trizol LS 試劑使用中文說明書

1、trizol ls 試劑使用中文說明書trizol ls 試劑(ambion)（中文說明書）貨號 規(guī)格 室溫貯存10296-010 100ml10296-028 200ml產(chǎn)品描述trizol ls試劑適用于液體樣品，如人、動植物、酵母、細菌或者病毒來源的液體樣品，提取高質(zhì)量的總rna（dna和蛋白質(zhì)也可以）全過程只需1小時。trizol ls試劑里含有酚、異硫氰酸胍和其它成分，由于在搖勻樣品過程中能很有效地抑制rnase活性，所以trizol ls試劑能維持rna完整性。trizol ls試劑允許同時處理大量的樣品。trizol ls試劑能從一個樣品里有序分離提取rna、dna和蛋白質(zhì)。tr

2、izol ls試劑均質(zhì)化樣品后，加入氯仿，能看見分層現(xiàn)象，上層是透明的含rna的水相，中間層，下層是紅色的有機相（含有dna和蛋白質(zhì)）。水相rna用異丙醇能沉淀分離；中間層或者下層中的dna用乙醇沉淀分離；異丙醇沉淀能使蛋白質(zhì)從酚-醇相的上清液中沉淀出來。沉淀出的rna、dna和蛋白質(zhì)洗脫雜質(zhì)，重懸后用于下游。分離的rna可以用于rt-pcr, northern blot analysis, dot blot hybridization, poly(a)+ selection, in vitro translation, rnase protection assay, and molecula

3、r cloning分離的dna可以用于pcr, and restriction enzyme digestion, and southern blots. 分離的蛋白質(zhì)可以用于western blots, recovery of some enzymatic activity, and some immunoprecipitation.注意：trizol ls試劑適用于液體樣品（如，血液和病毒制品）。trizol ls試劑與trizol試劑僅在它們成分的含量上不同，trizol ls試劑的濃度更高，因此相對于同個樣品時，trizol ls試劑需要量更少。不要將未稀釋的trizol ls試劑用于

4、固體樣品。處理固體樣品時，trizol ls試劑沒有trizol試劑效果好，收率要低些。警告trizol ls試劑含有的成分具有毒、腐蝕性和刺激性，如果處理不慎會有危害健康。請在通風櫥里操作，并穿好實驗服、戴好手套和安全眼鏡。避免直接接觸trizol ls試劑，會導致皮膚、眼睛或者呼吸道等暴露部位的化學灼傷。如果萬一接觸了皮膚或者眼睛，請立即用大量水沖洗15min，必要時去醫(yī)院護理。如果吸入了氣體，立刻到通風地方呼吸新鮮空氣，必要時去醫(yī)院護理。內(nèi)容和貯存trizol ls試劑有100ml和200ml兩種規(guī)格的，室溫運輸和貯存。妥善保管，1年內(nèi)性質(zhì)都很穩(wěn)定。使用目的僅用于研究，不能用于人或動物的

5、診斷或治療。需要材料分離rna、dna和蛋白質(zhì)還需要下列材料，但是我們未提供分離rna時，需要：氯仿；異丙醇；75%乙醇（depc水處理過）；無rnase水或者0.5%sds；能達到12,000*g的高速離心機；聚丙烯微量離心管；水浴槽（55-60）。分離dna時，需要：氯仿；100%乙醇；75%乙醇；0.1m檸檬酸鈉（10%乙醇）；8mm naoh；能達到12,000*g的高速離心機；聚丙烯微量離心管。分離蛋白質(zhì)時，需要：氯仿；異丙醇；100%乙醇；0.3m鹽酸胍（95%乙醇）；1%sds；能達到12,000*g的高速離心機；聚丙烯微量離心管。樣品準備樣品均質(zhì)化1.確定樣品類型，在室溫下如下

6、表操作。trizol ls試劑與樣品的體積比為3:1，一定要按指定的量加入trizol ls試劑，否則提取rna會有dna污染。6注意：當樣品少量（<10細胞或者<10mg組織）或者樣品體積<0.25ml，為方便提取rna，需用無rnase水調(diào)整樣品體積到0.25ml。樣品類型為生物液體時，操作步驟：1.每0.25ml樣品加入0.75mltrizol ls試劑；2.移液器上下吹勻幾次，使樣品均勻。注意：污染物質(zhì)含量高的生物液體（如，全血）應該先用無rnase水按1:1稀釋。樣品類型為組織時，操作步驟：1.每50-100mg組織樣品或者0.25ml組織懸液加入0.75mltri

7、zol ls試劑；2.高速攪拌器混勻樣品。注意：采集樣品后要立即處理和冷凍組織樣品，不能處理未稀釋的固體樣品。樣品類型為單層貼壁細胞時，操作步驟：1.吸出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液；2.每10cm2表面積的培養(yǎng)皿加入0.3-0.4mltrizol ls試劑,直接加到培養(yǎng)皿里細胞上；3. 移液器上下吹勻幾次，在培養(yǎng)皿里直接裂解細胞。注意：不要在培養(yǎng)皿中加水混勻，粘附在皿上的殘留培養(yǎng)液足夠了。 樣品類型為懸浮細胞時，操作步驟：1.離心去除培養(yǎng)液獲得細胞；2.每0.25ml樣品（來自動植物或者酵母細胞5-10*106，或者細菌細胞1*107）加入0.75mltrizol ls試劑；注意：加入trizol ls

8、試劑之前切忌洗滌細胞，避免增加mrna降解機率；3. 移液器上下吹勻幾次，裂解細胞，對于酵母或者細菌細胞，可能還需要高速攪拌器來充分裂解。2.（可選）當樣品里脂肪、蛋白、多糖或者胞外物質(zhì)（如，肌肉、脂肪組織或者塊莖植物等材料），需要再加個分離步驟，移除樣品里難溶物質(zhì)。注意：如果你還需要回收樣品里dna，就不能做此步。具體步驟：1.混勻樣品（如前面步驟1所述）后，4下，12,000*g離心樣品10min；注意：離心后沉淀物質(zhì)包含ecm、多糖和高分子量的dna，rna在上清液里，若樣品富含脂肪，在上清液上面還有脂肪層；2.移除覆蓋的脂肪層；3.將澄清的上清液移到新的離心管中。3.進行相分離，或者儲

9、存已混勻的樣品。此樣品能在室溫放置幾個小時，或者在-60到-70至少一個月。相分離1. 室溫靜置已混勻樣品（見混勻樣品步驟）5min。2. 每0.75mltrizol ls試劑加入0.2ml氯仿。蓋緊離心管的蓋子。3. 使勁地手搖離心管15s。4. 室溫靜置2-15min。5. 4下，12,000*g離心樣品15min。注意：混合物被分為3層，上層是澄清的水相，中間層，下層是紅色的酚-氯仿相，只有rna被排除在水相里。上層水相體積約占trizol ls試劑最初體積的70%。6. 傾斜離心管為45，小心地用移液器吸走水相，避免吸到中間層或者有機層。7. 將水相移到新的離心管，然后進行rna分離步

10、驟。8. 如果需要分離dna和蛋白質(zhì)，則保持中間層和酚-氯仿相有機層。詳見dna分離步驟和蛋白質(zhì)分離步驟。有機相可在4保存過夜。rna分離步驟當制備和處理rna時，需要采取適當措施避免rnase污染。rna沉淀61. （可選）當沉淀從少量樣品（<10細胞或者<10mg組織）提取的rna，需要添加5-10g不含rnase的糖原作為水相的載體。注意：糖原是rna的輔助沉淀劑，濃度4mg/ml時不會抑制第一鏈合成，也不會抑制pcr。2. 每0.75mltrizol ls試劑加入0.5ml100%異丙醇到水相。3. 室溫靜置10min。4. 4下，12,000*g離心10min。注意：離心

11、前，rna通?？床灰?，離心后，在離心管底部和側(cè)面可見絲狀沉淀物。5. 進行rna洗滌和重懸rna洗滌和重懸1. 移走離心管里上清液，只留rna沉淀。2. 每0.75mltrizol ls試劑加入1ml 75%乙醇洗滌rna沉淀。渦旋，混勻樣品。3. 4下，7500*g離心5min，棄上清液。4. 真空或者空氣干燥rna沉淀5-10min，不要用真空離心干燥機干燥rna沉淀。注意：不要讓rna沉淀干燥太徹底，否則rna沉淀溶解度降低，會使a260/280<1.6。5. 用無rnase水或者0.5%sds（20-50l）重懸rna沉淀，移液器上下輕輕吹溶液幾次。注意：如果要用于隨后的酶反應中

12、，就不要將rna溶解在0.5%sds里。6. 在水浴槽55-60孵育10-15min。7. 繼續(xù)下游操作或者儲存在-70。dna分離步驟從相分離步驟中保存的中間層和酚-氯仿層提取dna。dna沉淀1. 移走覆蓋在中間層上的殘留水相層，這是涉及到dna提取質(zhì)量的關(guān)鍵一步。2. 每0.75mltrizol ls試劑加入0.3ml 100%乙醇。3. 蓋緊離心管，上下顛倒幾次，混勻樣品。4. 室溫靜置2-3min。5. 4，2000*g離心5min，沉淀dna。6. 移走酚-氯仿層，如果需要提取蛋白質(zhì)，則保留在新的離心管中。該上清液可在-70下保存數(shù)月。7. 對dna沉淀進行dna洗滌和重懸。dna

13、洗滌和重懸1. 每0.75mltrizol ls試劑加入1ml檸檬酸鈉/乙醇溶液（10%乙醇溶有0.1m檸檬酸鈉，ph8.5）。2. 室溫靜置30min，不定時輕輕地上下倒置混勻。注意：dna能在檸檬酸鈉/乙醇溶液里保存2h。3. 4，2000*g離心5min，棄上清液。4. 再次洗滌（重復步驟1-3）。注意：當dna沉淀較多（>200g）時，重復洗滌兩次。5. 每0.75mltrizol ls試劑加入1.5-2ml75%乙醇。注意：dna樣品在75%乙醇4能保存數(shù)月。6. 室溫靜置10-20min，不定時輕輕地上下倒置混勻。7. 4，2000*g離心5min，棄上清液。8. 真空或者空

14、氣干燥dna沉淀5-10min，不要用真空離心干燥機干燥rna沉淀。9. 以0.20.3 g/l 濃度用8mm naoh重懸dna，每50-70mg組織或者1*107細胞加入8mm naoh 0.3-0.6ml。注意：我們高度建議用溫和堿溶液重懸dna，因為分離的dna在水或者tris緩沖液中重懸效果不好。10. 4，12,000*g離心10min，移走不溶物質(zhì)。11. 將含dna的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，若需要，用hepes調(diào)節(jié)ph，進行下游操作。dna能在4保存過夜，要想長期保存，則需用hepes調(diào)節(jié)ph7-8，添加1mm edta，保存在4或者-20。dna和rna產(chǎn)量測定用rna和d

15、na在260nm和280nm處的吸收值測定濃度。預期產(chǎn)量下表列出了各種來源材料提取rna（a260/280>1.8）和dna（a260/280為1.6-1.8）的標準產(chǎn)量 蛋白分離步驟從dna沉淀步驟后留下來的酚-氯仿層分離蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)沉淀或者蛋白透析。蛋白質(zhì)沉淀1. 每1mltrizol ls試劑加入1.5ml異丙醇到酚-氯仿層。2. 室溫靜置10min。3. 4，12,000*g離心10min，保留沉淀的蛋白，棄上清液。4. 對蛋白沉淀進行蛋白洗滌。蛋白洗滌 1. 準備洗滌液，即：0.3m鹽酸胍溶于95%乙醇。2. 每1mltrizol ls試劑加入2ml洗滌液，洗滌蛋白沉淀。 3

16、. 室溫靜置20min。注意：蛋白樣品可在0.3m鹽酸胍-95%乙醇，4下保存一個月或者-20至少保存一年。4. 4，7500*g離心5min，棄洗滌液。 5. 重復步驟2-4，兩次。6. 洗滌3次后，加入2ml100%乙醇，渦旋。 7. 室溫靜置20min。8. 4，7500*g離心5min，棄乙醇洗滌液。9. 空氣干燥蛋白沉淀5-10min，不要干燥太徹底。 10. 進行蛋白重懸步驟。 蛋白重懸1. 加1%sds200l,用移液管上下吹打直到蛋白重懸。注意：為了徹底溶液蛋白沉淀，可能需要將蛋白沉淀在水浴槽50孵育。 2. 4，10,000*g離心10min，讓不溶物質(zhì)沉淀。3. 將含有蛋白的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，進行下游操作或者保存在-20。 蛋白透析1. 將酚-氯仿層溶液放進透析膜中。注意：酚-氯仿層溶液能溶解某些透析膜（如，纖維素酯）。操作前需要檢查下。 2. 在4下，用0.1%sds溶液透析樣品，需要更