流式細(xì)胞儀BDFACSCantoII

1、流式細(xì)胞儀背景知識(shí) 總覽 l 流式細(xì)胞術(shù)基本知識(shí) l 流式細(xì)胞儀的組成 l 數(shù)據(jù)采集與分析 流式細(xì)胞技術(shù)是什么？ l流式細(xì)胞術(shù) 在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞或顆粒的各項(xiàng)特性 特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析 可檢測(cè)的樣本種類多樣：外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫 液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞，微生物 Flow Cytometry Flow:Fluid Cyto:Cell Metry:Measurement 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣本 0.4um40um 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)指標(biāo) l流式細(xì)胞術(shù)提供的信息： - 相對(duì)細(xì)胞大小 - 相對(duì)細(xì)胞顆粒密度和內(nèi)部復(fù)雜度 - 染色過細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度 細(xì)胞結(jié)構(gòu) =細(xì)胞大小

2、=細(xì)胞粒度 =DNA含量與細(xì)胞周期 =RNA含量 =蛋白質(zhì)含量 =染色體分析 細(xì)胞功能 =細(xì)胞表面/胞漿/核的特 異性抗原 =細(xì)胞活性 =細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子 =酶活性 =激素結(jié)合位點(diǎn) =細(xì)胞受體 =細(xì)胞凋亡 在上述信號(hào)基礎(chǔ)上的細(xì)胞分選 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用 流式細(xì)胞儀組成 l液流系統(tǒng)：形成層流系統(tǒng)，聚焦細(xì)胞 l光學(xué)系統(tǒng)：產(chǎn)生和收集光學(xué)信號(hào) l電子系統(tǒng)：光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，進(jìn)行信號(hào)處理 Fluidics Diagram Sheath FlowSample Flow 液流系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng) l激發(fā)光學(xué)系統(tǒng)包括: - 激光器 - 透鏡和反射鏡，將激光引導(dǎo)到檢測(cè)區(qū)域 l收集光學(xué)系統(tǒng)包括: -濾光片，將產(chǎn)生的光信號(hào)

3、引導(dǎo)到對(duì)應(yīng)的光學(xué)接收器 光學(xué)系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)- -濾光片 460 500 540460 500 540460 500 540 LongpassShortpassBandpass 電子系統(tǒng) Time Voltage Time Voltage Time Voltage 電子系統(tǒng) 電子系統(tǒng) Review l懸浮狀態(tài)的細(xì)胞 l單個(gè)流過流動(dòng)室 l細(xì)胞被激發(fā) l產(chǎn)生散射光和熒光 信號(hào) l信號(hào)被采集 l轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào) l存儲(chǔ)于電腦上 回顧 流式細(xì)胞儀的三大組成部分？ 濾光片LP600代表什么意思？BP400/40呢？ 數(shù)據(jù)采集 l三種數(shù)據(jù)： - 前向散射光FSC - 側(cè)向散射光SSC - 各種熒光散射光FL1

4、，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3，F(xiàn)L4 l當(dāng)使用激光光源時(shí)，在前向方向（和激光行進(jìn)的方向相同）上可 用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光 l前向散射光的強(qiáng)度是和細(xì)胞或其他檢測(cè)顆粒的大小、形狀密切相 關(guān)的 數(shù)據(jù)采集-前向散射光 l當(dāng)激光光源被使用時(shí)，側(cè)向也有一定量的散射光產(chǎn)生， 可以用9090o o 角的側(cè)向散射光檢測(cè)通道來采集 l側(cè)向散射光的強(qiáng)度和細(xì)胞或其他檢測(cè)顆粒的顆粒密度、內(nèi)部復(fù)雜程度密 切相關(guān) 數(shù)據(jù)采集-側(cè)向散射光 外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn) 圖 顆粒雜質(zhì)、氣泡 對(duì)檢測(cè)的影響 l細(xì)胞標(biāo)記上熒光物質(zhì)后，這種熒光物質(zhì)要求特定波長(zhǎng) 的激發(fā)光來激發(fā)，同時(shí)發(fā)出特定波長(zhǎng)的光 l熒光物質(zhì)被激發(fā)以后產(chǎn)生的發(fā)射光將

5、由特定的熒光通 道來接收 l特定檢測(cè)是通過光學(xué)濾片和透鏡來控制的 數(shù)據(jù)采集-熒光信號(hào) l熒光強(qiáng)度是和細(xì)胞上標(biāo)記上的熒光染料的量正相關(guān) 數(shù)據(jù)采集 電壓 l 信號(hào)放大方式：log、lin l 信號(hào)類型：A,W,H l 電壓的調(diào)節(jié):根據(jù)陰性對(duì)照管來調(diào)節(jié) 閾值 l可以以任意參數(shù)及多個(gè)參數(shù)的組合作為閾值 l大多數(shù)樣本都可以設(shè)定FSC/SSC l閾值以下的信號(hào)不存儲(chǔ) l根據(jù)陰性對(duì)照管來調(diào)節(jié) l目的是將不需要的雜質(zhì)信號(hào)，噪音信號(hào)，無用的細(xì)胞 信號(hào)等扣除，使收集到的都是有用信號(hào) 補(bǔ)償 l 補(bǔ)償方式：任意兩個(gè)通道之間，可以采用手動(dòng)或自動(dòng) 補(bǔ)償。 l 補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié):根據(jù)單染對(duì)照管來調(diào)節(jié) 1.) Compensati

6、on - Too Little; Too Much 0.11101001000 0.1 1 10 100 1000 A B C D E A B C D E 21.3 22.0 20.2 20.5 21.4 FL2 - %FL1Fraction FL2 FL1 (FITC) Fraction% Compensation is independent of fluorescence intensity 2.) Basic Principles of Compensation - % Compensation is independent of fluorescence intensity 3.) Compensation- Too Dim, Too Bright Compensation Controls Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C). 數(shù)據(jù)分析 l 流式數(shù)據(jù) 直方圖 散點(diǎn)圖 等高線圖 密度圖 三維圖 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù) 直方圖 l 直方圖(Distribution Histogram) 橫坐標(biāo)代表熒光信號(hào)或散射光信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度，單位是 對(duì)數(shù)，可以是線性或?qū)?shù)坐標(biāo)。 縱坐標(biāo)