生化實(shí)驗(yàn)課件：血清蛋白質(zhì)酣酸纖維薄膜電泳

1、血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳 Electrophoresis 電泳電泳帶電的質(zhì)點(diǎn)在電場中向電性相反方向移動(dòng)帶電的質(zhì)點(diǎn)在電場中向電性相反方向移動(dòng) 的現(xiàn)象。的現(xiàn)象。 電泳的基本原理：電泳的基本原理： 在電場中，推動(dòng)帶電質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)的力（在電場中，推動(dòng)帶電質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)的力（F）等于質(zhì)點(diǎn)所帶凈電）等于質(zhì)點(diǎn)所帶凈電 荷量（荷量（Q）與電場強(qiáng)度（）與電場強(qiáng)度（E）的乘積。）的乘積。FQE 質(zhì)點(diǎn)的前移同樣要受到阻力（質(zhì)點(diǎn)的前移同樣要受到阻力（F）的影響，對于一個(gè)球形質(zhì)）的影響，對于一個(gè)球形質(zhì) 點(diǎn)，服從點(diǎn)，服從 Stoke定律，即：定律，即：F6r r為質(zhì)點(diǎn)半徑，為質(zhì)點(diǎn)半徑， 為介質(zhì)粘度，為介

2、質(zhì)粘度，為質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)速度為質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)速度 當(dāng)質(zhì)點(diǎn)在電場中作穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)時(shí)：當(dāng)質(zhì)點(diǎn)在電場中作穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)時(shí)： FF即即 QE6r 可見，球形質(zhì)點(diǎn)的遷移率，首先取決于自身狀態(tài)，即與所帶可見，球形質(zhì)點(diǎn)的遷移率，首先取決于自身狀態(tài)，即與所帶 電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。 r QE v 6 F6r 影響電泳遷移率的因素影響電泳遷移率的因素 電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度 溶液的溶液的pH值值 溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度 電滲電滲 影響電泳遷移率的因素影響電泳遷移率的因素 電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度 電場強(qiáng)度是指單位長度（電場強(qiáng)度是指單位長度（cm）的電位降，也稱電勢梯度。）的電位降，也稱電

3、勢梯度。 電場強(qiáng)度大，帶電質(zhì)點(diǎn)的遷移率加速，但因產(chǎn)生大量熱量，對電泳有影響電場強(qiáng)度大，帶電質(zhì)點(diǎn)的遷移率加速，但因產(chǎn)生大量熱量，對電泳有影響 而不宜過大。而不宜過大。 溶液的溶液的pH值值 溶液的溶液的pH決定被分離物質(zhì)質(zhì)點(diǎn)的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷決定被分離物質(zhì)質(zhì)點(diǎn)的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷 量。溶液的量。溶液的pH離離pl越遠(yuǎn)，質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。因此在越遠(yuǎn)，質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。因此在 電泳時(shí)，應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)，選擇合適的電泳時(shí)，應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)，選擇合適的pH值緩沖液。值緩沖液。 溶液的離子強(qiáng)度溶液的離子強(qiáng)度 電泳液中的離子濃度增加時(shí)會(huì)引起質(zhì)點(diǎn)遷移率的降低，電泳液中的離

4、子濃度增加時(shí)會(huì)引起質(zhì)點(diǎn)遷移率的降低， 然而離子濃度過低，會(huì)降低緩沖液的總濃度及緩沖容量，不易維持溶液的然而離子濃度過低，會(huì)降低緩沖液的總濃度及緩沖容量，不易維持溶液的 pH值，影響質(zhì)點(diǎn)的帶電量，改變泳動(dòng)速度。值，影響質(zhì)點(diǎn)的帶電量，改變泳動(dòng)速度。 電滲電滲 在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動(dòng)稱為電滲在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動(dòng)稱為電滲 （electro-osmosis）。其產(chǎn)生的原因是固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x）。其產(chǎn)生的原因是固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x 的化學(xué)基團(tuán)，因此常吸附溶液中的正離子或負(fù)離子，使溶液相對帶負(fù)電或的化學(xué)基團(tuán)，因此常吸附溶液中的正離子或負(fù)離子，使溶液相對

5、帶負(fù)電或 正電向相反電極移動(dòng)，若與質(zhì)點(diǎn)在電場中移動(dòng)的方向相同，結(jié)果質(zhì)點(diǎn)的表正電向相反電極移動(dòng)，若與質(zhì)點(diǎn)在電場中移動(dòng)的方向相同，結(jié)果質(zhì)點(diǎn)的表 現(xiàn)速度比其固有速度要快，若與質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)的方向相反，其表現(xiàn)速度比其固現(xiàn)速度比其固有速度要快，若與質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)的方向相反，其表現(xiàn)速度比其固 有速度要慢，可見應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。有速度要慢，可見應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。 電泳的分類電泳的分類 電泳法可分為自由電泳（無支持體）電泳法可分為自由電泳（無支持體） 區(qū)帶電泳（有支持體）區(qū)帶電泳（有支持體） 濾紙電泳濾紙電泳 薄層電泳（薄膜及薄板）薄層電泳（薄膜及薄板） 凝膠電

6、泳（瓊脂、瓊脂糖、凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、 淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠） 電泳分析常用方法電泳分析常用方法 （一）醋酸纖維素薄膜電泳（一）醋酸纖維素薄膜電泳 （二）凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳）（二）凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳） SDS(Sodium dodecyl sulfate ) （十二烷基硫酸鈉）（十二烷基硫酸鈉） 聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法 （三）等電聚焦電泳技術(shù)（三）等電聚焦電泳技術(shù) 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為5左右，在左右，在pH為為8.6的的 緩沖液中帶負(fù)電，在電場中向正極移動(dòng)，由于不緩沖液中帶負(fù)電，在電場中向

7、正極移動(dòng)，由于不 同的蛋白質(zhì)的分子形狀、分子大小及帶電量的多同的蛋白質(zhì)的分子形狀、分子大小及帶電量的多 少不同，在電場中泳動(dòng)的速度不同而分離為不同少不同，在電場中泳動(dòng)的速度不同而分離為不同 的區(qū)帶，經(jīng)染色可見的區(qū)帶，經(jīng)染色可見5個(gè)區(qū)帶。染色后可洗脫進(jìn)行個(gè)區(qū)帶。染色后可洗脫進(jìn)行 比色定量。比色定量。 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 2cm 毛面毛面 _ + 1、點(diǎn)樣、點(diǎn)樣 2、電泳、電泳4550分鐘（分鐘（120V） 123 3、染色及漂洗、染色及漂洗 浸入染色液中浸入染色液中 3 5分鐘分鐘 _ + 清蛋白清蛋白 1 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果 5.定量測定定量測定 1.各試管分別加入各試管分別加入4毫毫 升升0

8、.4M NaOH 2.剪下各區(qū)帶放入試管剪下各區(qū)帶放入試管 3.置置370C水浴水浴5分鐘分鐘 4.600nm波長下比色以空波長下比色以空 白管調(diào)零白管調(diào)零 5.讀取各管吸光度讀取各管吸光度 6.計(jì)算各蛋白質(zhì)相對含量計(jì)算各蛋白質(zhì)相對含量 722S光電比色計(jì)使用光電比色計(jì)使用 1.調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)“波長按鈕波長按鈕”至所需波長。至所需波長。 2.將各管比色液裝入比色杯并置入比色槽（手持比色杯毛面），將各管比色液裝入比色杯并置入比色槽（手持比色杯毛面）， 用紙巾擦去比色槽外表面多余液體。用紙巾擦去比色槽外表面多余液體。 3.將空白管置入將空白管置入“光路光路”(拉桿到位拉桿到位)，“模式模式”選定選定“透

9、射透射 比比”，開蓋通過，開蓋通過“0%”按鈕調(diào)零至屏幕顯示零。按鈕調(diào)零至屏幕顯示零。 4.蓋上蓋，通過蓋上蓋，通過“100%”按鈕調(diào)按鈕調(diào)100%至屏幕顯示至屏幕顯示100。 5.將將“模式模式”選定為選定為“吸光度吸光度”，拉動(dòng)拉桿依次讀各管吸光度，拉動(dòng)拉桿依次讀各管吸光度， 并記錄。并記錄。 6.將各管液體倒回各試管，用蒸餾水漱洗比色杯后倒入其他待將各管液體倒回各試管，用蒸餾水漱洗比色杯后倒入其他待 測液體，仍以空白管調(diào)零，重復(fù)上述操作以讀取待測液各管的測液體，仍以空白管調(diào)零，重復(fù)上述操作以讀取待測液各管的 吸光度。吸光度。 7.計(jì)算各蛋白質(zhì)相對含量。計(jì)算各蛋白質(zhì)相對含量。 5.將將“模式模式”選定為選定為“吸光度吸光度”，拉動(dòng)拉桿依，拉動(dòng)拉桿依 次讀各管吸光度，并記錄。次讀各管吸光度，并記錄。 6.將各管液體倒回各試管，用蒸餾