的非化膿

12、性進行性炎性損傷為特征的自身免疫性疾病。pbc起病隱匿，進展緩慢，最終可導致肝硬化等終末期肝病，其確切的發(fā)病機制至今尚不清楚。目前，pbc的診斷主要依據(jù)臨床生化及抗線粒體抗體(ama)的檢測，但是臨床上仍有部分ama陰性的pbc患者容易漏診。熊去氧膽酸(udca)是其主要治療藥物，但是其對某些pbc的遠期治療效果并不理想。 因而如何早期診斷pbc，如何進行有效的干預處理是pbc研究的一個方向。由于人體諸多生命功能最終是通過蛋白質來完成的，在疾病的發(fā)生過程中，人體內蛋白質的種類和含量也會發(fā)生相應的改變，這就為我們對pbc的研究提供了一個思路。而蛋白質組學(proteomics)正是以蛋白質組為研

13、究對象，分析細胞內、外動態(tài)變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質分子之間的相互作用與聯(lián)系。迄今國內外有關蛋白質組學技術研究pbc的相關報道較少。我們從蛋白質組學的角度出發(fā)，利用同位素標記相對和絕對定量(itraq)聯(lián)合液帽色譜-質譜(lc-ms/ms)技術通過比較pbc、hbv肝纖維化、hbv肝硬化患者和正常對照人群的血清蛋白質，篩選、鑒定pbc患者血清差異表達蛋白，并進行驗證，旨在對pbc發(fā)病機制和診治研究提供某些理論依據(jù)。 與此同時，疾病的動物模型也是研究疾病的一個重要方法。目前pbc動物模型大致分為三類：抗原免疫、化學物質誘導和基因缺陷。但是這些動物模型在肝臟病理變化和/或血清

14、學生化以及自身抗體的表達等方面與人類：pbc總是存在一定差異。國外有文獻報道部分肝炎患者在利用ifn-治療的過程中會繼發(fā)pbc，而我們在臨床工作中也有類似發(fā)現(xiàn)，這給了我們一個建立pbc動物模型的啟示-通過poly i：c腹腔注射，誘導小鼠體內ifn-水平升高，進而建立pbc動物模型。同時，利用itraq和lc-ms/ms技術對不同階段pbc動物模型及其對照組血清及肝臟組織中的蛋白質進行比較，篩選、鑒定pbc動物模型血清及肝組織差異表達蛋白，并進行驗證，以期通過pbc動物模型的研究對人pbc可能的發(fā)病機制和診斷有所啟示。 方法: 一、pbc動物模型建立 1、6-8周齡c57bl/6雌性小鼠80只

15、，體重約20g，隨機分為pbs對照組和poly i：c模型組，spf級飼養(yǎng)。pbs液稀釋poly i：c至1mg/ml。模型組給予poly i：c5mg/kg腹腔內注射2次/周，對照組給予pbs5mg/kg腹腔內注射2次/周；每組分別與第4周、8周、12周和16周各處死10只。 2、血清樣品制備眼球摘除取血，41400g離心5分鐘，取血清，部分血清行生化及自身抗體檢測，部分血清立即置于-80保存?zhèn)溆谩?3、肝臟組織樣品制備斷頸處死后，取肝臟于冰生理鹽水中清洗，部分肝臟置入4福爾馬林液固定，石蠟包埋，行he染色和ck19免疫組化染色，光鏡下觀察肝臟病理變化及肝內膽管變化；部分肝臟立即置于-80保

16、存?zhèn)溆谩?二、pbc動物模型血清及肝臟組織差異表達蛋白篩選、鑒定 1、血清及肝臟組織樣品制備將每組血清各自混合，41400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白；肝臟組織于pbs中剪碎洗去血液；液氮研磨混合；按照裂解液體積：組織重量(v：w)=5：1的關系加入裂解液(7m尿素，2m硫脲，0.1pmsf，0.5dtt)，混懸，冰上裂解半小時。 2、樣品蛋白質定量通過bradford法測定各組樣品中的總蛋白含量。 3、蛋白質的消化和標記加入還原試劑，60反應1小時；加入半胱氨酸封閉試劑，室溫處理10分鐘；每管各加入預冷的丙酮(丙酮：樣品體積比=5：1)，-20沉淀1小時后，12000 rpm，4，離心2

17、0分鐘，取沉淀；加入溶解液20l，混懸，充分溶解樣品；按照酶：蛋白質=1：20的比例加入胰蛋白酶，37酶解過夜；itraqtm reagent114，115，116，117分別標記正常對照、4周、12周和16周模型組，共4管，各管標記試劑中加入70l乙醇，混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應一小時，之后各加入三倍體積水，使標記試劑分解；合并各管標記好的樣品，真空冷凍干燥。 4、差異表達蛋白質譜分析、篩選及鑒定不同標記的itraq標記蛋白樣品混合，經(jīng)第一維強陽離子柱(scx)分離，共收取14個梯度進行第二維分析；第二維反相色譜-質譜聯(lián)用(rplc-ms)，色譜分離70分鐘后行質譜鑒定，ms掃描范圍

18、m/z400-1800，ms/ms掃描范圍m/z100-2000。經(jīng)生物信息學處理，篩選出統(tǒng)計學上差異明顯的蛋白質峰進行搜庫、鑒定。 三、人pbc血清差異表達蛋白篩選、鑒定及驗證 1、血清樣品制備正常人群對照、pbc、hbv肝纖維化和hbv肝硬化患者各20例，清晨空腹取血，4靜置1小時，41400g離心5分鐘，取上清，分裝后立即置于-80保存?zhèn)溆?；將每組血清各自混合成1管，41400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白。 2、樣品蛋白質定量參見動物模型樣品蛋白質定量。 3、蛋白質的消化和標記參見動物模型的蛋白質消化及標記。 4、差異表達蛋白質譜分析、篩選及鑒定參見動物模型質譜分析方法。 5、利用w

19、estern免疫印跡技術驗證淋巴管內皮透明質酸受體1(lyve-1)和鋅-2糖蛋白(azgp1)在pbc患者與正常人群血清中的表達差異；利用elisa法驗證視黃醇結合蛋白4(rbp4)在pbc患者與正常人群血清中的表達差異。 結論: 1、poly i：c腹腔注射c57bl/6小鼠能夠成功構建與人pbc在組織病理和血清學表現(xiàn)類似的pbc動物模型。 2、itraq結合lc-ms/ms技術能夠快速、有效地進行差異蛋白質組學研究，同時，我們利用western免疫印跡技術和elisa方法對部分鑒定蛋白進行驗證的結果也證明了itraq結合lc-ms/ms技術在蛋白定性及半定量的蛋白質組學研究方面的可靠性。

20、 3、pbc動物模型與對照組動物之間在血清及肝組織的蛋白質表達上均存在明顯差異，在蛋白質生物學功能上分別涉及脂質轉運和代謝、免疫應答、細胞粘附和運動、能量代謝等諸多方面；而且部分差異蛋白表達水平與pbc動物模型的進程呈現(xiàn)出明顯的正相關或負相關性，這對于后續(xù)對該pbc模型的發(fā)生機制進行進一步的功能蛋白質組學研究打下了基礎。 4、pbc患者、hbv肝纖維化患者、hbv肝硬化患者及正常人群其相互之間在血清蛋白質表達上均存在顯著差異，在蛋白質生物學功能上分別涉及脂質轉運及代謝、載體類、細胞粘附及運動、免疫應答、凝血相關、蛋白水解酶類等諸多方面；特別是相對于正常人群、hbv肝纖維化及hbv肝硬化患者，我

21、們發(fā)現(xiàn)fn1、gc、lyve1、a2m、agt、albg、apoc-、apoc-和ighm等9個蛋白質在pbc患者血清中與上述三組均存在顯著的表達差異，這些蛋白質可能與pbc的發(fā)病機制密切相關，有待于進一步研究。 5、通過對pbc患者血清差異蛋白質組學與：pbc動物模型血清和肝組織差異蛋白質組學的比較研究，我們發(fā)現(xiàn)，諸如apoc等載脂蛋白家族蛋白在pbc患者及pbc動物模型中均呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，提示脂質代謝紊亂與人：pbc和pbc動物模型的進展關系密切。 6、本研究通過比較生理和不同病理條件下血清蛋白質組在表達水平上的改變情況，從而發(fā)現(xiàn)和鑒定出pbc疾病相關的蛋白質，為在整體水平發(fā)掘和尋求潛在藥

22、物靶標以及早期診斷、治療的分子標志物提供了可能，同時也為pbc的病理機制研究提出了一個新的研究思路和方法。 7、目前有關差異表達蛋白的驗證及功能研究還在進一步進行中。研究背景及目的: 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，pbc)是一種主要以肝內中小膽管的非化膿性進行性炎性損傷為特征的自身免疫性疾病。pbc起病隱匿，進展緩慢，最終可導致肝硬化等終末期肝病，其確切的發(fā)病機制至今尚不清楚。目前，pbc的診斷主要依據(jù)臨床生化及抗線粒體抗體(ama)的檢測，但是臨床上仍有部分ama陰性的pbc患者容易漏診。熊去氧膽酸(udca)是其主要治療藥物，但是其對某些pbc的遠

23、期治療效果并不理想。 因而如何早期診斷pbc，如何進行有效的干預處理是pbc研究的一個方向。由于人體諸多生命功能最終是通過蛋白質來完成的，在疾病的發(fā)生過程中，人體內蛋白質的種類和含量也會發(fā)生相應的改變，這就為我們對pbc的研究提供了一個思路。而蛋白質組學(proteomics)正是以蛋白質組為研究對象，分析細胞內、外動態(tài)變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質分子之間的相互作用與聯(lián)系。迄今國內外有關蛋白質組學技術研究pbc的相關報道較少。我們從蛋白質組學的角度出發(fā)，利用同位素標記相對和絕對定量(itraq)聯(lián)合液帽色譜-質譜(lc-ms/ms)技術通過比較pbc、hbv肝纖維化、hbv

24、肝硬化患者和正常對照人群的血清蛋白質，篩選、鑒定pbc患者血清差異表達蛋白，并進行驗證，旨在對pbc發(fā)病機制和診治研究提供某些理論依據(jù)。 與此同時，疾病的動物模型也是研究疾病的一個重要方法。目前pbc動物模型大致分為三類：抗原免疫、化學物質誘導和基因缺陷。但是這些動物模型在肝臟病理變化和/或血清學生化以及自身抗體的表達等方面與人類：pbc總是存在一定差異。國外有文獻報道部分肝炎患者在利用ifn-治療的過程中會繼發(fā)pbc，而我們在臨床工作中也有類似發(fā)現(xiàn)，這給了我們一個建立pbc動物模型的啟示-通過poly i：c腹腔注射，誘導小鼠體內ifn-水平升高，進而建立pbc動物模型。同時，利用itraq

25、和lc-ms/ms技術對不同階段pbc動物模型及其對照組血清及肝臟組織中的蛋白質進行比較，篩選、鑒定pbc動物模型血清及肝組織差異表達蛋白，并進行驗證，以期通過pbc動物模型的研究對人pbc可能的發(fā)病機制和診斷有所啟示。 方法: 一、pbc動物模型建立 1、6-8周齡c57bl/6雌性小鼠80只，體重約20g，隨機分為pbs對照組和poly i：c模型組，spf級飼養(yǎng)。pbs液稀釋poly i：c至1mg/ml。模型組給予poly i：c5mg/kg腹腔內注射2次/周，對照組給予pbs5mg/kg腹腔內注射2次/周；每組分別與第4周、8周、12周和16周各處死10只。 2、血清樣品制備眼球摘除

26、取血，41400g離心5分鐘，取血清，部分血清行生化及自身抗體檢測，部分血清立即置于-80保存?zhèn)溆谩?3、肝臟組織樣品制備斷頸處死后，取肝臟于冰生理鹽水中清洗，部分肝臟置入4福爾馬林液固定，石蠟包埋，行he染色和ck19免疫組化染色，光鏡下觀察肝臟病理變化及肝內膽管變化；部分肝臟立即置于-80保存?zhèn)溆谩?二、pbc動物模型血清及肝臟組織差異表達蛋白篩選、鑒定 1、血清及肝臟組織樣品制備將每組血清各自混合，41400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白；肝臟組織于pbs中剪碎洗去血液；液氮研磨混合；按照裂解液體積：組織重量(v：w)=5：1的關系加入裂解液(7m尿素，2m硫脲，0.1pmsf，0.5

27、dtt)，混懸，冰上裂解半小時。 2、樣品蛋白質定量通過bradford法測定各組樣品中的總蛋白含量。 3、蛋白質的消化和標記加入還原試劑，60反應1小時；加入半胱氨酸封閉試劑，室溫處理10分鐘；每管各加入預冷的丙酮(丙酮：樣品體積比=5：1)，-20沉淀1小時后，12000 rpm，4，離心20分鐘，取沉淀；加入溶解液20l，混懸，充分溶解樣品；按照酶：蛋白質=1：20的比例加入胰蛋白酶，37酶解過夜；itraqtm reagent114，115，116，117分別標記正常對照、4周、12周和16周模型組，共4管，各管標記試劑中加入70l乙醇，混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應一小時，之后各

28、加入三倍體積水，使標記試劑分解；合并各管標記好的樣品，真空冷凍干燥。 4、差異表達蛋白質譜分析、篩選及鑒定不同標記的itraq標記蛋白樣品混合，經(jīng)第一維強陽離子柱(scx)分離，共收取14個梯度進行第二維分析；第二維反相色譜-質譜聯(lián)用(rplc-ms)，色譜分離70分鐘后行質譜鑒定，ms掃描范圍m/z400-1800，ms/ms掃描范圍m/z100-2000。經(jīng)生物信息學處理，篩選出統(tǒng)計學上差異明顯的蛋白質峰進行搜庫、鑒定。 三、人pbc血清差異表達蛋白篩選、鑒定及驗證 1、血清樣品制備正常人群對照、pbc、hbv肝纖維化和hbv肝硬化患者各20例，清晨空腹取血，4靜置1小時，41400g離心

29、5分鐘，取上清，分裝后立即置于-80保存?zhèn)溆?；將每組血清各自混合成1管，41400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白。 2、樣品蛋白質定量參見動物模型樣品蛋白質定量。 3、蛋白質的消化和標記參見動物模型的蛋白質消化及標記。 4、差異表達蛋白質譜分析、篩選及鑒定參見動物模型質譜分析方法。 5、利用western免疫印跡技術驗證淋巴管內皮透明質酸受體1(lyve-1)和鋅-2糖蛋白(azgp1)在pbc患者與正常人群血清中的表達差異；利用elisa法驗證視黃醇結合蛋白4(rbp4)在pbc患者與正常人群血清中的表達差異。 結論: 1、poly i：c腹腔注射c57bl/6小鼠能夠成功構建與人pbc在

30、組織病理和血清學表現(xiàn)類似的pbc動物模型。 2、itraq結合lc-ms/ms技術能夠快速、有效地進行差異蛋白質組學研究，同時，我們利用western免疫印跡技術和elisa方法對部分鑒定蛋白進行驗證的結果也證明了itraq結合lc-ms/ms技術在蛋白定性及半定量的蛋白質組學研究方面的可靠性。 3、pbc動物模型與對照組動物之間在血清及肝組織的蛋白質表達上均存在明顯差異，在蛋白質生物學功能上分別涉及脂質轉運和代謝、免疫應答、細胞粘附和運動、能量代謝等諸多方面；而且部分差異蛋白表達水平與pbc動物模型的進程呈現(xiàn)出明顯的正相關或負相關性，這對于后續(xù)對該pbc模型的發(fā)生機制進行進一步的功能蛋白質組

31、學研究打下了基礎。 4、pbc患者、hbv肝纖維化患者、hbv肝硬化患者及正常人群其相互之間在血清蛋白質表達上均存在顯著差異，在蛋白質生物學功能上分別涉及脂質轉運及代謝、載體類、細胞粘附及運動、免疫應答、凝血相關、蛋白水解酶類等諸多方面；特別是相對于正常人群、hbv肝纖維化及hbv肝硬化患者，我們發(fā)現(xiàn)fn1、gc、lyve1、a2m、agt、albg、apoc-、apoc-和ighm等9個蛋白質在pbc患者血清中與上述三組均存在顯著的表達差異，這些蛋白質可能與pbc的發(fā)病機制密切相關，有待于進一步研究。 5、通過對pbc患者血清差異蛋白質組學與：pbc動物模型血清和肝組織差異蛋白質組學的比較研

32、究，我們發(fā)現(xiàn)，諸如apoc等載脂蛋白家族蛋白在pbc患者及pbc動物模型中均呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，提示脂質代謝紊亂與人：pbc和pbc動物模型的進展關系密切。 6、本研究通過比較生理和不同病理條件下血清蛋白質組在表達水平上的改變情況，從而發(fā)現(xiàn)和鑒定出pbc疾病相關的蛋白質，為在整體水平發(fā)掘和尋求潛在藥物靶標以及早期診斷、治療的分子標志物提供了可能，同時也為pbc的病理機制研究提出了一個新的研究思路和方法。 7、目前有關差異表達蛋白的驗證及功能研究還在進一步進行中。研究背景及目的: 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，pbc)是一種主要以肝內中小膽管的非化膿性進行性

33、炎性損傷為特征的自身免疫性疾病。pbc起病隱匿，進展緩慢，最終可導致肝硬化等終末期肝病，其確切的發(fā)病機制至今尚不清楚。目前，pbc的診斷主要依據(jù)臨床生化及抗線粒體抗體(ama)的檢測，但是臨床上仍有部分ama陰性的pbc患者容易漏診。熊去氧膽酸(udca)是其主要治療藥物，但是其對某些pbc的遠期治療效果并不理想。 因而如何早期診斷pbc，如何進行有效的干預處理是pbc研究的一個方向。由于人體諸多生命功能最終是通過蛋白質來完成的，在疾病的發(fā)生過程中，人體內蛋白質的種類和含量也會發(fā)生相應的改變，這就為我們對pbc的研究提供了一個思路。而蛋白質組學(proteomics)正是以蛋白質組為研究對象，

34、分析細胞內、外動態(tài)變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質分子之間的相互作用與聯(lián)系。迄今國內外有關蛋白質組學技術研究pbc的相關報道較少。我們從蛋白質組學的角度出發(fā)，利用同位素標記相對和絕對定量(itraq)聯(lián)合液帽色譜-質譜(lc-ms/ms)技術通過比較pbc、hbv肝纖維化、hbv肝硬化患者和正常對照人群的血清蛋白質，篩選、鑒定pbc患者血清差異表達蛋白，并進行驗證，旨在對pbc發(fā)病機制和診治研究提供某些理論依據(jù)。 與此同時，疾病的動物模型也是研究疾病的一個重要方法。目前pbc動物模型大致分為三類：抗原免疫、化學物質誘導和基因缺陷。但是這些動物模型在肝臟病理變化和/或血清學生化以

35、及自身抗體的表達等方面與人類：pbc總是存在一定差異。國外有文獻報道部分肝炎患者在利用ifn-治療的過程中會繼發(fā)pbc，而我們在臨床工作中也有類似發(fā)現(xiàn)，這給了我們一個建立pbc動物模型的啟示-通過poly i：c腹腔注射，誘導小鼠體內ifn-水平升高，進而建立pbc動物模型。同時，利用itraq和lc-ms/ms技術對不同階段pbc動物模型及其對照組血清及肝臟組織中的蛋白質進行比較，篩選、鑒定pbc動物模型血清及肝組織差異表達蛋白，并進行驗證，以期通過pbc動物模型的研究對人pbc可能的發(fā)病機制和診斷有所啟示。 方法: 一、pbc動物模型建立 1、6-8周齡c57bl/6雌性小鼠80只，體重約

36、20g，隨機分為pbs對照組和poly i：c模型組，spf級飼養(yǎng)。pbs液稀釋poly i：c至1mg/ml。模型組給予poly i：c5mg/kg腹腔內注射2次/周，對照組給予pbs5mg/kg腹腔內注射2次/周；每組分別與第4周、8周、12周和16周各處死10只。 2、血清樣品制備眼球摘除取血，41400g離心5分鐘，取血清，部分血清行生化及自身抗體檢測，部分血清立即置于-80保存?zhèn)溆谩?3、肝臟組織樣品制備斷頸處死后，取肝臟于冰生理鹽水中清洗，部分肝臟置入4福爾馬林液固定，石蠟包埋，行he染色和ck19免疫組化染色，光鏡下觀察肝臟病理變化及肝內膽管變化；部分肝臟立即置于-80保存?zhèn)溆谩?/p>

37、 二、pbc動物模型血清及肝臟組織差異表達蛋白篩選、鑒定 1、血清及肝臟組織樣品制備將每組血清各自混合，41400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白；肝臟組織于pbs中剪碎洗去血液；液氮研磨混合；按照裂解液體積：組織重量(v：w)=5：1的關系加入裂解液(7m尿素，2m硫脲，0.1pmsf，0.5dtt)，混懸，冰上裂解半小時。 2、樣品蛋白質定量通過bradford法測定各組樣品中的總蛋白含量。 3、蛋白質的消化和標記加入還原試劑，60反應1小時；加入半胱氨酸封閉試劑，室溫處理10分鐘；每管各加入預冷的丙酮(丙酮：樣品體積比=5：1)，-20沉淀1小時后，12000 rpm，4，離心20分鐘，

38、取沉淀；加入溶解液20l，混懸，充分溶解樣品；按照酶：蛋白質=1：20的比例加入胰蛋白酶，37酶解過夜；itraqtm reagent114，115，116，117分別標記正常對照、4周、12周和16周模型組，共4管，各管標記試劑中加入70l乙醇，混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應一小時，之后各加入三倍體積水，使標記試劑分解；合并各管標記好的樣品，真空冷凍干燥。 4、差異表達蛋白質譜分析、篩選及鑒定不同標記的itraq標記蛋白樣品混合，經(jīng)第一維強陽離子柱(scx)分離，共收取14個梯度進行第二維分析；第二維反相色譜-質譜聯(lián)用(rplc-ms)，色譜分離70分鐘后行質譜鑒定，ms掃描范圍m/z4

39、00-1800，ms/ms掃描范圍m/z100-2000。經(jīng)生物信息學處理，篩選出統(tǒng)計學上差異明顯的蛋白質峰進行搜庫、鑒定。 三、人pbc血清差異表達蛋白篩選、鑒定及驗證 1、血清樣品制備正常人群對照、pbc、hbv肝纖維化和hbv肝硬化患者各20例，清晨空腹取血，4靜置1小時，41400g離心5分鐘，取上清，分裝后立即置于-80保存?zhèn)溆茫粚⒚拷M血清各自混合成1管，41400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白。 2、樣品蛋白質定量參見動物模型樣品蛋白質定量。 3、蛋白質的消化和標記參見動物模型的蛋白質消化及標記。 4、差異表達蛋白質譜分析、篩選及鑒定參見動物模型質譜分析方法。 5、利用weste

40、rn免疫印跡技術驗證淋巴管內皮透明質酸受體1(lyve-1)和鋅-2糖蛋白(azgp1)在pbc患者與正常人群血清中的表達差異；利用elisa法驗證視黃醇結合蛋白4(rbp4)在pbc患者與正常人群血清中的表達差異。 結論: 1、poly i：c腹腔注射c57bl/6小鼠能夠成功構建與人pbc在組織病理和血清學表現(xiàn)類似的pbc動物模型。 2、itraq結合lc-ms/ms技術能夠快速、有效地進行差異蛋白質組學研究，同時，我們利用western免疫印跡技術和elisa方法對部分鑒定蛋白進行驗證的結果也證明了itraq結合lc-ms/ms技術在蛋白定性及半定量的蛋白質組學研究方面的可靠性。 3、p

41、bc動物模型與對照組動物之間在血清及肝組織的蛋白質表達上均存在明顯差異，在蛋白質生物學功能上分別涉及脂質轉運和代謝、免疫應答、細胞粘附和運動、能量代謝等諸多方面；而且部分差異蛋白表達水平與pbc動物模型的進程呈現(xiàn)出明顯的正相關或負相關性，這對于后續(xù)對該pbc模型的發(fā)生機制進行進一步的功能蛋白質組學研究打下了基礎。 4、pbc患者、hbv肝纖維化患者、hbv肝硬化患者及正常人群其相互之間在血清蛋白質表達上均存在顯著差異，在蛋白質生物學功能上分別涉及脂質轉運及代謝、載體類、細胞粘附及運動、免疫應答、凝血相關、蛋白水解酶類等諸多方面；特別是相對于正常人群、hbv肝纖維化及hbv肝硬化患者，我們發(fā)現(xiàn)f

42、n1、gc、lyve1、a2m、agt、albg、apoc-、apoc-和ighm等9個蛋白質在pbc患者血清中與上述三組均存在顯著的表達差異，這些蛋白質可能與pbc的發(fā)病機制密切相關，有待于進一步研究。 5、通過對pbc患者血清差異蛋白質組學與：pbc動物模型血清和肝組織差異蛋白質組學的比較研究，我們發(fā)現(xiàn)，諸如apoc等載脂蛋白家族蛋白在pbc患者及pbc動物模型中均呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，提示脂質代謝紊亂與人：pbc和pbc動物模型的進展關系密切。 6、本研究通過比較生理和不同病理條件下血清蛋白質組在表達水平上的改變情況，從而發(fā)現(xiàn)和鑒定出pbc疾病相關的蛋白質，為在整體水平發(fā)掘和尋求潛在藥物靶標以

43、及早期診斷、治療的分子標志物提供了可能，同時也為pbc的病理機制研究提出了一個新的研究思路和方法。 7、目前有關差異表達蛋白的驗證及功能研究還在進一步進行中。研究背景及目的: 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，pbc)是一種主要以肝內中小膽管的非化膿性進行性炎性損傷為特征的自身免疫性疾病。pbc起病隱匿，進展緩慢，最終可導致肝硬化等終末期肝病，其確切的發(fā)病機制至今尚不清楚。目前，pbc的診斷主要依據(jù)臨床生化及抗線粒體抗體(ama)的檢測，但是臨床上仍有部分ama陰性的pbc患者容易漏診。熊去氧膽酸(udca)是其主要治療藥物，但是其對某些pbc的遠期治療效

44、果并不理想。 因而如何早期診斷pbc，如何進行有效的干預處理是pbc研究的一個方向。由于人體諸多生命功能最終是通過蛋白質來完成的，在疾病的發(fā)生過程中，人體內蛋白質的種類和含量也會發(fā)生相應的改變，這就為我們對pbc的研究提供了一個思路。而蛋白質組學(proteomics)正是以蛋白質組為研究對象，分析細胞內、外動態(tài)變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質分子之間的相互作用與聯(lián)系。迄今國內外有關蛋白質組學技術研究pbc的相關報道較少。我們從蛋白質組學的角度出發(fā)，利用同位素標記相對和絕對定量(itraq)聯(lián)合液帽色譜-質譜(lc-ms/ms)技術通過比較pbc、hbv肝纖維化、hbv肝硬化患

45、者和正常對照人群的血清蛋白質，篩選、鑒定pbc患者血清差異表達蛋白，并進行驗證，旨在對pbc發(fā)病機制和診治研究提供某些理論依據(jù)。 與此同時，疾病的動物模型也是研究疾病的一個重要方法。目前pbc動物模型大致分為三類：抗原免疫、化學物質誘導和基因缺陷。但是這些動物模型在肝臟病理變化和/或血清學生化以及自身抗體的表達等方面與人類：pbc總是存在一定差異。國外有文獻報道部分肝炎患者在利用ifn-治療的過程中會繼發(fā)pbc，而我們在臨床工作中也有類似發(fā)現(xiàn)，這給了我們一個建立pbc動物模型的啟示-通過poly i：c腹腔注射，誘導小鼠體內ifn-水平升高，進而建立pbc動物模型。同時，利用itraq和lc-

46、ms/ms技術對不同階段pbc動物模型及其對照組血清及肝臟組織中的蛋白質進行比較，篩選、鑒定pbc動物模型血清及肝組織差異表達蛋白，并進行驗證，以期通過pbc動物模型的研究對人pbc可能的發(fā)病機制和診斷有所啟示。 方法: 一、pbc動物模型建立 1、6-8周齡c57bl/6雌性小鼠80只，體重約20g，隨機分為pbs對照組和poly i：c模型組，spf級飼養(yǎng)。pbs液稀釋poly i：c至1mg/ml。模型組給予poly i：c5mg/kg腹腔內注射2次/周，對照組給予pbs5mg/kg腹腔內注射2次/周；每組分別與第4周、8周、12周和16周各處死10只。 2、血清樣品制備眼球摘除取血，4

47、1400g離心5分鐘，取血清，部分血清行生化及自身抗體檢測，部分血清立即置于-80保存?zhèn)溆谩?3、肝臟組織樣品制備斷頸處死后，取肝臟于冰生理鹽水中清洗，部分肝臟置入4福爾馬林液固定，石蠟包埋，行he染色和ck19免疫組化染色，光鏡下觀察肝臟病理變化及肝內膽管變化；部分肝臟立即置于-80保存?zhèn)溆谩?二、pbc動物模型血清及肝臟組織差異表達蛋白篩選、鑒定 1、血清及肝臟組織樣品制備將每組血清各自混合，41400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白；肝臟組織于pbs中剪碎洗去血液；液氮研磨混合；按照裂解液體積：組織重量(v：w)=5：1的關系加入裂解液(7m尿素，2m硫脲，0.1pmsf，0.5dtt)

48、，混懸，冰上裂解半小時。 2、樣品蛋白質定量通過bradford法測定各組樣品中的總蛋白含量。 3、蛋白質的消化和標記加入還原試劑，60反應1小時；加入半胱氨酸封閉試劑，室溫處理10分鐘；每管各加入預冷的丙酮(丙酮：樣品體積比=5：1)，-20沉淀1小時后，12000 rpm，4，離心20分鐘，取沉淀；加入溶解液20l，混懸，充分溶解樣品；按照酶：蛋白質=1：20的比例加入胰蛋白酶，37酶解過夜；itraqtm reagent114，115，116，117分別標記正常對照、4周、12周和16周模型組，共4管，各管標記試劑中加入70l乙醇，混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應一小時，之后各加入三倍

49、體積水，使標記試劑分解；合并各管標記好的樣品，真空冷凍干燥。 4、差異表達蛋白質譜分析、篩選及鑒定不同標記的itraq標記蛋白樣品混合，經(jīng)第一維強陽離子柱(scx)分離，共收取14個梯度進行第二維分析；第二維反相色譜-質譜聯(lián)用(rplc-ms)，色譜分離70分鐘后行質譜鑒定，ms掃描范圍m/z400-1800，ms/ms掃描范圍m/z100-2000。經(jīng)生物信息學處理，篩選出統(tǒng)計學上差異明顯的蛋白質峰進行搜庫、鑒定。 三、人pbc血清差異表達蛋白篩選、鑒定及驗證 1、血清樣品制備正常人群對照、pbc、hbv肝纖維化和hbv肝硬化患者各20例，清晨空腹取血，4靜置1小時，41400g離心5分鐘，

50、取上清，分裝后立即置于-80保存?zhèn)溆?；將每組血清各自混合成1管，41400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白。 2、樣品蛋白質定量參見動物模型樣品蛋白質定量。 3、蛋白質的消化和標記參見動物模型的蛋白質消化及標記。 4、差異表達蛋白質譜分析、篩選及鑒定參見動物模型質譜分析方法。 5、利用western免疫印跡技術驗證淋巴管內皮透明質酸受體1(lyve-1)和鋅-2糖蛋白(azgp1)在pbc患者與正常人群血清中的表達差異；利用elisa法驗證視黃醇結合蛋白4(rbp4)在pbc患者與正常人群血清中的表達差異。 結論: 1、poly i：c腹腔注射c57bl/6小鼠能夠成功構建與人pbc在組織病理

51、和血清學表現(xiàn)類似的pbc動物模型。 2、itraq結合lc-ms/ms技術能夠快速、有效地進行差異蛋白質組學研究，同時，我們利用western免疫印跡技術和elisa方法對部分鑒定蛋白進行驗證的結果也證明了itraq結合lc-ms/ms技術在蛋白定性及半定量的蛋白質組學研究方面的可靠性。 3、pbc動物模型與對照組動物之間在血清及肝組織的蛋白質表達上均存在明顯差異，在蛋白質生物學功能上分別涉及脂質轉運和代謝、免疫應答、細胞粘附和運動、能量代謝等諸多方面；而且部分差異蛋白表達水平與pbc動物模型的進程呈現(xiàn)出明顯的正相關或負相關性，這對于后續(xù)對該pbc模型的發(fā)生機制進行進一步的功能蛋白質組學研究打

52、下了基礎。 4、pbc患者、hbv肝纖維化患者、hbv肝硬化患者及正常人群其相互之間在血清蛋白質表達上均存在顯著差異，在蛋白質生物學功能上分別涉及脂質轉運及代謝、載體類、細胞粘附及運動、免疫應答、凝血相關、蛋白水解酶類等諸多方面；特別是相對于正常人群、hbv肝纖維化及hbv肝硬化患者，我們發(fā)現(xiàn)fn1、gc、lyve1、a2m、agt、albg、apoc-、apoc-和ighm等9個蛋白質在pbc患者血清中與上述三組均存在顯著的表達差異，這些蛋白質可能與pbc的發(fā)病機制密切相關，有待于進一步研究。 5、通過對pbc患者血清差異蛋白質組學與：pbc動物模型血清和肝組織差異蛋白質組學的比較研究，我們

53、發(fā)現(xiàn)，諸如apoc等載脂蛋白家族蛋白在pbc患者及pbc動物模型中均呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，提示脂質代謝紊亂與人：pbc和pbc動物模型的進展關系密切。 6、本研究通過比較生理和不同病理條件下血清蛋白質組在表達水平上的改變情況，從而發(fā)現(xiàn)和鑒定出pbc疾病相關的蛋白質，為在整體水平發(fā)掘和尋求潛在藥物靶標以及早期診斷、治療的分子標志物提供了可能，同時也為pbc的病理機制研究提出了一個新的研究思路和方法。 7、目前有關差異表達蛋白的驗證及功能研究還在進一步進行中。研究背景及目的: 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，pbc)是一種主要以肝內中小膽管的非化膿性進行性炎性損傷

54、為特征的自身免疫性疾病。pbc起病隱匿，進展緩慢，最終可導致肝硬化等終末期肝病，其確切的發(fā)病機制至今尚不清楚。目前，pbc的診斷主要依據(jù)臨床生化及抗線粒體抗體(ama)的檢測，但是臨床上仍有部分ama陰性的pbc患者容易漏診。熊去氧膽酸(udca)是其主要治療藥物，但是其對某些pbc的遠期治療效果并不理想。 因而如何早期診斷pbc，如何進行有效的干預處理是pbc研究的一個方向。由于人體諸多生命功能最終是通過蛋白質來完成的，在疾病的發(fā)生過程中，人體內蛋白質的種類和含量也會發(fā)生相應的改變，這就為我們對pbc的研究提供了一個思路。而蛋白質組學(proteomics)正是以蛋白質組為研究對象，分析細胞

55、內、外動態(tài)變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質分子之間的相互作用與聯(lián)系。迄今國內外有關蛋白質組學技術研究pbc的相關報道較少。我們從蛋白質組學的角度出發(fā)，利用同位素標記相對和絕對定量(itraq)聯(lián)合液帽色譜-質譜(lc-ms/ms)技術通過比較pbc、hbv肝纖維化、hbv肝硬化患者和正常對照人群的血清蛋白質，篩選、鑒定pbc患者血清差異表達蛋白，并進行驗證，旨在對pbc發(fā)病機制和診治研究提供某些理論依據(jù)。 與此同時，疾病的動物模型也是研究疾病的一個重要方法。目前pbc動物模型大致分為三類：抗原免疫、化學物質誘導和基因缺陷。但是這些動物模型在肝臟病理變化和/或血清學生化以及自身抗

56、體的表達等方面與人類：pbc總是存在一定差異。國外有文獻報道部分肝炎患者在利用ifn-治療的過程中會繼發(fā)pbc，而我們在臨床工作中也有類似發(fā)現(xiàn)，這給了我們一個建立pbc動物模型的啟示-通過poly i：c腹腔注射，誘導小鼠體內ifn-水平升高，進而建立pbc動物模型。同時，利用itraq和lc-ms/ms技術對不同階段pbc動物模型及其對照組血清及肝臟組織中的蛋白質進行比較，篩選、鑒定pbc動物模型血清及肝組織差異表達蛋白，并進行驗證，以期通過pbc動物模型的研究對人pbc可能的發(fā)病機制和診斷有所啟示。 方法: 一、pbc動物模型建立 1、6-8周齡c57bl/6雌性小鼠80只，體重約20g，

57、隨機分為pbs對照組和poly i：c模型組，spf級飼養(yǎng)。pbs液稀釋poly i：c至1mg/ml。模型組給予poly i：c5mg/kg腹腔內注射2次/周，對照組給予pbs5mg/kg腹腔內注射2次/周；每組分別與第4周、8周、12周和16周各處死10只。 2、血清樣品制備眼球摘除取血，41400g離心5分鐘，取血清，部分血清行生化及自身抗體檢測，部分血清立即置于-80保存?zhèn)溆谩?3、肝臟組織樣品制備斷頸處死后，取肝臟于冰生理鹽水中清洗，部分肝臟置入4福爾馬林液固定，石蠟包埋，行he染色和ck19免疫組化染色，光鏡下觀察肝臟病理變化及肝內膽管變化；部分肝臟立即置于-80保存?zhèn)溆谩?二、p

58、bc動物模型血清及肝臟組織差異表達蛋白篩選、鑒定 1、血清及肝臟組織樣品制備將每組血清各自混合，41400g離心5分鐘，過柱去除高豐度蛋白；肝臟組織于pbs中剪碎洗去血液；液氮研磨混合；按照裂解液體積：組織重量(v：w)=5：1的關系加入裂解液(7m尿素，2m硫脲，0.1pmsf，0.5dtt)，混懸，冰上裂解半小時。 2、樣品蛋白質定量通過bradford法測定各組樣品中的總蛋白含量。 3、蛋白質的消化和標記加入還原試劑，60反應1小時；加入半胱氨酸封閉試劑，室溫處理10分鐘；每管各加入預冷的丙酮(丙酮：樣品體積比=5：1)，-20沉淀1小時后，12000 rpm，4，離心20分鐘，取沉淀；加入溶解液20l，混懸，充分溶解樣品；按照酶：蛋白質=1：20的比例加入胰蛋白酶，37酶解過夜；itraqtm reagent114，115，116，117分別標記正常對照、4周、12周和16周模型組，共4管，各管標記試劑中加入70l乙醇，混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應一小時，之后各加入三倍體積水，使標記試劑分