2742.探討小麥硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因RTPCR半定量檢測(cè)體系的建立

1、 科技大學(xué)200 屆畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題目：探討小麥硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因rt-pcr半定量檢測(cè)體系的建立姓 名: 專(zhuān) 業(yè)： 生物技術(shù) 學(xué) 院： 生命科學(xué)學(xué)院 指導(dǎo)教師： 完成日期： 2004年6月 小麥硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因rt-pcr半定量檢測(cè)體系的建立摘要 應(yīng)用rt-pcr技術(shù)， 以tubulin為內(nèi)參基因，小麥硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(sul)為檢測(cè)基因，優(yōu)化mg2+濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)、引物濃度和taq酶濃度，獲得適宜的pcr反應(yīng)參數(shù)，建立一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定、準(zhǔn)確、特異的檢測(cè)sul表達(dá)量的半定量體系，為進(jìn)一步研究小麥硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制奠定技術(shù)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞 小麥；tubulin；硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；rt-pcr；半

2、定量pcrto establish a method of semiquantitative polymerase chain reaction for detecting sul gene expressionabstract to establish a method of semiquantitative polymerase chain reaction for detecting sulphate transporter gene expression in wheat roots，we established a semiquantitative pcr by putting pr

3、imer of tubulin served as internal reference gene and primer of target gene in the same conditions and optimizing experiment parameters for pcr such as the concentration of mg2+ and cycle times etc. this method is usable to test the expressive level of sul gene in the wheat roots.key words：wheat；sul

4、phate transporter；rt-pcr；semiquantitative pcr前 言硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白即硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一類(lèi)主動(dòng)運(yùn)輸硫酸根時(shí)所需的載體蛋白，也是植物體吸收、運(yùn)輸硫元素時(shí)的必需蛋白。硫元素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的基本元素之一，它主要以so42-形式被植物吸收，通過(guò)硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入植物體后，大部分同化為含硫氨基酸（如胱氨酸，半胱氨酸和蛋氨酸）和輔酶a硫胺素、生物素等維生素。因此硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白植物原生質(zhì)構(gòu)成、能量固定、光合作用、固氮作用提高植物抗逆性等方面起到非常重要的作用。近年來(lái)，由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的提高增加了單位面積上養(yǎng)分的輸出，不含硫或含硫少的肥料的使用量增加，作物秸稈還田少或作其他用

5、途，導(dǎo)致土壤缺硫現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重。硫缺乏已成為很多地區(qū)限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一，因而研究硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)提高小麥吸硫效率提高小麥品質(zhì)與產(chǎn)量有著非常重要的意義。為了進(jìn)一步探討硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因調(diào)控機(jī)制，有必要建立一種靈敏，簡(jiǎn)便，特異的半定量檢測(cè)sul mrna表達(dá)的方法。逆轉(zhuǎn)錄多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rtrcr)技術(shù)法是近年來(lái)發(fā)展出來(lái)的探討基因轉(zhuǎn)錄水平的有效手段。因此本實(shí)驗(yàn)采用小麥為供試材料，以tubulin為內(nèi)參基因，sul為檢測(cè)基因，應(yīng)用rt-pcr技術(shù)對(duì)小麥根部硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)進(jìn)行半定量，建立一個(gè)特異、穩(wěn)定的rt-pcr半定量檢測(cè)體系，為進(jìn)一步研究其表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。一、材料與方法（一）實(shí)驗(yàn)材料

6、采用鄭引1號(hào)小麥。 （二）主要試劑1、主要試劑 hogland營(yíng)養(yǎng)液，trizol， m-mlv反轉(zhuǎn)錄酶，taq酶和pcr其他相關(guān)試劑，dna回收純化試劑盒，0.5tbe，瓊脂糖。2引物 （1）tubulin引物：根據(jù)nemoto等設(shè)計(jì)的擴(kuò)增小麥tubulin基因片段的引物合成了上游引物和下游引物。 （2）sul引物：根據(jù)小麥硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因序列tae512817分別自行設(shè)計(jì)和合成上游引物和下游引物。（3）反轉(zhuǎn)錄引物：oligo-d（t）。（三）主要儀器eppendorf 5415d型離心機(jī)，rt-200型 pcr擴(kuò)增儀，dyy型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠），uvi凝膠成像系統(tǒng)。（四）實(shí)驗(yàn)方

7、法1材料準(zhǔn)備 小麥種子用5% naclo消毒10min，吸脹24h，萌發(fā)48h后，在完全hogland營(yíng)養(yǎng)液中光照培養(yǎng)至3葉期。2總rna提取 取小麥根0.1g，置液氮迅速研磨，加trizol 1000ml，室溫靜置5min。加氯仿200ml劇烈混勻，4下12000g 離心15min。吸取上層水相加400ml異丙醇，混勻室溫靜置10min，4下12000g 離心10min。小心棄上清，沿管壁加75乙醇1000ml洗滌管壁。加75乙醇1000ml渦懸，4下8000g離心10min。小心棄上清，短暫離心，吸取所有上清，沉淀于超凈臺(tái)下干燥，加20ml depc h2o溶解。 取5ml 總rna稀釋1

8、00倍，測(cè)od值，檢驗(yàn)其純度。取5ml 總rna進(jìn)行 1.0瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)rna的完整性。3反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20ml，含總rna 2mg。 分別取5ml oligo-d（t）（100mg/l），總rna 3.64ml（見(jiàn)表1）h2o 3.36ml ，70水浴10min，冰驟冷5min。加5buffer 4ml，dntp 2ml，rnasin 1ml，m-mlv 1ml，37反應(yīng)1h，95 5mim中止反應(yīng)。4pcr擴(kuò)增 參照標(biāo)準(zhǔn)pcr反應(yīng)體系，優(yōu)化mg2+濃度退火溫度模板濃度循環(huán)次數(shù)引物濃度和taq酶濃度，獲得適宜的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，建立半定量pcr檢測(cè)體系。5pcr產(chǎn)物的鑒定pcr擴(kuò)增產(chǎn)物在0

9、.5tbe緩沖液中用1.0瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，電壓60v，電泳40min，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果并切下特異dna片段，用天為時(shí)代dna回收純化試劑盒進(jìn)行回收，送上海生工公司測(cè)序。 二、結(jié)果與分析（一）小麥根系總rna提取結(jié)果 所提取的rna在0.5tbe緩沖液中經(jīng)1.0瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，跑出三條清晰可見(jiàn)的帶，分別為28s18s5srna，說(shuō)明所提總rna完整性良好，降解少。 rna稀釋100倍后用eppendorf紫外分光光度計(jì)測(cè)得的od值見(jiàn)表1，a260/a280的平均值在1.8-2.2之間，a260/a230也大于2.0, 說(shuō)明所提總rna沒(méi)有蛋白、多糖及酚類(lèi)等

10、的污染，具有高純度，達(dá)到試驗(yàn)要求（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表一）。按照此濃度計(jì)算出原管總rna濃度，約為2.087mg/ml。圖1.小麥根系總rna瓊脂糖電泳結(jié)果5s rrna18s rrna28s rrna 表1. 小麥根系總rna純度和含量的測(cè)定濃度mg/mla260/a280a260/a230a230a260a280a320樣品120.82.002.320.2240.5200.0270.000樣品220.62.012.350.2200.5160.0250.000樣品321.21.982.110.2510.5300.0250.001平均值20.872.002.260.2320.5220.0260.000

11、（二）pcr反應(yīng)體系的建立1. 引物濃度的選擇pcr擴(kuò)增中引物濃度必須適宜，引物濃度過(guò)高會(huì)引起引物與模板之間的錯(cuò)配率增高，即非特異性產(chǎn)物增多，且可增加形成引物二聚體的機(jī)率；反之，則pcr擴(kuò)增效率降低。但由于本實(shí)驗(yàn)所需要確定的參數(shù)過(guò)多，所以先將這一參數(shù)定為0.2m，即標(biāo)準(zhǔn)pcr體系引物濃度，以便確立其他參數(shù)。2. taq酶濃度的選擇 taq酶濃度對(duì)pcr產(chǎn)物的影響至關(guān)重要，在20l pcr反應(yīng)體系中，一般所需要的taq酶量為0.5-4u，根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短及其復(fù)雜程度（g+c含量）不同而不同，使用過(guò)高taq酶可引起非特異性產(chǎn)物的增多，甚至有時(shí)只出現(xiàn)亮的通帶而無(wú)任何擴(kuò)增產(chǎn)物帶。因此，要想達(dá)到理想的

12、pcr擴(kuò)增效果，須確定taq酶的最適濃度。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行25ml pcr反應(yīng)開(kāi)始采用 2.5u后又逐漸降低酶濃度，直至 0.75u時(shí)仍有清晰可辨的條帶，所以將酶濃度確定為0.75u。3. mg2+濃度的選擇 mg2+是taq酶的激活劑，mg2+的濃度直接影響pcr擴(kuò)增的特異性和效率。mg2+濃度過(guò)低時(shí)，酶活力顯著降低；過(guò)高時(shí)，則可能催化非特異性的擴(kuò)增。因此，每次當(dāng)首次使用靶序列和引物的一種新組合時(shí)，尤其要將mg2+濃度選至最佳。在一般的pcr反應(yīng)中，1.5-2.0 mmol/l是比較合適的。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)mg2+濃度分別為1.51.7 1.92.1 mmol/l四個(gè)對(duì)照，對(duì)tubulin和sul進(jìn)行

13、pcr擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖所示，835bp的片段即為sul的pcr產(chǎn)物，而579bp片段即為tubulin的pcr產(chǎn)物；1、2為mg2+濃度1.5mmol/l時(shí)的pcr產(chǎn)物，3、4為mg2+濃度1.7mmol/l時(shí)的pcr產(chǎn)物，5、6為mg2+濃度1.9mmol/l時(shí)的pcr產(chǎn)物，8、9為mg2+濃度2.1mmol/l時(shí)的pcr產(chǎn)物，7為dl2000的marker。當(dāng)mg2+濃度為1.7 mmol/l時(shí)，tubulin和sul擴(kuò)增所得條帶均清晰可見(jiàn)，所以我們認(rèn)為mg2+濃度為1.7 mmol/l是比較合適的。835bp579bp 9 8 7 6 5 4 3 2 12.1 mrker 1.9

14、1.7 1.5 （mmol/l） 圖2. pcr反應(yīng)體系中mg2+濃度的選擇4. 退火溫度的選擇 退火溫度是否合適是pcr擴(kuò)增成敗的關(guān)鍵。 退火溫度的高低是基于引物解鏈和模板長(zhǎng)度以及g+c含量來(lái)考慮的。退火溫度決定并影響著引物對(duì)模板dna特異性識(shí)別位點(diǎn)的能力。因此溫度盡可能高以提高擴(kuò)增的特異性，但溫度過(guò)高，較大的dna模板會(huì)導(dǎo)致更多對(duì)嘌呤和脫氨基敏感位點(diǎn)的出現(xiàn)，因此而導(dǎo)致pcr擴(kuò)增失效；退火溫度低，易出現(xiàn)擴(kuò)增的非特異性帶多且亂的情況。因此，本實(shí)驗(yàn)在參考引物tm值的前提下設(shè)一組對(duì)照以確定最佳的退火溫度。當(dāng)其他條件不變時(shí)，分別改變退火溫度為5355575961，同時(shí)擴(kuò)增tubulin和sul，結(jié)果

15、見(jiàn)圖3。當(dāng)退火溫度為59時(shí)，tubulin和sul擴(kuò)增所得條帶均清晰可見(jiàn)，所以定體系退火溫度為59。 500bp1000bp750bp835bp（sul片段）579bp(tubulin片段)750bp 53 55 57 59 61 （）圖3. pcr反應(yīng)體系中退火溫度的選擇（三）pcr半定量檢測(cè)體系的建立pcr反應(yīng)初始時(shí)產(chǎn)物呈指數(shù)積累，但經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)次數(shù)后由于dntpbuffer等反應(yīng)原料的消耗，pcr產(chǎn)物不再呈指數(shù)累積而進(jìn)入平臺(tái)期，因此pcr產(chǎn)物量與循環(huán)次數(shù)也呈一定的曲線關(guān)系。為了避免平臺(tái)效應(yīng)的影響，合適的循環(huán)次數(shù)是pcr半定量方法的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)選擇了兩種方式來(lái)確定pcr進(jìn)入平臺(tái)期前的

16、循環(huán)次數(shù)。首先，通過(guò)計(jì)算同一擴(kuò)增體系內(nèi)產(chǎn)物量隨著循環(huán)次數(shù)的增加而產(chǎn)生的變化情況，繪制動(dòng)態(tài)曲線，來(lái)確定pcr反應(yīng)隨著時(shí)間的變化其擴(kuò)增產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。我們將前面確定的標(biāo)準(zhǔn)體系做了7個(gè)重復(fù)，然后分別在反應(yīng)進(jìn)行到15、20、25、30、35、40、45個(gè)循環(huán)時(shí)取出，同時(shí)跑電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4。當(dāng)循環(huán)數(shù)少于20個(gè)時(shí)，pcr產(chǎn)物量很少；當(dāng)循環(huán)數(shù)大于35個(gè)時(shí)，條帶差異消失。經(jīng)過(guò)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)后，掃描分析各條帶的光密度值來(lái)表示各目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)量，統(tǒng)計(jì)多次掃描數(shù)值，以該統(tǒng)計(jì)值為縱坐標(biāo)，循環(huán)次數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，如圖5。我們可以看到，當(dāng)循環(huán)數(shù)大于35個(gè)時(shí)，曲線趨于平緩，而在25-30次內(nèi)，曲線為線性，為了確保

17、處于線性期內(nèi)我們選用了30作為循環(huán)參數(shù)。 15 marker 20 25 30 35 40 45（循環(huán)）539bp(tubulin片段) 圖4. pcr反應(yīng)體系中循環(huán)次數(shù)的選擇 圖5. pcr反應(yīng)體系中擴(kuò)增產(chǎn)物與循環(huán)次數(shù)的關(guān)系接下來(lái)，為了進(jìn)一步確定結(jié)果，我們?cè)?0循環(huán)數(shù)下擴(kuò)增一組模板濃度梯度的樣品，模板梯度是否能明顯呈現(xiàn)來(lái)表明該循環(huán)次數(shù)是否已進(jìn)入平臺(tái)期。我們分別取同一cdna模板0.3l0.4l0.5l0.6l0.7l，作為一個(gè)模板濃度梯度，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖6。539bp(tubulin片段) marker 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 (l模板)圖6.循環(huán)次數(shù)為30時(shí)模板梯

18、度的pcr產(chǎn)物由上圖可知，當(dāng)循環(huán)數(shù)為30時(shí)，可以清楚地看到不同模板濃度的產(chǎn)物之間的差別，故初步可確定，至少在30循環(huán)時(shí)，本標(biāo)準(zhǔn)體系并未進(jìn)入平臺(tái)期，所以利用本體系在進(jìn)行半定量檢測(cè)樣品時(shí)，選擇30循環(huán)是合適的。最終確立的25ul pcr反應(yīng)體系為（表2）：表2 25ul pcr反應(yīng)體系dntp 0.1mm 10buffer 2.5ul taq 0.75u mg2+ 1.7mm p1 0.2um p2 0.2um cdna 0.5ul h2o 18.15ul最終確立的反應(yīng)程序?yàn)椋?94 2min 94 1min 59 1min 30cycles72 2min 72 10min 4 forever（四

19、）pcr產(chǎn)物的鑒定 pcr擴(kuò)增產(chǎn)物在0.5tbe緩沖液中用1.0瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，分別跑出大約839bp和579bp的條帶，與目的基因大小一致，經(jīng)回收純化后進(jìn)行測(cè)序，其序列與tae512817的序列進(jìn)行比對(duì)，只有少數(shù)堿基對(duì)存在差異，相似性達(dá)到97%以上。（結(jié)果見(jiàn)附錄一）證明所擴(kuò)增的產(chǎn)物為目的基因片段。 三、討論 1、mrna的測(cè)定是分子生物學(xué)研究中一個(gè)常用的方法，傳統(tǒng)的主要利用斑點(diǎn)雜交、northern blot等技術(shù)來(lái)完成。但是由于mrna含量少，且在轉(zhuǎn)膜等操作過(guò)程中極易降解，加上本實(shí)驗(yàn)室rna的操作環(huán)境不是很好，都使得應(yīng)用這些技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的可靠性降低。所以我們選擇了近年來(lái)發(fā)

20、展的含內(nèi)標(biāo)化的rt-pcr半定量檢測(cè)mrna的方法來(lái)完成該實(shí)驗(yàn)。含內(nèi)標(biāo)化的rt-pcr半定量檢測(cè)簡(jiǎn)便、快速并能半定量因此比較適合本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)利用tubulin為內(nèi)參基因，用sul/tubulin的比值來(lái)確定在總rna中sul基因表達(dá)的相對(duì)含量。作為內(nèi)參照的tubulin是一種維管束蛋白，其基因?qū)俦Ｊ匦詮?qiáng)的“管家基因”，tubulin mrna具有普遍而恒定表達(dá)的特性，設(shè)立內(nèi)參照可減少因加樣不準(zhǔn)或rna定量時(shí)產(chǎn)生的誤差。2、pcr擴(kuò)增反應(yīng)是酶促反應(yīng)遵循酶促反應(yīng)定律，開(kāi)始的循環(huán)內(nèi)樣本dna呈指數(shù)累積，但經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)后，dna不再呈指數(shù)累積而進(jìn)入平臺(tái)期、為了避免平臺(tái)效應(yīng)的影響，合適的循環(huán)數(shù)

21、是pcr半定量方法的關(guān)鍵因素。3、本實(shí)驗(yàn)所用的每對(duì)引物所擴(kuò)增的序列均至少跨越了兩個(gè)內(nèi)含子，所以直接根據(jù)pcr產(chǎn)物的大小即可看出有無(wú)基因組dna的污染。所以本實(shí)驗(yàn)除了為進(jìn)一步半定量檢測(cè)特定基因mrna含量建立了良好體系以外，同時(shí)建立起來(lái)的穩(wěn)定擴(kuò)增小麥tubulin基因cdna片段的pcr體系，也為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)小麥mrna反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成功與否提供了依據(jù)，并且該體系已經(jīng)應(yīng)用到了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)小麥mrna反轉(zhuǎn)錄體系的實(shí)踐中。4、本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用trizol試劑盒來(lái)作為提取小麥根系總rna的方法，得到了非常好的結(jié)果，與實(shí)驗(yàn)室其他方法相比，用trizol提取的小麥根組織總rna具有相對(duì)良好的完整性和純度，且方法相對(duì)簡(jiǎn)單

22、快速。5、將mrna反轉(zhuǎn)錄成cdna是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟，在反轉(zhuǎn)錄時(shí)可選用的引物有3種，即pcr引物中的反向引物、隨機(jī)引物和oligo(dt)。本實(shí)驗(yàn)采用oligo(dt)，同時(shí)擴(kuò)增tubulin與目的基因，使反轉(zhuǎn)錄更具高效性。6、我們的體系建立，基本克服了pcr的高度靈敏性及凝膠成像系統(tǒng)光密度掃描的不準(zhǔn)確性對(duì)半定量造成的影響，但為了進(jìn)一步保證我們半定量結(jié)果的正確性，我們還將同時(shí)進(jìn)行樣本rna的northern雜交，將二者的綜合結(jié)果作為我們最終定量的結(jié)果。參考文獻(xiàn)1 c. w迪芬巴赫，g.s德維克斯勒，主編(盧柏松、趙東，譯) pcr技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南北京：科學(xué)出版社，第2版199810152 j.薩

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28、s. in sulphur metabolism in higher plants (ed. cram wj, de kok, l j, stulen, i, brunold, c, and rennenberg, h.) backhuys publishers, leiden, the netherlands pp 13-25. 15 takahashi, n. sasakura, m. noji, k. saito, isolation and characterization of a cdna encoding a sulfate transporter from arabidopsi

29、s thaliana febs lett.392 (1996) 9599.16 h. takahashi, m. yamazaki, n. sasakura, a. watanabe, t. leustek, j. de almeida engler, g. engler, m. van montagu, k. saito, regulation of sulfur assimilation in higher plants: a sulfate transporter induced in sulfate-starved roots plays a central role in arabi

30、dopsis thaliana. proc. natl. acad. sci. usa 94 (1997) 1110211107.附錄一：測(cè)序結(jié)果與產(chǎn)物序列的比對(duì)結(jié)果product (138) acttggcgaaaggattcagaattggtgtagtagctggaatggttgccctt seq1 (1) acttgncgaaagnattcagaattgntgtagtagctggaatggttgccctt seq2 (105) acttggcgaaaggattcagaattggtgtagtagctggaatggttgcccttconsensus (138) acttggcgaaaggat

31、tcagaattggtgtagtagctggaatggttgccctt 188 237 product (188) acggtaagcaatcgcaattggaagaacatttgctgccatgaaggactacc seq1 (51) acgg-aagcaatcgcaattggaagaccatttgctgccatgaaggactacc seq2 (155) acgg-aagcaatcgcaattggaagaacatttgctgccatgaaggactaccconsensus (188) acgg aagcaatcgcaattggaagaacatttgctgccatgaaggactacc 23

32、8 287 product (238) aaatagatgggaacaaagaaatggtagctctaggaaccatgaacattgtt seq1 (100) aaatagatgggaacaaagaaatggtagctctaggaaccatgaacattgtt seq2 (204) aaatagatgggaacaaagaaatggtagctctaggaaccatgaacattgttconsensus (238) aaatagatgggaacaaagaaatggtagctctaggaaccatgaacattgtt 288 337 product (288) ggctcaatgacttcatg

33、ctacgtggccacaggggttctttctcgcgatca seq1 (150) ggctcaatgacttcatgctacgtggccacagg-ttctttctcgcgatca seq2 (254) ggctcaatgacttcatgctacgtggccacagg-ttctttctcgcgatcaconsensus (288) ggctcaatgacttcatgctacgtggccacagg ttctttctcgcgatca 338 387 product (338) gcagtaaattacatggctggctgcaaaacagcagtatccaatgttgttat seq1 (

34、198) gcagtaaattacatggctggctgcaaaacagcagtatccaatgttgttat seq2 (302) gcagtaaattacatggctggctgcaaaacagcagtatccaatgttgttatconsensus (338) gcagtaaattacatggctggctgcaaaacagcagtatccaatgttgttat 388 437 product (388) ggcaattgtagtgatgctcacactgttgttgatcactccattgttcaagt seq1 (248) ggcaattgtagtgatgctcacactgttgttga

35、tcactccattgttcaagt seq2 (352) ggcaattgtagtgatgctcacactgttgttgatcactccattgttcaagtconsensus (388) ggcaattgtagtgatgctcacactgttgttgatcactccattgttcaagt 438 487 product (438) acacgcccaatgccattctagcttccatcatcataaatgcagtggttagc seq1 (298) acacgcccaatgccattctagcttccatcatcataaatgcagtggttagc seq2 (402) acacgcc

36、caatgccattctagcttccatcatcataaatgcagtggttagcconsensus (438) acacgcccaatgccattctagcttccatcatcataaatgcagtggttagc 488 537 product (488) ctagttgactatgagacggcgtaccttatctggaaggttgataaaatgga seq1 (348) ctagttgactatgagacggcgtaccttatctggaaggttgataaaatgga seq2 (452) ctagttgactatgagacggcgtaccttatctggaaggttgataaaa