專題5血紅蛋白提取分離

1、2003年年4月月14日宣布人類基因組序列圖完成日宣布人類基因組序列圖完成 這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組時(shí)代。這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組時(shí)代。 人類基因組：指人類基因組：指DNA分子所攜帶的全部分子所攜帶的全部 遺傳信息。遺傳信息。 蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的 總和。主要是對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究總和。主要是對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究 根據(jù)蛋白質(zhì)根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性各種特性的差異，如的差異，如分分 子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多 少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的 親和力親和力等等，可以用來分離不同種類

2、的等等，可以用來分離不同種類的 蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。 一、基礎(chǔ)知識(shí)一、基礎(chǔ)知識(shí) 大多數(shù)凝膠是由大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物多糖類化合物（如（如葡聚糖葡聚糖 或或瓊脂糖瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫 穿的通道。穿的通道。 根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量 的大小，利用具有的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，來進(jìn)行的凝膠，來進(jìn)行 分離。分離。 相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部相對(duì)分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部 的通道，路程較的通道，路程較長(zhǎng)長(zhǎng)，移動(dòng)速度較，移動(dòng)速度較慢慢; ; 相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部

3、相對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部 的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程較短短，移，移 動(dòng)速度較動(dòng)速度較快快。 相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。 進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，如何保證蛋白質(zhì)不進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，如何保證蛋白質(zhì)不 會(huì)發(fā)生變性呢？會(huì)發(fā)生變性呢？ 能夠抵制能夠抵制外界的酸和堿外界的酸和堿對(duì)溶液對(duì)溶液PHPH值值的影響，的影響， 維持維持PHPH基本不變。基本不變。 通常由通常由1 12 2 種緩沖劑種緩沖劑溶解于水溶解于水 中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不不

4、 同同PHPH范圍內(nèi)范圍內(nèi)使用的緩沖液。使用的緩沖液。 磷酸緩沖液磷酸緩沖液, , 成分：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉成分：磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉 如何證明凝膠色譜法獲得的蛋白質(zhì)是目的蛋白？如何證明凝膠色譜法獲得的蛋白質(zhì)是目的蛋白？ 帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過程。 許多重要的生物大分子，如多肽、許多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PHPH下，下， 這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。 在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其 所帶電荷相反的電極

5、移動(dòng)。所帶電荷相反的電極移動(dòng)。 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì) 的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使 帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品 中各種分子的分離中各種分子的分離。 瓊脂糖瓊脂糖凝膠電泳、凝膠電泳、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠電泳。 在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)常用十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉 （SDSSDS）聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,

6、NN,N- -亞甲基雙丙烯亞甲基雙丙烯 酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具酰胺在引發(fā)劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成的具 有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。 N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)）亞甲基雙丙烯酰胺（形成交聯(lián)） 丙烯酰胺和交聯(lián)劑丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng)亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚反應(yīng) 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決 于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。 。由幾條肽鏈組成。由幾條肽鏈組成 的蛋白質(zhì)復(fù)合體在的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDSSDS的作用下會(huì)的作用下會(huì)

7、， 因此測(cè)定的結(jié)果只是因此測(cè)定的結(jié)果只是。SDSSDS能與各能與各 種蛋白質(zhì)形成種蛋白質(zhì)形成，SDSSDS所帶負(fù)電荷所帶負(fù)電荷 的量大大超過了蛋白質(zhì)分子的量大大超過了蛋白質(zhì)分子。因而掩。因而掩 蓋了蓋了，使電泳遷移率完，使電泳遷移率完 全取決于分子的大小。全取決于分子的大小。 用用SDS SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì) 分子量的方法分子量的方法 樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定 蛋白質(zhì)提取和分離步驟蛋白質(zhì)提取和分離步驟 （一）血紅蛋白（一）血紅蛋白 每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)每個(gè)肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素亞鐵血紅素 基團(tuán)，基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶此基團(tuán)可攜帶一

8、分子氧一分子氧 或一分子二氧化碳，或一分子二氧化碳，血紅蛋白血紅蛋白 因含有因含有血紅素血紅素而呈而呈紅色紅色。 （一）血紅蛋白（一）血紅蛋白 樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定 蛋白質(zhì)提取和分離步驟蛋白質(zhì)提取和分離步驟 （二）操作過程（二）操作過程 去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的 分離純化。分離純化。 1 1、采集血樣。、采集血樣。 2 2、低速短時(shí)間離心。低速短時(shí)間離心。 3 3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。 4 4、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為、鹽水洗滌：用五倍體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.90.9的氯的氯

9、化鈉溶液洗滌?；c溶液洗滌。 5 5、低速短時(shí)間離心。低速短時(shí)間離心。 6 6、重復(fù)重復(fù)4 4、5 5步驟三次步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，直至上清液中已沒有黃色， 表明洗滌干凈。表明洗滌干凈。 （二）操作過程（二）操作過程 洗滌次數(shù)過少洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白；，無法除去血漿蛋白； 離心速度過高、時(shí)間過長(zhǎng)離心速度過高、時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋會(huì)使白細(xì)胞和淋 巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。巴細(xì)胞等一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。 (2)(2)血紅蛋白的釋放血紅蛋白的釋放：加蒸餾水到原血液體積，再加：加蒸餾水到原血液體積，再加 4040體積的甲苯體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢瑁?/p>

10、置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?010 分鐘（加速細(xì)胞破裂）分鐘（加速細(xì)胞破裂）, ,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以 2000r/min2000r/min的速度離心的速度離心10 min10 min。 第第1 1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；層（最上層）：甲苯層（無色透明）； 第第2 2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色）；層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色）； 第第3 3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色) )； 第第4 4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。層（最

11、下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。 用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏 斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。 取取1ml1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將 透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的物質(zhì)的量濃度為的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l20mmol/l的的 磷酸緩沖液磷酸緩沖液中（中（pHpH為為7.07.0），透析），透析1212小時(shí)。小時(shí)。 除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。 取長(zhǎng)取長(zhǎng)4040厘米，內(nèi)徑厘米，內(nèi)徑1.61.6厘米的玻璃管，厘

12、米的玻璃管，兩端需用砂紙磨兩端需用砂紙磨 平。平。底塞的制作：底塞的制作：打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安裝移液管頭部安裝移液管頭部覆覆 蓋尼龍網(wǎng)，再用蓋尼龍網(wǎng)，再用100100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。 ：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底 面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離面，否則難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離 不徹底。不徹底。頂塞的制作：頂塞的制作：打孔打孔安裝玻璃管安裝玻璃管。組裝：。組裝：將上將上 述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其

13、他附屬結(jié)構(gòu)。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。 A A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75G-75）。）。 B B、代表意義：、代表意義：“G G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨表示凝膠的交聯(lián)程度，膨 脹程度及分離范圍脹程度及分離范圍。7575表示凝膠的得水值，即表示凝膠的得水值，即 每克凝膠膨脹時(shí)吸水每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.57.5克?？?。 配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱 取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分 溶脹后，配成凝膠懸浮液。溶脹后，配成凝膠懸浮液。 A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。 B、裝

14、填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜、裝填：將凝膠懸浮液一次性緩慢倒入色譜 柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝柱內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝 均勻。均勻。 1、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之 間的空隙。間的空隙。 2、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀?、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀?會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分 離效果。離效果。 裝填完畢后，裝填完畢后， 立即用緩沖液洗脫瓶，在立即用緩沖液洗脫瓶，在 50cm50cm高的操作壓下，用高的操作壓下，用300ml300ml 的的20mmo

15、l/l20mmol/l的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液 （pHpH為為7.07.0）充分洗滌平衡）充分洗滌平衡1212 小時(shí)。小時(shí)。 1 1、液面不要低于凝膠表面，、液面不要低于凝膠表面， 否則可能有氣泡混入，影響否則可能有氣泡混入，影響 液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生 物大分子物質(zhì)的分離效果。物大分子物質(zhì)的分離效果。 2 2、不能發(fā)生洗脫液流干，露、不能發(fā)生洗脫液流干，露 出凝膠顆粒的現(xiàn)象出凝膠顆粒的現(xiàn)象。 打開下端出打開下端出 口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝 膠面平齊，關(guān)閉出口。膠面平齊，關(guān)閉出口。 吸管吸吸管吸1ml1ml樣樣 品加到色譜柱的頂端，

16、滴加樣品時(shí)，品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)， 吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣， 同時(shí)注意不要破壞凝膠面。同時(shí)注意不要破壞凝膠面。 加樣后打開加樣后打開 下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)， 等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉 下端出口下端出口 小心加入小心加入pH=7.0 的的 20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)?shù)牧姿峋彌_液到適當(dāng) 高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開 下端出口進(jìn)行洗脫。下端出口進(jìn)行洗脫。 待紅色的蛋白質(zhì)接近待紅色的蛋白質(zhì)接近 色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出 液，每液，每5ml收集一試管，連續(xù)收收集一試管，連續(xù)收 集。集。 正確的加樣操作是：正確的加樣操作是：1 1、不要觸及并破壞凝膠面。、不要觸及并破壞凝膠面。 2 2、貼壁加樣。、貼壁加樣。3 3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。 在分離過程中，如果紅色在分離過程中，如果紅色 區(qū)帶均勻一致的移