(完整版)質(zhì)粒擴(kuò)增、提取、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染

1、質(zhì)粒擴(kuò)增、提取、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染等操作程序 60質(zhì)粒擴(kuò)增、提取、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染等操作程序一、感受態(tài)細(xì)菌制備（ CaCl2 法）1. 從LB平板上挑取新活化的大腸桿菌單菌落，接種于5ml不加Amp勺LB培養(yǎng)基中，37C振蕩培養(yǎng)過夜（200r/min，至0D=1.5左右）。2. 取0.5ml上述振蕩過夜的菌液，轉(zhuǎn)入含 50ml的LB的三角燒瓶（1% 中，37 C條件下振蕩培養(yǎng) 22.5小時(shí)左右（200r/min ）,使 0D600達(dá)到 0.20.4 左右（100 口 l 測 600nm時(shí) OD值）。3. 將培養(yǎng)液50ml分裝到4個(gè)10ml的離心管中，每管 10ml，冰上放置10min，4. 4C條件下，40

2、00r/min離心10分鐘，棄上清。將離心管倒扣在吸水紙 上，盡量倒盡管中的培養(yǎng)基。5. 每管加入預(yù)冷的0.1mol/l CaCI2溶液2ml，用槍輕輕吹打，重懸沉淀。 轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中，共 8ml。6. 冰上放置10min后，4C條件下，4000r/min離心10min。7. 沉淀用預(yù)冷的1.6ml含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液懸浮。分 裝成200卩l(xiāng)的小份，共8管（40ml變?yōu)?.6ml濃縮25倍），-70 C保存?zhèn)?用。二、溶液的配置1. LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨（typtone ）、0.5%酵母提取物（yeast extract ）、 1%NaC即10g蛋白胨，5g酵

3、母提取物，10g氯化鈉溶解在950ml水中， 用1mol/LNaOH調(diào)PH至7.0，在補(bǔ)足水至1L。高壓滅菌20分鐘備用。2. 0.1mol/l 的 CaCl2 溶液：1.1g/100ml，稱取 1.1g CaCl2，加入雙蒸水 定容至100ml，濾膜過濾或高壓滅菌，分裝成 10ml/小份，4C保存。另取8.5ml+1.5ml已滅菌甘油，甘油含量為15%甘油，分裝成1ml/小份（10 份）4C保存。3. 配置液體培養(yǎng)基時(shí)，高壓滅菌 20min 備用；4. 配置固體培養(yǎng)基時(shí)+ （1.5g/100ml ）瓊脂糖，然后高壓滅菌 20min。取 出后，稍冷卻，一個(gè)60mm勺培養(yǎng)皿中加入約20ml培養(yǎng)基

4、，無菌條件下鋪 板。5. 選擇性培養(yǎng)基：培養(yǎng)基 +（1.5g/100ml ）瓊脂糖，然后高壓滅菌 20min， 取出后放于60OC水浴，保持60oc溫度加入100mg/ml的氨芐青霉素（Amp 即100ml LB加入100 口 l Amp（Amp終濃度達(dá)到50 口 g/ml ），搖勻后鋪板（20ml/板）上蓋稍打幵，37度烘箱/室溫下放置干燥1-2天，封口膜包裹 后貯4 C保存?zhèn)溆?。三、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化注意：取兩管感受態(tài)細(xì)胞：為空白對照，不加質(zhì)粒：加入質(zhì)粒；每管加入量：體積10卩l(xiāng)，DNA50ng質(zhì)粒稀釋成0.02卩g/卩l(xiāng) ;200卩l(xiāng)感受態(tài)細(xì)胞中加入 2卩l(xiāng)濃度為0.02卩g/卩l(xiāng)質(zhì)粒。具體步驟：

5、1. 取兩管感受態(tài)細(xì)胞冰上放置解凍， 同時(shí)質(zhì)粒冰上解凍， 開啟水浴鍋 42oc 管空白對照，不加質(zhì)粒；管加入2卩l(xiāng) 0.02卩g/卩l(xiāng)的質(zhì)粒，混勻，冰上放置 30min2. 42 C水浴90s，不搖3. 取出，置冰上 2min，加入LB 300 口 l，37C，200r/min 振蕩培養(yǎng)1小 時(shí)，復(fù)蘇細(xì)胞。同時(shí)將選擇性培養(yǎng)基置于室溫 1 小時(shí)。4. 取上述轉(zhuǎn)化菌液150卩l(xiāng)涂布在相應(yīng)的培養(yǎng)板上：不含Amp的培養(yǎng)板一一不含質(zhì)粒菌液含Amp的培養(yǎng)板一a：不加質(zhì)粒菌液；b:加質(zhì)粒菌液正面培養(yǎng) 1h 后，倒置培養(yǎng)過夜。5. 觀察菌落生長情況，取含 Amp培養(yǎng)板上加入含質(zhì)粒菌液后生長的菌落， 加入到5m

6、l LB液體培養(yǎng)基中（加入 Amp 5ul ），37 C培養(yǎng)12h。6. 用含甘油30%的LB保存，-70 C備用（甘油消毒、高壓滅菌）。四、質(zhì)粒提取1. 已轉(zhuǎn)化好質(zhì)粒的細(xì)菌加入到含有抗生素的LB培養(yǎng)液總共大概150ml在37C恒溫箱中搖菌過夜。2. 將細(xì)菌分裝在 4個(gè) 50ml 的離心管中， 7000r/min ， 1 0分鐘離心，倒掉 上清。同時(shí)取10mlP1溶液加入10卩l(xiāng)的酶抑制劑，備用。3. 在每個(gè)離心管中加入 1mlP1:酶抑制劑（1:1）,吹打懸浮沉淀，然后 將所有菌液集合到同一個(gè)離心管中。4. 加入5ml的P2溶液，輕柔的顛倒20次。放置4分鐘。一旦加入P2,應(yīng)立刻蓋上蓋子，以

7、防酸化。Genomic DNA裂解物是粘性物，切勿將溶解時(shí)間超過 5 分鐘。5. 加入5ml的P3溶液，輕柔的顛倒20次。冰上孵育20分鐘。加入 P3 后，會產(chǎn)生蓬松的白色物質(zhì)， 沉淀物變得不粘， 沉淀物包括 genomic DNA,Protein, 細(xì)胞碎屑和 SDS6. 13000r/min,30 分鐘 離心， 將上清倒 至蓋有一層紗布的 吸附柱 （Qiagen-tip100 ）中，吸附柱下放置一個(gè)裝廢液的飯盒。吸附柱使用前應(yīng)用約4ml的QBT平衡，上清液應(yīng)快速加入柱中，如果上清放置時(shí)間長則 會變得混濁，系蛋白沉淀所致，須再次離心。7. 待滴完之后，加滿 QC液洗去殘液，滴完后再重復(fù)一次。

8、8. 用5mlQF液洗脫柱上的質(zhì)粒至10ml離心管中。9. 加入 3.5ml 異丙醇，顛倒混勻， 13000r/min ， 30 分鐘?？梢姵恋砦?， 小心棄去上清。10. 加入1ml70%勺乙醇，溶解沉淀后轉(zhuǎn)入1.5ml的appendorf管；再取1ml70%勺乙醇，清洗管壁，轉(zhuǎn)入 1.5ml的appendorf管。11. 14600r/min ，20分鐘，棄上清，待乙醇蒸發(fā)后加入100卩l(xiāng)TE，再將兩管集合（酌量，若質(zhì)粒量比較多，可加入 200卩l(xiāng) ）。12. 取2口 l質(zhì)粒液至加有98口 l雙蒸水的0.5mlappendorf管，在紫外一分光光度計(jì)上檢測質(zhì)粒濃度和純度。 （純度參照: 1.82.0 ）13. 剩余的質(zhì)粒標(biāo)記日期，質(zhì)粒種類，濃度放在-20 C冰箱保存，備用。五、細(xì)胞轉(zhuǎn)染1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)后按一定數(shù)量植入 24 孔板中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12 小時(shí)，備 用。2. 根據(jù)轉(zhuǎn)染的孔數(shù)及每孔加入的質(zhì)粒量算出所需的