《羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程》編制說明

1、海南省地方標準羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程編制說明一、任務(wù)來源羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程的制定任務(wù)是根據(jù)海南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局“瓊質(zhì)技監(jiān)標【2013】71號”文件精神內(nèi)容，由海南省水產(chǎn)研究所負責羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程的編制工作。二、標準制定背景與意義羅非魚是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向全世界推廣養(yǎng)殖的優(yōu)良品種，海南省羅非魚產(chǎn)業(yè)經(jīng)多年的發(fā)展現(xiàn)已形成了集遺傳育種、種苗生產(chǎn)、成魚養(yǎng)殖、飼料、加工、運銷和配套服務(wù)為一體的完整的產(chǎn)業(yè)鏈。 2011年止全省共有羅非魚種苗場60多家，其中規(guī)模較大的14家，年產(chǎn)魚苗108億尾；獲得haccp認證的羅非魚加工廠34家，歐盟注冊的有22家，年加工能力80多萬噸；養(yǎng)殖面積約3萬

2、公頃，年實際產(chǎn)量約31萬噸，出口量10.3萬噸，位居全國第一，羅非魚養(yǎng)殖已成為我省出口創(chuàng)匯和漁民增收的重要途徑。我省羅非魚養(yǎng)殖模式以池塘養(yǎng)殖為主，但隨著羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，羅非魚主產(chǎn)區(qū)等地不斷爆發(fā)鏈球菌疾病，死亡率最高到達40%，羅非魚鏈球菌病已成為我省羅非魚養(yǎng)殖的重大危害之一。為準確檢測羅非魚鏈球菌病，規(guī)范羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)，科學的引導對羅非魚鏈球菌病的防治，杜絕盲目用藥，促進我省羅非魚產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，制定羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程具有極其重要的意義。海南省水產(chǎn)研究所科研人員多年來對羅非魚鏈球菌病防治做過較多研究，本標準編制組的成員是上述研究工作的主要技術(shù)力量，

3、積累了較完整的技術(shù)資料，為羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程的制定奠定了相當?shù)难芯抗ぷ骰A(chǔ)。三、制訂本標準的過程準備階段：標準制定小組在接到制標任務(wù)后，由項目負責人牽頭開展對相關(guān)文獻資料的查閱、實驗耗材和試劑的準備；并及時與參與單位進行交流，為項目的順利完成做好充分的準備工作；分工情況：本制標任務(wù)由海南省水產(chǎn)研究所負責，中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所協(xié)助完成。具體分工為海南省水產(chǎn)研究所負責標準方法的建立，包括臨床診斷、實驗室診斷，初步建立完整的羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程；中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所對所建立的診斷方法進行完善，并從實際應(yīng)用方面進行了驗證。標準草案編寫情況：本標準草案經(jīng)過準備、設(shè)計

4、、建立、優(yōu)化和驗證等幾個階段，結(jié)果證實標準中所制定的方法，內(nèi)容完整，可操作性和實用性強，能夠滿足羅非魚鏈球菌病檢測需求，而后根據(jù)gb/t 1.1-2009標準化工作導則 第一部份：標準的結(jié)構(gòu)和編寫和海南地方標準編寫的相關(guān)規(guī)定進行了標準草案的編寫工作，完全按照規(guī)范術(shù)語編寫，達到使用者簡單易懂、方法結(jié)果能夠溯源的目的。四、主要起草人及其承擔的任務(wù)： 王德強 標準編制組主持人。負責項目組織實施，制定方案，執(zhí)筆“羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程”，撰寫編制說明。 可小麗 標準編制組成員 參與“羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程”工作。 劉志剛 標準編制組成員 參與“羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程”工作。 佟延南 標準編

5、制組成員 參與“羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程”工作。李芳遠 標準編制組成員 參與“羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程”工作。盧邁新 標準編制組成員 參與“羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程”工作。高鳳英 標準編制組成員 參與“羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程”工作。朱華平 標準編制組成員 參與“羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)規(guī)程”工作。五、標準制定的原則和依據(jù)制定原則：1、本標準的編寫規(guī)則遵循gb/t1.1-2000標準化工作導則 第一部分：標準的結(jié)構(gòu)和編號規(guī)則及gb/t1.2-2002標準化工作導則 第二部分：標準中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的確定方法。2、標準必須實用，其所函蓋的內(nèi)容應(yīng)適合我省的實際情況，編寫內(nèi)容上簡明、準確、通

6、俗、易懂，真正能指導生產(chǎn)。3、本標準在總結(jié)鏈球菌病檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，多次組織有關(guān)病害專家進行研討，進行綜合分析確定了本標準的技術(shù)數(shù)據(jù)。制定依據(jù)：本標準嚴格按照gb/t 1.12009標準化工作導則的技術(shù)要求進行編制起草。六、本標準主要內(nèi)容說明1、羅非魚鏈球菌?。?）病原體無乳鏈球菌（streptococcus agalactiae）、海豚鏈球菌（streptococcus iniae）。（2）流行情況在我國南方羅非魚養(yǎng)殖區(qū)，一年四季均有流行，尤其是510月高溫期，水溫30以上時為爆發(fā)高峰期，對各種規(guī)格羅非魚均可造成危害。2、設(shè)備、藥品選擇參照gb/t 4789.28 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 染色

7、法、培養(yǎng)基和試劑和sc/t 7201.1 魚類細菌病檢疫技術(shù)規(guī)程 第1部分：通用技術(shù)選擇設(shè)備和藥品。3、采集樣品依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的水生動物檢疫實驗技術(shù)規(guī)范，對患病的羅非魚進行樣品采集。4、臨床診斷對樣品的活動情況、體表、及其內(nèi)臟進行觀察、檢測。病魚一般活動緩慢，反應(yīng)遲鈍，食欲減退，獨游，嚴重時，常以螺旋狀游于水面。體表發(fā)黑，角膜發(fā)白渾濁、眼球腫大突出，虹膜充血，嚴重的可見眼球脫落；下頜、鰓蓋邊緣、鰭條基部不同程度的充血、出血，伴有肛門紅腫、外突的現(xiàn)象。解剖內(nèi)臟，肝臟充血、腫大，顏色不均，呈花肝狀，質(zhì)地脆弱；腦部組織軟化；膽囊充盈、充滿藍黑色的膽汁；部分患病魚體表現(xiàn)為腹水，腸道有輕度

8、的充血和炎癥，腸腔內(nèi)有少量黃色的粘液。5、實驗室診斷（1）、病原菌分離、培養(yǎng)采集病魚的眼、鰓絲、肝臟、脾臟、腎臟、血液和腦組織等器官的組織液接種于血瓊脂平板，在28 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h48 h。最后，挑去單菌落，接種于一新的血瓊脂平板上，在28 條件下倒置培養(yǎng)24 h。 （2）、生理生化檢驗 按照常規(guī)方法對分離的細菌進行運動性試驗、生長試驗、溶血試驗和馬尿酸鈉水解試驗。依照gb/t 4789.28 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 染色法、培養(yǎng)基和試劑的要求接觸酶試驗、淀粉水解試驗、吲哚試驗、v-p試驗和糖類分解試驗（3）、聚合酶鏈式反應(yīng)（pcr）監(jiān)測參照廣東與海南養(yǎng)殖羅非魚無乳鏈球菌的分離鑒定

9、與特性分析(1)（2010年，盧邁新等）和雙重pcr快速鑒別無乳鏈球菌和海豚鏈球菌（2010，黎炯等）等研究報告及實踐經(jīng)驗，對分離的樣品進行pcr檢測。4、細菌致病性實驗 首先，若培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落類型清楚，選擇其優(yōu)勢菌落進行培養(yǎng)；若不清楚，應(yīng)選擇不同類型分別培養(yǎng)。然后選擇與被檢樣品同齡、同規(guī)格，同時血清為陰性的健康羅非魚采用肌肉（或腹腔）注射（或涂抹、浸泡）方式對魚體進行人工感染，并觀察實驗魚24 h168 h的反應(yīng)。最后若出現(xiàn)于自然鏈球菌病發(fā)病癥狀相同的菌落，為致病菌落。5、 綜合判定依據(jù)的建立通過運用本標準所建立的針對羅非魚海豚鏈球菌和無乳鏈球菌的細菌分離鑒定方法，從臨床癥狀、病原分離培養(yǎng)

10、、菌體染色、生化實驗到分子生物學鑒定方法，可以實現(xiàn)對臨床羅非魚樣品相對系統(tǒng)和完整的病原分析和鑒定過程。根據(jù)海豚鏈球菌和無乳鏈球菌的病原特性，在標準中，還給出了羅非魚海豚鏈球菌病和無乳鏈球菌病的綜合判斷依據(jù)。七、與現(xiàn)行法律、法規(guī)、強制性標準的關(guān)系本標準的編制依據(jù)與現(xiàn)行的法律、法規(guī)和強制性標準的規(guī)定相一致。八、標準作為強制性標準或推薦性標準的建議本標準的制定旨在規(guī)范我省羅非魚鏈球菌病檢測技術(shù)，提高羅非魚鏈球菌病檢測速度和準確度。標準在實施過程中根據(jù)海南省級相關(guān)法規(guī)與強制性標準的繼續(xù)完善，相關(guān)指標、內(nèi)容可根據(jù)國內(nèi)外魚類細菌性疾病檢測技術(shù)研究的進展適時予以重新界定。九、貫徹標準的要求和措施建議本標準發(fā)

11、布后，應(yīng)廣泛組織宣傳和貫徹，建議在有關(guān)水產(chǎn)刊物上發(fā)布，同時在我省羅非魚養(yǎng)殖行業(yè)中執(zhí)行本標準，尤其進行羅非魚病害檢測的有關(guān)單位和個人，在病害檢測過程中，必須嚴格按本標準的規(guī)范進行。參考文獻譚晶晶,陳昌福,高宇等.奧尼羅非魚無乳鏈球菌的鑒定、致病性及藥物敏感性研究j.華中農(nóng)業(yè)大學學報.2010,29(6)745-751張俊,周素明,李安興.廣東省養(yǎng)殖羅非魚、海鱸、尖吻鱸海豚鏈球菌感染調(diào)查j.中國水產(chǎn)科學.2012,19(1)盧邁新,黎炯，葉星等.廣東與海南養(yǎng)殖羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定與特性分析(1)j.微生物學報.2010,37(5)鄧顯文,謝芝勛,謝志勤等.廣西羅非魚海豚鏈球菌的分離鑒定j.

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