實(shí)驗(yàn)七微生物的分離純化與平板菌落計(jì)數(shù)(二)

1、實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 微生物的分離純化與微生物的分離純化與 平板菌落計(jì)數(shù)（二）平板菌落計(jì)數(shù)（二） 一、目的要求一、目的要求 n1.了解分離與純化微生物的基本原理及了解分離與純化微生物的基本原理及 方法。方法。 n2.掌握倒平板的方法和平板劃線分離的掌握倒平板的方法和平板劃線分離的 基本操作技術(shù)?；静僮骷夹g(shù)。 n 二、分離純化基本原理二、分離純化基本原理 n自然界中的微生物是各種類微生物的混合體，因此，為自然界中的微生物是各種類微生物的混合體，因此，為 了研究某微生物的特性，或者要大量地培養(yǎng)和利用某微了研究某微生物的特性，或者要大量地培養(yǎng)和利用某微 生物，必須把它們這些混雜的微生物群中分離出來。從生物

2、，必須把它們這些混雜的微生物群中分離出來。從 而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為 微生物的分離和純化。微生物的分離和純化。 n為了獲得某微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對營為了獲得某微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對營 養(yǎng)，酸堿度，氧等條件要求不同，而供給它們適宜的生養(yǎng)，酸堿度，氧等條件要求不同，而供給它們適宜的生 活條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑活條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑 制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其它雜菌，再通過各種制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其它雜菌，再通過各種 稀釋法（平板稀釋法，

3、平板劃線法等），使它們在固體稀釋法（平板稀釋法，平板劃線法等），使它們在固體 培養(yǎng)基上形成單菌落，從而得到純菌株。培養(yǎng)基上形成單菌落，從而得到純菌株。 n平板菌落計(jì)數(shù)法是將等測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，其平板菌落計(jì)數(shù)法是將等測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，其 中的微生物充分分散為單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀中的微生物充分分散為單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀 釋液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生釋液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生 長繁殖而形成的肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落長繁殖而形成的肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落 應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根 據(jù)其稀釋倍數(shù)和取

4、樣接種量即可換算出樣品中的據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的 含菌數(shù)。含菌數(shù)。 n菌落形成單位菌落形成單位(colony-formingunits，cfu) 表示樣品的活菌含量表示樣品的活菌含量。 平板菌落計(jì)數(shù)法基本原理平板菌落計(jì)數(shù)法基本原理 三、器材三、器材 n牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；伊紅美蘭培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；伊紅美蘭培養(yǎng)基。 n 盛盛9 9毫升無菌水的試管；無菌吸管；無菌毫升無菌水的試管；無菌吸管；無菌 培養(yǎng)皿；樣品等。培養(yǎng)皿；樣品等。 四、四、平板菌落記數(shù)法平板菌落記數(shù)法操作步驟操作步驟 （1 1）編號）編號 取無菌培養(yǎng)皿取無菌培養(yǎng)皿6 6套，分別標(biāo)明為套，分別標(biāo)明為101

5、0-4 -4、 、1010-5 -5、 、1010-6 -6 各二套，另取各二套，另取6 6支無菌試管水（上次準(zhǔn)備）分別支無菌試管水（上次準(zhǔn)備）分別 標(biāo)記為標(biāo)記為1010-1 -1、 、1010-2 -2、 、1010-3 -3、 、1010-4 -4、 、1010-5 -5、 、1010-6 -6。 。 （2 2）制備稀釋液：）制備稀釋液： 用用1 1毫升無菌吸管吸取一毫升樣品注入盛有毫升無菌吸管吸取一毫升樣品注入盛有9 9毫升毫升 無菌水的試管中，吹吸三次，并振搖使之充分混無菌水的試管中，吹吸三次，并振搖使之充分混 勻。然后再用一支吸管從此試管中吸取一毫升注勻。然后再用一支吸管從此試管中吸

6、取一毫升注 入另一盛有入另一盛有9 9毫升無菌水的試管中，以次類推制毫升無菌水的試管中，以次類推制 成成1010-1 -1、 、1010-2 -2、 、1010-3 -3、 、1010-4 -4、 、1010-5 -5、 、1010-6 -6的各種稀釋 的各種稀釋 度的菌懸液。度的菌懸液。 1.稀釋樣品稀釋樣品 1 ml 9 ml 原液原液 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 2. 取取 0.1 ml n（5 5）培養(yǎng)：）培養(yǎng)：倒置倒置37培養(yǎng)培養(yǎng)24-48h n（4 4）倒平板）倒平板 牛肉膏牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基蛋白胨培養(yǎng)基熔化后冷卻至熔化后冷卻至45oC,倒入每倒入每

7、 付平板約付平板約15-20ml，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿，置水平位置迅速旋動(dòng)平皿， 使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，室溫放置至凝固。使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，室溫放置至凝固。 n（3 3）取樣）取樣 吸取吸取1010-4 -4、 、1010-5 -5、 、1010-6 -6這三個(gè)稀釋度的菌液各 這三個(gè)稀釋度的菌液各 0.1ml0.1ml，對號放入編號號的無菌平皿中。，對號放入編號號的無菌平皿中。 n（6 6）記數(shù)：）記數(shù)：挑選三個(gè)稀釋度中菌落數(shù)目合適的挑選三個(gè)稀釋度中菌落數(shù)目合適的 （30-5030-50個(gè)）計(jì)數(shù)，算出同一稀釋度個(gè)）計(jì)數(shù)，算出同一稀釋度2 2個(gè)平板上的個(gè)平板上的 菌落平均數(shù)，并按下列公式

8、進(jìn)行計(jì)算：菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算： 每毫升樣品中有菌落形成單位（每毫升樣品中有菌落形成單位（cfu）=同一稀同一稀 釋度二次重復(fù)的平均菌落數(shù)釋度二次重復(fù)的平均菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)X10。 2. 2.平板劃線分離法：平板劃線分離法： n（1 1）倒平板）倒平板: :伊紅美蘭培養(yǎng)基熔化后冷卻伊紅美蘭培養(yǎng)基熔化后冷卻 到到6060度倒入無菌培養(yǎng)皿度倒入無菌培養(yǎng)皿, ,每組每組4 4皿，室溫放皿，室溫放 置至凝固。置至凝固。 n（2 2）劃線：劃線的方法很多，但無論哪種）劃線：劃線的方法很多，但無論哪種 方法劃線，其目的是通過劃線將樣品在平方法劃線，其目的是通過劃線將樣品在平 板上進(jìn)行稀

9、釋，使之形成分散的單個(gè)菌落。板上進(jìn)行稀釋，使之形成分散的單個(gè)菌落。 n接種環(huán)取菌液劃線接種環(huán)取菌液劃線,每位同學(xué)每位同學(xué)1付付 平板劃線法 n(3)(3)培養(yǎng)培養(yǎng): :平板平板倒置倒置于于37,培養(yǎng)培養(yǎng)24-48h n（4 4）挑菌：）挑菌：挑取紫黑色帶金屬光澤的單菌挑取紫黑色帶金屬光澤的單菌 落接入斜面落接入斜面試管試管( (每人每人1支標(biāo)記備用，下次支標(biāo)記備用，下次 生理生化試驗(yàn)用生理生化試驗(yàn)用)。 EMBagar 五、結(jié)果與思考五、結(jié)果與思考 n 1. 1.在平板劃線法中，為什么每次都需要在平板劃線法中，為什么每次都需要 將接種環(huán)上剩余物燒掉？將接種環(huán)上剩余物燒掉？ n 2. 2.為什么

10、要把培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？為什么要把培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？ n 3. 3. 同一種菌液用血球計(jì)數(shù)板和平板菌落同一種菌液用血球計(jì)數(shù)板和平板菌落 計(jì)數(shù)法同時(shí)計(jì)數(shù)，所得結(jié)果是否一樣？為計(jì)數(shù)法同時(shí)計(jì)數(shù)，所得結(jié)果是否一樣？為 什么？什么？ n 配微生物生理生化反應(yīng)用培養(yǎng)基配微生物生理生化反應(yīng)用培養(yǎng)基 n1-2組組各配糖發(fā)酵培養(yǎng)基各配糖發(fā)酵培養(yǎng)基200ml，分裝，分裝20支試支試 管，管，5cm高度，每支內(nèi)倒放杜氏小管高度，每支內(nèi)倒放杜氏小管1支。支。 n3-4組組各配吲哚培養(yǎng)基各配吲哚培養(yǎng)基200ml，分裝，分裝20支試管。支試管。 n5-6組組各配產(chǎn)各配產(chǎn)H2S培養(yǎng)基培養(yǎng)基300ml，分裝，分裝20支試支試 管。

11、管。一半高度。一半高度。 n7-8組組各配甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)基各配甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)基200ml，分裝，分裝20 支試管。支試管。 n9組配組配淀粉水解淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基試驗(yàn)培養(yǎng)基500ml，裝入，裝入2只只 250ml三角瓶。三角瓶。 培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基配方 n1.糖發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基（液體）糖發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基（液體） 蛋白胨蛋白胨10g，NaCl5g，葡萄糖，葡萄糖10g，水，水1000ml，PH7.4-7.6， 加加1.6%溴甲酚紫溴甲酚紫1-2ml， 121，滅菌，滅菌20min n2.產(chǎn)產(chǎn)H2S試驗(yàn)培養(yǎng)基（固體試驗(yàn)培養(yǎng)基（固體） 蛋白胨蛋白胨20g，NaCl5g，檸檬酸鐵銨，檸檬酸鐵銨0.5g，硫代硫酸鈉，硫代硫酸鈉0.5g，瓊，瓊 脂脂15g，水，水1000ml， PH7.2，121，滅菌，滅菌20min 培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基配方 n3.蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗(yàn)，液體）蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗(yàn)，液體） 蛋白胨蛋白胨10g，NaCl5g，水，水1000ml，PH7.6， 121滅菌滅菌20min n4淀粉培養(yǎng)基（固體）淀