人類免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp41的基因重組表達解析

1、人類免疫缺陷病毒I型包膜糖蛋白gp41的基因重組表達【摘要】目的 基因重組表達(HIV-1 gp41)抗原，并研制一種快速、簡便、靈敏性高、特異性強的國產(chǎn)HIV-1免疫檢測試劑。方法 選用HIV-1型BH10毒株的包膜糖蛋白gp41的部分基因(6977-7497),重組在PBV221表達 載體上。表達產(chǎn)物通過15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳初步分離純化，根據(jù)RF值，切下含特異蛋白的膠帶，以 Wester n blot法轉移在硝酸纖維素膜上；免疫 血清法檢測合格者制備的抗原檢測條帶，經(jīng)國家標準參比血清檢測。結果 獲得1株含HIV-1 gp41基因的重組質粒，其蛋白的特異性表達為8%經(jīng)HIV-1陽性

2、血清檢測和國家標準參比血清檢定，該表達蛋白靈敏性、特異性均為 100%結論(1)可以選用單一的gp41作為HIV-1感染初篩試劑的抗原。(2)表 達載體PBV221其表達的目的蛋白為非融合蛋白，作為試劑中的抗原，可降低檢 測中的非特異性。(3)該試劑是一種簡便、特異、靈敏性高的試劑?！局黝}詞】HIV-1 基因重組 gp41 免疫檢測試劑Expressi on of recomb inant HIV-1 en velope glycoprote in gp41TENGZhip ing, LI Degui, GAO Lia nshe ng, et al. I nstitute of Virolog

3、y, Chi nese Academy of Preve ntive Medici ne, Beiji ng 100050【Abstract 】 ObjectiveTo con struct and express HIV-1 env gp41gene for devel oing a simple and rapid test for HIV-1 in fecti on.Methods HIV-1 env gp41 gene of BH10 strain (nt6 977-7 497) was con structed into express ing vector pBV221 and e

4、xpressed in E. Coli HB101. The expressed protei ns were purified on 15% SDS-PAGE, the specific protein gel was cut dow n, tran sferred on to n itrocellulose membra ne and sta ined with pon ceau for 10 minu tes. The membra ne was detected with positive and n egative serum respectively. The membra ne

5、was blocked with block ing buffer and cut into 2 mm of each strip and fixed into the well of thin plastic plate.Results We obta ined astra nd plasmid express ing HIV-1 env gene and the prote in.Con clusi onThe results showed that:(1)HIV-1 env gp41 prote in can be used to detect HIV-1 an tibody in se

6、rum of in dividual; (2)The expressed protein is a nonfusion protein and has high specificity and sen sitivity to HIV-1.【Key words 】 HIV-1Gene recomb in ati ongp41 Immunedetect ion reage nt人類免疫缺陷病毒（HIV）在感染后的24周，血清中出現(xiàn)HIV特異性抗體 ：1應用免疫血清學方法，早期可檢出抗核心蛋白p24及其前體p55和gp41的抗體。隨后可發(fā)現(xiàn)抗包膜糖蛋白的 gp120/gp160 的抗體，但隨著病情的

7、進展 p24抗體會逐漸下降，甚至消失。根據(jù)HIV感染后的血清學變化，我們選擇了gp41為HIV-1的診斷試劑抗原，對其基因進行重組在PBV221溫控表達載體上，在大腸桿菌中表達。gp41位于HIV-1包膜糖蛋白的gp160的基因編碼區(qū)，第四開放讀碼框架之 內，共含350個氨基酸殘基，其前體為包膜糖蛋白的gp160,經(jīng)蛋白酶裂解成gp120和gp41,分別形成成熟病毒顆粒的表面棘突和跨膜部分。位于表面的部 分，可刺激機體產(chǎn)生相應的抗體，本研究選用的gp41內的抗原決定簇，位于BH10毒株基因7 345-7 423，編碼23個氨基酸殘基。PBH1（質粒含有BH10的全基因，經(jīng)Bgl U和Hind川

8、核酸內切酶消化，回收 的0.52 kb（6 977-7 497）基因片段重組在 PBV221表達載體上。PBV221表達載體全長為 3.66 kb ，含有很強的啟動和終止密碼及誘導表達基因，氨芐青霉素 為抗性選擇標記基因，通過 BamHI與目的基因上的Bgl U酶為同工酶）和 Hind川酶切位點插入了目的基因。1 材料和方法1.1 材料 含有 HIV-1 BH10 毒株全基因組質粒為本室提供。基因表達載體PBV221由本所基因工程室贈送。核酸內切酶購自華美生物技術公司。0.45卩m的硝酸纖維素膜購于BioRAD公司。SPA辣根過氧化物酶結合物為本室標記。底 物TME購自Gen emed Bio

9、tech nologies 公司。HIV抗體陰性對照血清來自正常 人血清，用蛋白印跡及ELISA法檢測，HIV-1+2抗體均為陰性。HIV-1抗體陽性 對照血清來自我國云南吸毒 HIV-1感染陽性者血清，經(jīng)ELISA和Western blot 法檢測抗體為陽性，56C30分鐘滅活，作為陽性對照。國家 HIV標準質控參比 血清，購于中國藥品生物制品檢定所。1.2 方法51.2.1 HIV-1 gp41抗原基因的重組 將PBH1（毒株基因組DNA用核酸內切酶 Bgl U消化酶切，0.8%低融點瓊脂糖凝膠回收1.43 kb DNA片段（6 977-8 407），經(jīng)BamHI酶解PBV221質粒載體，

10、S1核酸酶分別修平Bgl U粘性末端和 PBV221載體的BamH酶解的粘性末端，成為平頭。Hind川核酸內切酶酶解上述 修平的片段的載體片段，低融點瓊脂糖回收 0.52 kb 片段，回收的 0.52 kb 基 因片段經(jīng)T4連接酶連接，重組在PBV221的載體上。重組質粒轉化到致敏態(tài)的 HB101受體菌，LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。1.2.2 重組質粒的鑒定核苷酸順序分析挑選單菌落LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，小量質粒提取，經(jīng)Hind川酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。提取純化重組的陽性質粒， ABI 核酸自動測序分析儀進行序列分析。1.2.3 重組質粒 gp41 基因的表達 挑選經(jīng)測序分析重組正確的陽性單

11、菌落， 接種于5 ml加氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，30E震蕩過夜，次日晨轉到50 mlLB 培養(yǎng)液中，30E搖菌測0D值（約為0.6），調溫到42C誘導4小時，使蛋白表 達，4 000 r/min 離心20分鐘，收集細菌，沉淀加 TG緩沖液（10 mmol Tris- HCl，10%甘油）100 C煮10分鐘，樣品于15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，樣品一 式兩份，一份考馬斯亮藍染色表達分析蛋白產(chǎn)物，另一份分析抗原性。1.2.4 重組表達 gp41 蛋白抗原性的檢測 按 Western blot 法轉移到硝酸纖維 素膜上，麗春紅染色檢測轉移的蛋白，將載有抗原蛋白的硝酸纖維素膜4C封閉過夜（封閉液；

12、 0.01 mol/L PBS pH7.4 ， 0.2%Tween-20， 3%牛血清蛋白 ），以 不同稀釋度的 HIV-1 抗體陽性血清免疫血清法檢測表達蛋白的抗原性。加陽性 血清：37C, 30分鐘；PBS洗 10秒鐘X3次加HRF標記的二抗；37C, 30分 鐘，PBS洗 10秒鐘X3次加入底物液：2滴底物緩沖液加入1滴底物液（H2Q+TMB觀察結果。1.2.5 檢測試劑條的制備（1）抗原的制備：取經(jīng)檢定陽性的甘油保存菌種 1 支，接種到 5 ml 加氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，30C振蕩過夜。次日晨轉入50 mILB中,30 C振蕩約4 小時，測QD值在0.5，調溫到42C，繼續(xù)培養(yǎng)4小

13、時，誘導蛋白的表達。4 000 r/min離心20分鐘，收集細菌。將沉淀按1 : 16的原體積加入30卩l(xiāng)TG buffer（10 mmol/L Tris-HCl, pH7.6, 10%甘油）充分混勻，加 30 卩 l 蛋白樣品buffer（3% 蔗糖， 2%SD，S 5%巰基乙醇， 20 mmol/L Tris-HCl,pH8.0, 溴酚藍）混 勻，煮沸 10分鐘，備電泳用。（2）15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白：制備 SDS聚丙烯酰胺凝膠板30 cmx 20 cm，按每厘米1卩l(xiāng)加上述制備的樣品，15 mA電泳16小時。根據(jù)標 準蛋白分子量 marker 和 Rf 值及溴酚藍下緣長度

14、計算 gp41 的位置，上下各寬 1 cm,切下特異的膠帶。按 Western blot法轉移到硝酸纖維素膜上，麗春紅染色3分鐘，檢測轉移蛋白效果。置于封閉液中，4C過夜。膜封閉后，自然干燥， 切割成 3 cmx 10 cm 的條帶。雙面膠將抗原條固定在反應槽內，每槽 1 條。（3）抗原條特異性和敏感性的檢測：按國家 HIV-1 標準，參比血清試劑盒操 作說明，檢測制備的抗原條。2 結果2.1 Hind川內切酶酶切鑒定的重組質粒，經(jīng) 0.8%瓊脂糖凝膠電泳比較，獲得 了 4.1 kb 的重組質粒 （1 ， 2）。2.2 重組質粒經(jīng)373A型核苷酸序列測定儀測定（反向測序）核酸序列，分析 含有g

15、p41抗原決定簇的編碼23個氨基酸殘基的264-334核苷酸序列。GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT TGGAsp Gln Gln Leu Leu Gly Ile TrpGGT TGC TCT GGA AAC CTC ATT TGCGly Cys Ser Gly Lys Leu Ile CysACC ACT ACT GTG CCT TGG AACThr Ala Ala Val Pro Trp Asn1 重組質粒的鑒定 (0.8%瓊脂糖凝膠電泳 )1.DNA/Hind 川 Marker; 2.PBV221; 3.重組質粒(pBV221+0.52 kb); 4. 重組質粒經(jīng)Hi

16、nd川酶切Fig.1 Confirmation of the recombinant plasmid(0.8% agarose gel electrophoresis)1:DNA/Hi nd 川 Marker. 2:Plasmid pBV221.3:Recombi nant plasmid(pBV221+0.52 kb). 4:recombinant plasmid digested by Hind2 HIV-1 gp41 pPBV221 重組質粒的構建Fig.2 Construction of plasmid of HIV-1 gp41 gene and pBV221 vector2.3 H

17、B101受體菌內，溫控誘導表達的蛋白經(jīng) 15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳純 化分離(4) ?？捡R斯亮藍染色，可見 19 300 的蛋白，經(jīng)分光光密度掃描儀測定 顯示特異性的表達量為 8.6%。2.4 重組表達gp41蛋白抗原性的檢測結果 分別以陽性血清和1 : 200、 1 : 20不同稀釋度的陽性血清和1 : 1 000的免疫酶，應用免疫血清法檢測，3， 3-二氨基聯(lián)苯胺顯色可見棕色的陽性條帶，陰性對照則無其他的條帶 (5) ， 應用國家標準參比血清檢測結果 (6) 可見 8 個陽性， 8個陰性，與標準結果一 致。3 討論HIV感染人體后，出現(xiàn)p24、gp41、gp120等抗體，gp41抗體能

18、持續(xù)穩(wěn)定存 在，p24隨疾病的發(fā)生而下降。因此，HIV-1感染的檢測主要是HIV-gp41抗體 的檢測。隨著計算機在生物技術中的應用，對于抗原蛋白表面活性親疏水性等 理化性質及生物學功能作出綜合分析判斷，由此對抗原決定簇的定位作出理論 預測。因此，本文只選用 gp41 的單一抗原決定簇基因片段進行重組表達，既可 獲得穩(wěn)定的反應結構域，又保留了原有的生物學活性。重組的目的基因與載體 之間有適宜的閱讀框架和穩(wěn)定的結構，因此， 42 E溫降。因此，HIV-1感染的 檢測主要是 HIV-gp41 抗體的檢測。隨著計算機在生物技術中的應用，對于抗原 蛋白表面活性親疏水性等理化性質及生物學功能作出綜合分析

19、判斷，由此對抗 原決定簇的定位作出理論預測。因此，本文只選用 gp41 的單一抗原決定簇基因 片段進行重組表達，既可獲得穩(wěn)定的反應結構域，又保留了原有的生物學活 性。重組的目的基因與載體之間有適宜的閱讀框架和穩(wěn)定的結構，因此，42C溫3經(jīng)373A型儀器測定重組質粒核苷酸序列Fig.3 Nucleotide sequence of recombinant plasmid415% SDS-PAG凝膠電泳分析重組表達蛋白1:蛋白分量標記；2, 3:宿主菌；5, 6:重組表達樣品；4, 7: pBV221載體對照Fig.4 15%SDS-PAGE analysis of expressed recom

20、binant protein1:Protein molecular weight marker. 2,3:Host bacteria. 5,6:Expressedprotein sample. 4,7:Vector pBV221 control5 重組表達蛋白抗原性測定 HIV-1 陽性血清1 : 20、1 : 200稀釋，1 : 1 000免疫酶血清學檢測（+為陽性結果，-為陰性對照）Fig.5 Antigenicity detection of expressed protein HIV-1 positiveserum dilution 1:20、1 : 200, 1 : 1 000 se

21、rum dilution forimmunoenzyme assay (+:Positive results. -:Negative control)6 國家標準參比血清檢測 HIV1、 2、 5、 7、 8、 10、 11、 12陽性； 3、 7、 9、 12、 20、 24、 27、 28陰性 Fig.6 HIV detection with national standard reference serum1， 2， 5， 7， 8， 10， 11， 12: Positive. 3 ， 7， 9， 12， 20， 24， 27， 28:Negative本課題受國家“八五” (編號： 85-916-03- 02) “九五”攻關項目資助 (編號： 96-906-03-16)作者單位： 100050 北京 中國預防醫(yī)學科學院病毒學研究所 (滕智平 曾 毅) ；科技服務公司 (李德貴 高連勝)參考文獻 1 Joller-Jemelka HI, Joller PW, Muller F, et al. Anti-HIV IgM antibody analysis during early manifestations of HIV infe