實(shí)驗(yàn)六 土壤中微生物的分離和

1、實(shí)驗(yàn)六 土壤中微生物的分離和純 化, 微生物的培養(yǎng)特征觀察,環(huán)境中 的微生物 一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 學(xué)習(xí)掌握倒平板的方法和幾種分離純化微 生物的基本操作技術(shù) 2 了解不同微生物在液體,半固體,固體培養(yǎng) 基上的培養(yǎng)特征 3 學(xué)習(xí)并掌握各種無菌操作接種技術(shù) 二 實(shí)驗(yàn)原理 1 微生物的分離純化原理 自然條件下的微生物往往是不同種類微生物的混合體。為 了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)和使用某種微生 物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這種獲 得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。 在自然界中，上壤是微生物生活的良好環(huán)境，其中生活的 微生物數(shù)量和種類都是極其豐富的。土壤中的微生物數(shù)量 與種類非常

2、多,在通氣良好的花園土中，好氣性微生物占 有絕對(duì)優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)以花園土為材料分離土壤中的好氣性 細(xì)菌. 分離微生物常用的方法有稀釋平板分離法和劃線分離法， 根據(jù)不同的材料，可以采用不同方法，其最終目的是要在 培養(yǎng)基上出現(xiàn)欲分離微生物的單個(gè)菌落，必要時(shí)再對(duì)單菌 落進(jìn)一步分離純化。在用稀釋平板法分離微生物時(shí)，還可 以同時(shí)測定待分離的微生物的數(shù)量。 倒平板的方法 倒平板（a）皿架法；（b）手持法 稀釋平板計(jì)數(shù)法中樣品的稀釋和稀釋后的取樣培養(yǎng) 平板涂布法 平板劃線分離法 （a）交叉劃線法。（l、2、3、4為依次劃線的起點(diǎn)）； （b）連續(xù)劃線法（1、 2力依次劃線的起點(diǎn)）； （c）劃線操作 2 微生物的培

3、養(yǎng)特征原理 1) 微生物的菌落特征 在固體平板培養(yǎng)基上，單個(gè)微生物細(xì)胞或 孢子生長繁殖可以形成一個(gè)具有特定形狀 的菌落。在一定的培養(yǎng)基上和一定培養(yǎng)條 件下，微生物的菌落特征是穩(wěn)定的，因此 通過菌落的觀察可以識(shí)別細(xì)菌、放線菌、 酵母菌和霉菌等幾大類微生物。菌落的基 本特征包括菌落形狀、大小、邊緣、隆起 度和顏色等。 2) 微生物的培養(yǎng)特征是指微生物培養(yǎng)在培 養(yǎng)基上所表現(xiàn)出來的群體形態(tài)和生長情況. 一般可用斜面,液體,和半固體培養(yǎng)基來檢驗(yàn) 不同微生物的培養(yǎng)特征.它們培養(yǎng)在斜面培 養(yǎng)基上,可以呈絲線狀, 刺毛狀, 串珠狀,舒展 狀,樹枝狀或假根狀. 生長在液體培養(yǎng)基內(nèi), 可以呈渾濁,絮狀,黏液狀,

4、形成菌膜, 上層清 晰而底部顯沉淀狀. 穿刺接種在半固體培養(yǎng) 基中,可以沿穿刺線向四周蔓延, 或僅沿穿刺 線生長, 也可上層生長得好,甚至連成一片, 底部很少生長; 或底部長的好,上層甚至不生 長. 固體斜面培養(yǎng)特征 液體培養(yǎng)特征 半固體穿刺培養(yǎng)特征 3 微生物的無菌操作接種原理 1) 斜面接種 菌種管和待接試管在手中的拿法 試管拔塞后的滅菌 試管拔塞后的取菌 2) 穿刺接種 穿刺接種 （a）水平穿刺接種；（b）垂直穿刺接種 三 實(shí)驗(yàn)器材 1 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,倒平 板, 斜面,液體,半固體培養(yǎng)基. 2 器材：花園土，99mL無菌水1瓶，9mL無 菌水4支，1mL槍頭, 0.1m

5、L, 直徑9cm的無 菌平皿，天平，試管架，無菌稱量紙，酒 精燈，火柴，接種環(huán)，涂布棒，記號(hào)筆等. 3 菌種: 金黃色葡萄球菌, 變形桿菌,枯草桿 菌. 四 實(shí)驗(yàn)方法 1 倒平板: 在微波爐中將三角瓶內(nèi)的培養(yǎng)基熔化, 取滅菌的培養(yǎng)皿, 每組倒12個(gè)平 板. 2 土壤稀釋液的制備 稱取1g花園土，無菌操作倒入99mL無菌生理鹽水中,在震蕩器中振蕩 20分鐘, 使微生物細(xì)胞分散，靜置2030s，即成10-2稀釋液；再用 lmL移液器，吸取10-2稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的試管中，振 蕩，讓菌液混合均勻，即成10-3稀釋液；再換一支無菌吸頭吸取10-3 稀釋液lmL，移入裝有9mL無菌水的

6、試管中，振蕩，即成10-4稀釋液； 以此類推，連續(xù)稀釋，制成 10-2、10-3、10-4、10-5等一系列稀釋菌液。 3 平板涂布 將培養(yǎng)基平板編號(hào)，然后用移液槍吸取10-3、10-4、10-5等一系列稀釋 菌液各0lmL對(duì)號(hào)接種在不同稀釋度編號(hào)的瓊脂平板上（每個(gè)編號(hào)設(shè) 兩個(gè)重復(fù)）。再用無菌涂布棒將菌液在平板上涂布均勻，每個(gè)稀釋度 用一個(gè)滅菌涂布棒；更換稀釋度時(shí)需將涂布棒灼燒滅菌。 4 培養(yǎng) 將涂布好的平板平放于桌上1020min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然 后將平板倒轉(zhuǎn)。恒溫37培養(yǎng), 兩天后觀察. 5 連續(xù)劃線分離: 用滅菌接種環(huán)蘸取10-2稀釋液一環(huán)于已凝固的平 板上進(jìn)行劃線。劃線可按以

7、下兩種方式進(jìn)行：一 種為交叉劃線法，是在平板的一邊做第一次“Z” 字形劃線。轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70角，將接種環(huán)在火 上燒過并冷卻后，通過第二次劃線部分，做第二 次“Z”字形劃線。同法進(jìn)行第三次、第四次劃 線。另一種為連續(xù)劃線法，是從平板邊緣的一點(diǎn) 開始連續(xù)作緊密的波浪式劃線，直至平板中央。 轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿 180，再從平板另一邊（不燒接種 環(huán)）同樣劃線至平板中央。 6 培養(yǎng) 將平板倒轉(zhuǎn), 恒溫37培養(yǎng)兩天后觀察. 7 培養(yǎng)特征觀察接種 分別取斜面,半固體和液體培養(yǎng)基,作好標(biāo)記,分別按要求接 種金黃色葡萄球菌, 變形桿菌,枯草桿菌. 8 將接好的培養(yǎng)基置于37培養(yǎng)兩天后觀察. 9 環(huán)境中的微生物 取一個(gè)平板移取皿蓋,使培養(yǎng)基暴露在空氣中; 將另一個(gè)平 板移取皿蓋, 放在一個(gè)較干凈的環(huán)境, 半小時(shí)后將兩個(gè)皿蓋 該上, 將平板倒轉(zhuǎn), 恒溫37培養(yǎng)兩天后觀察. 10 體表不同部位的微生物 取一個(gè)平板, 用記號(hào)筆在平板背面化分為幾部分,每部分標(biāo) 記好要檢測的部位,如手,頭發(fā),衣服等, 可將洗手前后分別 檢測.然后用不同的人體部位按在標(biāo)記好