目的基因克隆基因工程原理與技術(shù)劉志國(guó)

1、本節(jié)要點(diǎn)本節(jié)要點(diǎn) RT-PCR法法 v RT-PCR的步驟的步驟 v 三種不同引物引導(dǎo)的三種不同引物引導(dǎo)的RT-PCR v 已知基因已知基因N端部分序列端部分序列RT-PCR 其它其它PCRPCR法法 v 反向反向PCRPCR v 錨定錨定PCR PCR v 連接介導(dǎo)的連接介導(dǎo)的PCRPCR v 盒式盒式PCRPCR v RACE RACE 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 一、RT-PCR法 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 1.RT-PCR的步驟驟 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄 PCR擴(kuò)擴(kuò)增 獲得獲得RNA模板模板 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄 ：將：將RNA反

2、轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn) 錄成錄成cDNA第一鏈第一鏈 常用常用RNA模板模板 常采用常采用異硫氰酸胍異硫氰酸胍-酚酚-氯仿氯仿一一 步抽提法步抽提法 提取的總提取的總RNA中只有少部分是中只有少部分是 mRNA，大部分為，大部分為rRNA和和 tRNA 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 TRIzolTRIzol是一種新型總是一種新型總RNARNA抽抽 提試劑，含有苯酚、異硫氰提試劑，含有苯酚、異硫氰 酸胍等物質(zhì)酸胍等物質(zhì). . 細(xì)胞總細(xì)胞總RNA 采用親和層析法采用親和層析法 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 oligo(dT)oligo(dT)纖維

3、纖維 素柱分離素柱分離純純化化真真 核核mRNA mRNA mRN A 基因特異引物（基因特異引物（gene specific primer，GSP） 多聚寡核苷酸引物（多聚寡核苷酸引物（oligo (dT) primer） 隨機(jī)六核苷酸引物（隨機(jī)六核苷酸引物（random hexamer primer） 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 三三種種引物引物擴(kuò)擴(kuò)增特增特異異性性 高高 低低 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄 將將RNA反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一第一 鏈鏈 反轉(zhuǎn)錄的引物反轉(zhuǎn)錄的引物 ：三種：三種 以合成的以合成的cDNA單鏈為模板單鏈為模板，采用，采用基因特異引物基因特

4、異引物 進(jìn)行常規(guī)進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 過(guò)程：過(guò)程： 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 上游引物與上游引物與cDNA第一鏈退火，在第一鏈退火，在DNA 聚合酶的作用下合成聚合酶的作用下合成cDNA第二鏈第二鏈 以以cDNA第一鏈和第二鏈為模板第一鏈和第二鏈為模板 ，用上、下游引物進(jìn)行，用上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 2. 三種不同引物引導(dǎo)的三種不同引物引導(dǎo)的RT-PCR 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 RNARNA 提取提取 反反 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 PCRP

5、CR 過(guò)過(guò)程程 3. 已知基因已知基因N端部分序列端部分序列RT-PCR 目的基因的目的基因的DNA序列未知，但其編碼蛋白的序列未知，但其編碼蛋白的N端部端部 分氨基酸序列已知分氨基酸序列已知 根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)的根據(jù)氨基酸序列設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物和簡(jiǎn)并引物和oligo（dT）進(jìn)進(jìn) 行行RT-PCR 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 簡(jiǎn)并引物簡(jiǎn)并引物 根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性 設(shè)計(jì)的針對(duì)編碼每個(gè)設(shè)計(jì)的針對(duì)編碼每個(gè) 氨基酸的所有堿基組氨基酸的所有堿基組 合的混合物合的混合物 擴(kuò)增對(duì)象擴(kuò)增對(duì)象 擴(kuò)增方法擴(kuò)增方法 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法

6、獲得目的基因 已知基已知基 因因N N端端 部分序部分序 列列RT-PRT-P CRCR示意示意 圖圖 獲得的目的基因的獲得的目的基因的DNA片段不完整，片段不完整，僅知僅知 道基因上一小段序列信息時(shí)道基因上一小段序列信息時(shí) 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 二、其他PCR法 反向反向PCR 錨定錨定PCR 連接介導(dǎo)的連接介導(dǎo)的PCR 盒式盒式PCR RACE 適用對(duì)象適用對(duì)象 方法方法 用于擴(kuò)增已知目的基因序列側(cè)翼的用于擴(kuò)增已知目的基因序列側(cè)翼的DNA片段片段 1. 反向反向PCR 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 擴(kuò)增對(duì)象擴(kuò)增對(duì)象

7、 操作過(guò)程操作過(guò)程 酶切酶切 連接環(huán)化連接環(huán)化 PCR PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 測(cè)序分析測(cè)序分析 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 反向反向PCRPCR原原 理示意圖理示意圖 RS:限制性內(nèi)內(nèi)切酶酶切位點(diǎn) GSP:基因特異異引物 1. 錨定PCR 根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)的基因特異異引物 2. 錨定錨定PCR 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 擴(kuò)增對(duì)象擴(kuò)增對(duì)象 也稱之為也稱之為單側(cè)特異引物單側(cè)特異引物PCR（SSP-PCR），）， 是根據(jù)已知目的基因的一小段序列信息來(lái)快速是根據(jù)已知目的基因的一小段序列信息來(lái)快速 擴(kuò)增已知序列上游或下游片段的技術(shù)擴(kuò)

8、增已知序列上游或下游片段的技術(shù) 引物引物 引物1 引物2 即即錨定引物錨定引物，根據(jù)序列的共同特征設(shè)計(jì)的，根據(jù)序列的共同特征設(shè)計(jì)的非特非特 異性引物異性引物，非特異性引物所起的作用是在其中，非特異性引物所起的作用是在其中 一端附著。一端附著。與錨定引物結(jié)合的序列稱為錨定序與錨定引物結(jié)合的序列稱為錨定序 列。列。 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 方法方法 擴(kuò)增目的基因已知序擴(kuò)增目的基因已知序 列列下游下游3端未知序列端未知序列 oligo（dT）作為錨為錨 定引物 擴(kuò)增目的基因已知序擴(kuò)增目的基因已知序 列列上游上游5端未知序列端未知序列 用用DNA末端轉(zhuǎn)移酶，末端

9、轉(zhuǎn)移酶， 在在cDNA 3 末端末端加上加上 Poly（dA）尾尾 與此與此Poly（dA）相）相 對(duì)應(yīng)的對(duì)應(yīng)的Poly（dT）作作 為錨定引物為錨定引物 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 PCR具體過(guò)程具體過(guò)程 包括兩輪包括兩輪PCR擴(kuò)擴(kuò) 增增 第一輪：采用第一輪：采用不對(duì)稱不對(duì)稱PCR 高濃度的基因特異引物和低濃度的非特高濃度的基因特異引物和低濃度的非特 異性引物異性引物 第二輪：以稀釋后的第二輪：以稀釋后的第一輪第一輪PCR產(chǎn)物作產(chǎn)物作 為模板為模板 相同濃度的基因特異引物和非特異性引相同濃度的基因特異引物和非特異性引 物進(jìn)行擴(kuò)增物進(jìn)行擴(kuò)增 第一節(jié)第一節(jié) P

10、CRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 錨定錨定PCRPCR原理示意圖原理示意圖 在普通在普通PCR過(guò)程中增加了連接的步驟，即通過(guò)連過(guò)程中增加了連接的步驟，即通過(guò)連 接反應(yīng)加上去一個(gè)公共接頭接反應(yīng)加上去一個(gè)公共接頭 3.連接介導(dǎo)的連接介導(dǎo)的PCR 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 只知道只知道DNA一端的序列又要對(duì)未知的一端進(jìn)行測(cè)序一端的序列又要對(duì)未知的一端進(jìn)行測(cè)序 對(duì)體內(nèi)甲基化圖譜或?qū)w內(nèi)甲基化圖譜或DNA印跡進(jìn)行分析印跡進(jìn)行分析 方法方法 引物引物 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 通過(guò)目的基因的已知序列

11、設(shè)通過(guò)目的基因的已知序列設(shè) 計(jì)的計(jì)的基因特異引物基因特異引物 引物1 引物2接頭引物接頭引物 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 連接介連接介 導(dǎo)的導(dǎo)的PCPC R R原理示原理示 意圖意圖 4. 盒式盒式PCR 方法方法 在普通在普通PCR過(guò)程中加入了一個(gè)過(guò)程中加入了一個(gè) Cassette（盒）（盒） 人工合成的帶有限制人工合成的帶有限制 性內(nèi)切酶的粘性末端性內(nèi)切酶的粘性末端 的雙鏈的雙鏈DNA分子分子 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 Cassette在設(shè)計(jì)時(shí)其在設(shè)計(jì)時(shí)其5末端沒(méi)有磷酸基團(tuán)末端沒(méi)有磷酸基團(tuán) 目的目的DNA片段的片段的

12、3末端和末端和Cassette的的5末端的末端的 連接部位形成缺口連接部位形成缺口 在第一次在第一次PCR的第一個(gè)循環(huán)，從的第一個(gè)循環(huán)，從Cassette引物引物 CP1開(kāi)始的延伸反應(yīng)在連接部位終止，開(kāi)始的延伸反應(yīng)在連接部位終止，限制了限制了 引物引物 CP1和引物和引物 CP1同一引物之間的擴(kuò)增同一引物之間的擴(kuò)增，減，減 少了非特異性少了非特異性PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 特點(diǎn)特點(diǎn) 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 盒式盒式P P CRCR原原 理示理示 意圖意圖 CP:CassetteCP:Cassette引

13、物引物 GSP:GSP:基因特異引物基因特異引物 （正義引物）（正義引物） AGSP:AGSP:基因特異引物基因特異引物 （反義引物）（反義引物） 5端之間的未知序列端之間的未知序列 5RACE 5. RACE rapid-amplification of cDNA ends 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)進(jìn)行技術(shù)進(jìn)行cDNA末端快速擴(kuò)增末端快速擴(kuò)增， 得到基因轉(zhuǎn)錄本的未知序列，從而獲得得到基因轉(zhuǎn)錄本的未知序列，從而獲得mRNA完完 整序列的方法整序列的方法 過(guò)程和分類過(guò)程和分類 以以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成為模板反轉(zhuǎn)錄成cDN

14、A第一第一 鏈鏈 用用PCR擴(kuò)增出擴(kuò)增出 cDNA內(nèi)某一已知內(nèi)某一已知 序列位點(diǎn)到其序列位點(diǎn)到其 3端之間間的未知序列 3RACE 錨定錨定PCR被用于被用于RACE技術(shù)，根據(jù)錨定序列引入技術(shù)，根據(jù)錨定序列引入 方式的不同，方式的不同，RACE分為分為經(jīng)典經(jīng)典RACE和和新新RACE 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 經(jīng)典經(jīng)典RACE ：以錨定序列作為引物，以錨定序列作為引物，3RACE 中在反轉(zhuǎn)錄時(shí)引入第一鏈中在反轉(zhuǎn)錄時(shí)引入第一鏈cDNA，5RACE中中 在合成第二鏈時(shí)引入第二鏈在合成第二鏈時(shí)引入第二鏈cDNA 新新RACE ：錨定序列在反轉(zhuǎn)錄以前以寡聚核錨定序

15、列在反轉(zhuǎn)錄以前以寡聚核 苷酸苷酸RNA的形式連入的形式連入mRNA中中 經(jīng)典經(jīng)典3RACE操作步驟操作步驟 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 以以mRNA為模板，用為模板，用反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄引物合成合成3端端cDNA第第 一鏈，在一鏈，在5端引入了端引入了OP和和IP序列序列 以基因特異引物以基因特異引物GSP1和外側(cè)引物和外側(cè)引物OP進(jìn)行第一輪進(jìn)行第一輪 PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 以第一輪以第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以基因特異擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以基因特異 引物引物GSP2和內(nèi)側(cè)引物和內(nèi)側(cè)引物IP進(jìn)行第二輪進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 PCR產(chǎn)產(chǎn)物進(jìn)進(jìn)行直接測(cè)測(cè)序或克隆于適

16、當(dāng)載當(dāng)載體進(jìn)進(jìn)行 序列分析 即即錨定引物錨定引物TTT(T)n-TTT(T)n- IP-OPIP-OP，含含oligooligo（dTdT） 序列序列 、外側(cè)引物區(qū)、外側(cè)引物區(qū)O O P P和內(nèi)側(cè)引物區(qū)和內(nèi)側(cè)引物區(qū)IPIP 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 經(jīng)典經(jīng)典3RA CE 原理示原理示 意圖意圖 TTT(T)n-IP-OP:TTT(T)n-IP-OP:錨定引物錨定引物 IP:IP:內(nèi)側(cè)引物區(qū)內(nèi)側(cè)引物區(qū) OP:OP:外側(cè)引物區(qū)外側(cè)引物區(qū) GSP:GSP:基因特異引物基因特異引物 經(jīng)典經(jīng)典5RACE操作步驟操作步驟 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)

17、增法獲得目的基因 以基因特異引物以基因特異引物GSP1作為反轉(zhuǎn)錄引物產(chǎn)生作為反轉(zhuǎn)錄引物產(chǎn)生cDNA 第一鏈第一鏈 在脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在在脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在cDNA 3 末端加上末端加上Poly（dC）（或（或Poly（dA）尾尾 利用錨定引物（利用錨定引物（5OP-IP-oligo（dG）（或）（或 5OP-IP-oligo（dT ）和基因特異引物和基因特異引物GSP1 進(jìn)行第一輪進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 以第一輪以第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，以基因特異反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，以基因特異 引物引物GSP2和內(nèi)側(cè)引物和內(nèi)側(cè)引物IP進(jìn)行第二輪進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 第一節(jié)

18、第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 經(jīng)典經(jīng)典5RACE 原理示意圖原理示意圖 新型新型5RACE操作步驟操作步驟 CIAP處理總處理總RNA,使使rRNA、 tRNA或或5端不完整端不完整 無(wú)帽的無(wú)帽的mRNA去磷酸化脫掉去磷酸化脫掉5磷酸基團(tuán)磷酸基團(tuán) TAP處理全長(zhǎng)的處理全長(zhǎng)的mRNA，去掉其帽子結(jié)構(gòu)，保留，去掉其帽子結(jié)構(gòu)，保留 5端的一個(gè)磷酸基團(tuán)端的一個(gè)磷酸基團(tuán) 設(shè)計(jì)錨定序列，具設(shè)計(jì)錨定序列，具OP和和IP區(qū)，用區(qū)，用T4 RNA連接連接 酶，將具有錨定序列的一段短酶，將具有錨定序列的一段短RNA寡核苷酸寡核苷酸 與去掉帽子結(jié)構(gòu)的與去掉帽子結(jié)構(gòu)的mRNA進(jìn)行連接進(jìn)行連

19、接 設(shè)計(jì)兩條引物設(shè)計(jì)兩條引物GSP1和和GSP2，GSP1在在GSP2 的外側(cè)，以第三步中形成的雜合體為模板，的外側(cè)，以第三步中形成的雜合體為模板， 利用引物利用引物GSP1為反轉(zhuǎn)錄引物合成為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA第一第一 鏈鏈 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 用用GSP1和和OP，GSP2和和IP進(jìn)行巢式進(jìn)行巢式PCR 第一節(jié)第一節(jié) PCRPCR擴(kuò)增法獲得目的基因擴(kuò)增法獲得目的基因 新型新型5RACE 原理示意圖原理示意圖 CIAP:CIAP:牛小腸堿性磷酸酶牛小腸堿性磷酸酶 TAP:TAP:煙草酸性焦磷酸酶煙草酸性焦磷酸酶 OP:OP:外側(cè)引物區(qū)外側(cè)引物區(qū)

20、IP:IP:內(nèi)測(cè)引物區(qū)內(nèi)測(cè)引物區(qū) GSP:GSP:基因特異引物基因特異引物 第二節(jié) 基因的合成 隨著技術(shù)的發(fā)展，用化學(xué)的方法人工合成基因成為可能， 人工合成的基因可以是生物體內(nèi)已經(jīng)存在的，也可以是按照人 們的愿望和特殊需要重新設(shè)計(jì)的。 1970年，美國(guó)麻省理工學(xué)院Khorana 等人首次報(bào)道了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖 核酸的全人工合成基因 H.G.Khorana（1922-） 一、DNA人工合成的原理 利用人為操縱的化學(xué)反應(yīng)，使核苷酸間形成正確聯(lián)接 發(fā)展歷史：H-亞磷酸酯磷酸二酯法磷酸三酯法 亞磷酸三酯法 固相亞磷酸三酯法：目前最通用的一種合成寡核苷酸的 方法，是在偶聯(lián)于固相支持物上的連接臂末端通過(guò)

21、逐個(gè) 加上核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其一個(gè)合成循環(huán)周期分為四個(gè)步 驟 去保護(hù)(deprotection) 、偶聯(lián)（coupling）、封端 （capping）、氧化（oxidation） 二、人工合成基因 基因的人工合成是在寡核苷酸化學(xué)合成的基礎(chǔ)上建立的， 通常的策略是將需要合成的基因分成若干個(gè)相互重疊的片段， 先利用化學(xué)合成法分別合成這些小片段，然后讓這些片段退火 配對(duì)，最后利用連接酶和聚合酶將這些片段連接成完整的基因 序列。 DNA小片段全長(zhǎng)基因 1、退火-連接法 2、多步退火-延伸-連接法 3、由內(nèi)向外多步退火-延伸合成法 基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)構(gòu)建 概述 定義：某種生物基因組的全部遺傳信息通過(guò)

22、克隆載體 儲(chǔ)存于某一受體菌的群體中，這個(gè)群體就稱為該生物 基因組的文庫(kù)(genomic library) 目的： a）分離有用的目的基因（可培養(yǎng)細(xì)菌未可 培養(yǎng)細(xì)菌） b）保存某種生物的全部基因（可培養(yǎng)細(xì)菌） 一般流程 一般流程 高分子量環(huán)境樣品DNA的準(zhǔn)備 PFGE分離大片斷DNA分子 脈沖場(chǎng)凝膠電泳DNA分子在凝膠中的運(yùn)動(dòng) 載體的選擇和制備 載體選擇 BAC （Bacteial artificial chromosome）vector 細(xì)菌人工染色體載體結(jié)構(gòu) BAC 載體特點(diǎn) 對(duì)插入大片斷的外源DNA（300 kb）能夠復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)、 穩(wěn)定 通過(guò)電激發(fā)轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率較高 已超螺旋狀態(tài)存在，分

23、離抽提比YAC容易 克隆中幾乎不存在嵌合體(Chimrism) 連接 克隆片段的大小與構(gòu)建文庫(kù)克隆子的關(guān)系克隆片段的大小與構(gòu)建文庫(kù)克隆子的關(guān)系 （）（） 文庫(kù)實(shí)際克隆數(shù)（N） （）（） 其中p為期望的可能性，f 為片段平均長(zhǎng)度與基因組 總長(zhǎng)的比值 大片段大片段DNA 是否能有效連接在載體上主要取決于插入是否能有效連接在載體上主要取決于插入 DNA 片段與載體的比例片段與載體的比例, 對(duì)于不同生物采用的比例不同對(duì)于不同生物采用的比例不同, 大多數(shù)大多數(shù)BAC 文庫(kù)采用文庫(kù)采用1 5 - 15 (摩爾比摩爾比) 目標(biāo)DNA和載體濃度的確定 轉(zhuǎn)化 制備用于電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞 電激轉(zhuǎn)化 對(duì)于轉(zhuǎn)

24、化大腸桿菌而言, 電轉(zhuǎn)化是目前使用最普 通的一種手段。電轉(zhuǎn)化效率與插入片段的大小 有關(guān),插入片段越大, 轉(zhuǎn)化效率越低; 反之, 越高 。此外, 轉(zhuǎn)化條件（如溫度0-4度）也直接影響 轉(zhuǎn)化效率、插入片段大小及假陽(yáng)性克隆的含量 。 陽(yáng)性克隆的挑選陽(yáng)性克隆的挑選 可通過(guò)可通過(guò)lacZ 的的- 互補(bǔ)所形成的藍(lán)白菌落篩選互補(bǔ)所形成的藍(lán)白菌落篩選 陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆。 BAC 文庫(kù)的鑒定 評(píng)價(jià)一個(gè)BAC 文庫(kù)質(zhì)量高低的標(biāo)準(zhǔn)： 假陽(yáng)性克隆的含量 文庫(kù)中克隆的數(shù)量 插入片段大小 細(xì)胞器DNA 的含量 BAC 文庫(kù)的鑒定文庫(kù)的鑒定 從文庫(kù)中隨機(jī)挑選一定量的BAC 克隆, 提取質(zhì)粒 DNA , 酶切后, 脈沖電泳

25、檢查插入片段的大小 以Southern 雜交來(lái)檢驗(yàn)BAC 克隆插入片段是否 來(lái)源于原材料。檢驗(yàn)假陽(yáng)性克隆, 保證庫(kù)的質(zhì)量 BAC 文庫(kù)的快速篩選文庫(kù)的快速篩選 高密度膜雜交篩選 Southern 雜交篩選 PCR篩選 基因組文庫(kù)在環(huán)境微生物分子生態(tài)中的應(yīng)用與意義基因組文庫(kù)在環(huán)境微生物分子生態(tài)中的應(yīng)用與意義 環(huán)境樣品的基因組文庫(kù)能夠代表自然微生物群體中的主要基因信息環(huán)境樣品的基因組文庫(kù)能夠代表自然微生物群體中的主要基因信息 為原位染色體雜交技術(shù)鑒定不可培養(yǎng)細(xì)菌提供可靠的信息為原位染色體雜交技術(shù)鑒定不可培養(yǎng)細(xì)菌提供可靠的信息 增加了對(duì)不可培養(yǎng)微生物生理、生化和關(guān)鍵代謝機(jī)理的了解增加了對(duì)不可培養(yǎng)微生

26、物生理、生化和關(guān)鍵代謝機(jī)理的了解 通過(guò)基因芯片去探測(cè)不可培養(yǎng)微生物的分布、基因表達(dá)和對(duì)環(huán)境的響應(yīng)通過(guò)基因芯片去探測(cè)不可培養(yǎng)微生物的分布、基因表達(dá)和對(duì)環(huán)境的響應(yīng) 海洋環(huán)境BAC文庫(kù)發(fā)現(xiàn)了海洋 變形細(xì)菌視紫紅質(zhì)的結(jié)構(gòu)模型 Trizol試劑試劑 原理：原理： 優(yōu)點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便、容易操作優(yōu)點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便、容易操作 氯仿抽提、離心分離水相和有機(jī)相氯仿抽提、離心分離水相和有機(jī)相 RNA抽提專用試劑，由異硫抽提專用試劑，由異硫 氰酸胍和苯酚組成，可以迅速氰酸胍和苯酚組成，可以迅速 破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放出細(xì)胞質(zhì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放出細(xì)胞質(zhì) 和細(xì)胞核中的和細(xì)胞核中的RNA 收集水相加入異丙醇，沉淀即為收集水相加入異

27、丙醇，沉淀即為RNA 下一步下一步mRNA的純化的純化 紫外分光光度法：紫外分光光度法：OD260=1時(shí)，時(shí)， 相當(dāng)于相當(dāng)于RNA的濃度為的濃度為40g/ml； OD260/OD280 電泳法：電泳法：28S和和18S亮度接近亮度接近2： 1，mRNA分布均勻，則認(rèn)為分布均勻，則認(rèn)為RNA 質(zhì)量較好。質(zhì)量較好。 cDNA第一鏈的合成：第一鏈的合成：mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶的在反轉(zhuǎn)錄酶的 催化作用下得到催化作用下得到cDNA； 常用的反轉(zhuǎn)錄酶：常用的反轉(zhuǎn)錄酶：AMV、MLV ； 常用引物：常用引物：oligo（dT）、六核苷酸的隨機(jī)）、六核苷酸的隨機(jī) 引物引物(dN)6、已知序列引物；、已知序列引物；

28、 Clack-Carbor公式：公式： N=ln（1-p）/ln（1-1/n） 差異克隆技術(shù)差異克隆技術(shù) 基因表達(dá)的變化是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程的核心機(jī)制，基因表達(dá)的變化是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程的核心機(jī)制， 高等生物含有數(shù)萬(wàn)個(gè)不同的基因，但在生物體發(fā)育的某高等生物含有數(shù)萬(wàn)個(gè)不同的基因，但在生物體發(fā)育的某 一階段只有約一階段只有約10-15%的基因按時(shí)空順序有序地進(jìn)行表的基因按時(shí)空順序有序地進(jìn)行表 達(dá)，這種表達(dá)方式即為基因的差別表達(dá)（達(dá)，這種表達(dá)方式即為基因的差別表達(dá)（differential expression）。）。 研究同一類細(xì)胞在不同生理狀態(tài)下或在不同生長(zhǎng)發(fā)育階研究同一類細(xì)胞在不同生理狀態(tài)

29、下或在不同生長(zhǎng)發(fā)育階 段基因表達(dá)的差異的方法很多，有代表性的技術(shù)主要有段基因表達(dá)的差異的方法很多，有代表性的技術(shù)主要有 mRNA差異顯示技術(shù)（差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）和抑制性差減雜交）和抑制性差減雜交 （Suppression Subtractive Hybridization，SSH） 技術(shù)。技術(shù)。 DDRT-PCR技術(shù)技術(shù) DDRT-PCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理 以一對(duì)細(xì)胞（或組織）的總以一對(duì)細(xì)胞（或組織）的總RNA反轉(zhuǎn)錄而成的反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為為 模板，利用模板，利用PCR的高效擴(kuò)增，通過(guò)的高效擴(kuò)增，通過(guò)5端與端與3端引物的合理端引物的合理 設(shè)計(jì)和組合，將細(xì)胞（或組織）

30、中表達(dá)的約設(shè)計(jì)和組合，將細(xì)胞（或組織）中表達(dá)的約15 000種基因種基因 片段直接顯示在片段直接顯示在DNA測(cè)序膠上，從而找出一對(duì)細(xì)胞（或組測(cè)序膠上，從而找出一對(duì)細(xì)胞（或組 織）中表達(dá)有差異的織）中表達(dá)有差異的cDNA片段。對(duì)獲得表達(dá)差異的基因片段。對(duì)獲得表達(dá)差異的基因 片段進(jìn)行回收、克隆、鑒定及分析。片段進(jìn)行回收、克隆、鑒定及分析。 DDRT-PCR技術(shù)基本流程技術(shù)基本流程 3 5 N M A A A A A A A A A AA AAA N M T T T T T T T T T T 3 5 N M A A A A A A A A A AA AAA N M T T T T T T T T

31、T T 逆轉(zhuǎn)錄酶 53 錨定引物 PCR 35N M T T T T T T T T T T cDNA第一鏈 隨機(jī)引物 差異表達(dá)的條帶 豐度不同的條帶 A細(xì)胞B細(xì)胞 序列膠電泳 圖9-2 DDRT-PCR反應(yīng)基本程序 DDRT-PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 簡(jiǎn)單，技術(shù)上僅僅依靠簡(jiǎn)單，技術(shù)上僅僅依靠PCR和和DNA測(cè)序膠電泳；測(cè)序膠電泳； 所得到的差別條帶往往不只一條，通常包含某一基因的上游及下游所得到的差別條帶往往不只一條，通常包含某一基因的上游及下游 的調(diào)控基因；的調(diào)控基因； 靈敏性高，僅需靈敏性高，僅需0.2g總總RNA作為起始材料，可檢出低豐度作為起始材料，可檢出低豐度mRNA； 實(shí)驗(yàn)周期

32、短，約實(shí)驗(yàn)周期短，約8d即可完成，便于重復(fù)，而且可重復(fù)性好；即可完成，便于重復(fù)，而且可重復(fù)性好； 最突出的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可步步驗(yàn)證比較；最突出的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可步步驗(yàn)證比較； 可進(jìn)行多基因家族的表達(dá)分析，可以同時(shí)分析多組樣品。可進(jìn)行多基因家族的表達(dá)分析，可以同時(shí)分析多組樣品。 DDRT-PCR技術(shù)的不足技術(shù)的不足 假陽(yáng)性率高，假陽(yáng)性的比例有時(shí)高達(dá)假陽(yáng)性率高，假陽(yáng)性的比例有時(shí)高達(dá)5075； 研究表明，差顯技術(shù)對(duì)高豐度研究表明，差顯技術(shù)對(duì)高豐度mRNA具有明顯的傾向性；具有明顯的傾向性； 由于某些序列的特異性，一些差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄不能得到分離，所以凝由于某些序列的特異性，一些差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄不能得

33、到分離，所以凝 膠中的單條帶可能由膠中的單條帶可能由1種以上種以上cDNA片段所構(gòu)成；片段所構(gòu)成； 差異顯示所得的差異顯示所得的cDNA片段較短，長(zhǎng)度多在片段較短，長(zhǎng)度多在100 bp500 bp之間，且之間，且 大多位于大多位于mRNA 3端約端約300 bp的非翻譯區(qū)（的非翻譯區(qū)（3UTR），很少能擴(kuò)增到），很少能擴(kuò)增到 ORF（open reading frame）區(qū)和）區(qū)和5UTR區(qū)；區(qū)； 不適合小范圍的比較，要達(dá)到顯示不適合小范圍的比較，要達(dá)到顯示96%以上的以上的mRNA至少需至少需240對(duì)引對(duì)引 物，要完全顯示細(xì)胞中所有的物，要完全顯示細(xì)胞中所有的mRNA種類，據(jù)估計(jì)需種類，據(jù)估

34、計(jì)需300種引物對(duì)。種引物對(duì)。 DDRT-PCR技術(shù)的改進(jìn)技術(shù)的改進(jìn) 對(duì)引物體系的改進(jìn)，目前第對(duì)引物體系的改進(jìn)，目前第3代引物由代引物由GenHunter公司于公司于1996年設(shè)計(jì)，年設(shè)計(jì)， 將將 3端端poly（dT）錨定引物和）錨定引物和5端隨機(jī)引物都帶上端隨機(jī)引物都帶上Hind 酶切位點(diǎn)，引酶切位點(diǎn)，引 物條數(shù)分別減為物條數(shù)分別減為3條和條和8條，而堿基數(shù)分別增加至條，而堿基數(shù)分別增加至18個(gè)和個(gè)和13個(gè)，這樣經(jīng)計(jì)算個(gè)，這樣經(jīng)計(jì)算 機(jī)同源性分析表明所得到的機(jī)同源性分析表明所得到的24個(gè)組合同樣能覆蓋所有個(gè)組合同樣能覆蓋所有mRNA，使操作和后，使操作和后 續(xù)處理更簡(jiǎn)便、快捷。續(xù)處理更簡(jiǎn)便

35、、快捷。 其他改進(jìn)包括：其他改進(jìn)包括：RT-PCR模板的改進(jìn)、模板的改進(jìn)、PCR反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化、凝膠電泳反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化、凝膠電泳 及標(biāo)記方法的改進(jìn)、雜交方式的改進(jìn)等。及標(biāo)記方法的改進(jìn)、雜交方式的改進(jìn)等。 SSH技術(shù) SSH技術(shù)原理技術(shù)原理 SSH是差減雜交與抑制是差減雜交與抑制PCR結(jié)合的快速分離差異基因的方法。結(jié)合的快速分離差異基因的方法。 運(yùn)用雜交的二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理，豐度高的單鏈運(yùn)用雜交的二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理，豐度高的單鏈cDNA退火時(shí)產(chǎn)退火時(shí)產(chǎn) 生同源雜交的速度要快于豐度低的單鏈生同源雜交的速度要快于豐度低的單鏈cDNA，從而使得豐，從而使得豐 度有差別的單鏈度有差別的單鏈cDNA相對(duì)含量達(dá)到基

36、本一致。而抑制性相對(duì)含量達(dá)到基本一致。而抑制性 PCR，則是利用非目標(biāo)序列片段兩端的反向重復(fù)序列在退火，則是利用非目標(biāo)序列片段兩端的反向重復(fù)序列在退火 時(shí)產(chǎn)生類似發(fā)夾的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，使其無(wú)法與引物配對(duì)，從而有時(shí)產(chǎn)生類似發(fā)夾的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，使其無(wú)法與引物配對(duì)，從而有 選擇地抑制了非目的基因序列的擴(kuò)增，從而使目的基因得到選擇地抑制了非目的基因序列的擴(kuò)增，從而使目的基因得到 富集、分離。富集、分離。 SSH技術(shù)操作流程技術(shù)操作流程 SSH的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn) 假陽(yáng)性率低：這是它的最大優(yōu)點(diǎn)，由于假陽(yáng)性率低：這是它的最大優(yōu)點(diǎn)，由于SSH方法采用兩次消減雜交和方法采用兩次消減雜交和 兩次兩次PCR，保證了該方法具有較高特

37、異性；，保證了該方法具有較高特異性； 高敏感性：在雜交過(guò)程中可使不同豐度基因均衡化，獲得低豐度差異高敏感性：在雜交過(guò)程中可使不同豐度基因均衡化，獲得低豐度差異 表達(dá)基因；表達(dá)基因； 速度快，效率高：一次速度快，效率高：一次SSH反應(yīng)可以同時(shí)分離幾十或成百個(gè)差異表達(dá)反應(yīng)可以同時(shí)分離幾十或成百個(gè)差異表達(dá) 基因；基因； 實(shí)驗(yàn)結(jié)果復(fù)雜程度低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果復(fù)雜程度低，SSH技術(shù)由于采用了接頭、差減雜交及兩輪抑技術(shù)由于采用了接頭、差減雜交及兩輪抑 制性制性PCR擴(kuò)增，可大量特異擴(kuò)增那些代表了差異表達(dá)的擴(kuò)增，可大量特異擴(kuò)增那些代表了差異表達(dá)的cDNA片段，因片段，因 而減少了結(jié)果的復(fù)雜性。而減少了結(jié)果的復(fù)雜性。

38、 SSH的缺點(diǎn)的缺點(diǎn) SSH技術(shù)的不足之處在于，每次只能比較兩種樣品之間基因表達(dá)的差技術(shù)的不足之處在于，每次只能比較兩種樣品之間基因表達(dá)的差 異；異； SSH依賴較高的依賴較高的Rsa消化效率和接頭連接效率，否則不帶接頭的消化效率和接頭連接效率，否則不帶接頭的tester cDNA的雜交方式將和的雜交方式將和driver cDNA相同，導(dǎo)致一些差異表達(dá)的相同，導(dǎo)致一些差異表達(dá)的cDNA得得 不到富集而丟失。同樣地，如果兩組不到富集而丟失。同樣地，如果兩組tester cDNA與接頭的連接效率不同，與接頭的連接效率不同， 也將丟失一些差異表達(dá)也將丟失一些差異表達(dá)cDNA；有時(shí)會(huì)產(chǎn)生嵌合；有時(shí)會(huì)產(chǎn)

39、生嵌合cDNA（幾率為（幾率為2%）；）； 起始材料需要起始材料需要 g 級(jí)量級(jí)量mRNA；SSH差減克隆片段較小，獲取差減克隆片段較小，獲取cDNA全全 長(zhǎng)序列有一定難度；長(zhǎng)序列有一定難度； SSH技術(shù)中所研究的材料的差異不宜太大，最好是只有細(xì)微差別。技術(shù)中所研究的材料的差異不宜太大，最好是只有細(xì)微差別。 DNA誘變 DNA誘變 定點(diǎn)突變 隨機(jī)突變 定點(diǎn)突變 u 基于PCR的點(diǎn)突變 u 不依賴于PCR的定點(diǎn)誘變方法 基于PCR的點(diǎn)突變 重疊延伸PCR 法(Over-lap extension PCR ) 大引物PCR (Megaprimer PCR) 特殊位置堿基的定點(diǎn)突變 擴(kuò)增環(huán)狀質(zhì)粒全長(zhǎng)

40、的突變方法 重疊延伸PCR 法(Over-lap extension PCR ) 重疊延伸重疊延伸PCR法介導(dǎo)的定點(diǎn)突變?cè)韴D法介導(dǎo)的定點(diǎn)突變?cè)韴D 大引物PCR (Megaprimer PCR) 大引物大引物PCR 法流程（圖中黑色實(shí)心三角形代表突變位點(diǎn)）法流程（圖中黑色實(shí)心三角形代表突變位點(diǎn)） 特殊位置堿基的定點(diǎn)突變 唯一限制性位點(diǎn)刪除法（唯一限制性位點(diǎn)刪除法（unique site elimination technique，USE）原理圖）原理圖 （黑色實(shí)心三角形代表突變位點(diǎn)，實(shí)心橢圓代表酶切位點(diǎn)）（黑色實(shí)心三角形代表突變位點(diǎn)，實(shí)心橢圓代表酶切位點(diǎn)） PCR 介導(dǎo)定點(diǎn)誘變的優(yōu)點(diǎn) 突變體

41、回收率高 在任何位點(diǎn)引入突變 降低模板DNA 形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的能力 可利用商業(yè)試劑盒 快速簡(jiǎn)便 PCR 介導(dǎo)定點(diǎn)誘變的缺點(diǎn) PCR 產(chǎn)物有相對(duì)高的錯(cuò)誤率 在擴(kuò)增DNA 的3末端引入非預(yù)設(shè)的核苷 酸 每套引物和模板的條件都需要優(yōu)化 以親本野生型DNA 為模板的PCR反應(yīng)中， 污染可導(dǎo)致高比例的非突變的克隆 不依賴于PCR的定點(diǎn)誘變方法 盒式誘變(Cassette mutagenesis) 寡核苷酸介導(dǎo)的誘變(Oligonucleotide-directed mutagenesis) Kunkel法 隨機(jī)突變 PCR介導(dǎo)的隨機(jī)突變 DNA 改組 StEP重組（重組（ Staggered Extens

42、ion Process） RAISE重組（重組（ Random In sertiona l-deletiona l Strand ExchangeMutagenesis） 隨機(jī)引導(dǎo)重組（隨機(jī)引導(dǎo)重組（ random-priming recombination，RPR） 第七節(jié) 轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定 一、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 二、 重組子的篩選與鑒定 三、DNA序列測(cè)定 一、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 （一）（一）受體細(xì)胞受體細(xì)胞（recepter cell）： 就是能夠攝取外源DNA并能夠使其穩(wěn)定存在的細(xì)胞。 選擇原則： （1）細(xì)胞要比較安全，無(wú)致病性或致病缺陷型，不會(huì)對(duì)外 界環(huán)境生物污染。 （2）

43、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞要方便。 （3）重組DNA分子要能夠在該受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在。 （4）重組DNA分子的篩選要方便。 （5）遺傳穩(wěn)定性要高，利于擴(kuò)大培養(yǎng)或長(zhǎng)期培養(yǎng)。 （6）選擇蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細(xì)胞，以 利于穩(wěn)定大量收集目的蛋白產(chǎn)物。 （二）（二）重組重組DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞導(dǎo)入原核細(xì)胞 常用方法：接合，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)化，電穿孔。 1. Ca2+誘導(dǎo)大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化法 : 基因原理：受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)CaCl2處理后，細(xì)胞膜的通透性 發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感 受態(tài)細(xì)胞。 2.電穿孔轉(zhuǎn)化法 基本原理： 通過(guò)高強(qiáng)度的 電場(chǎng)作用，瞬 時(shí)提高細(xì)胞膜 的通透 性，即

44、形成可 逆的瞬時(shí)通道， 從而吸收周圍 介質(zhì)中的外源 分子。 3. 接合轉(zhuǎn)化法 基本原理：通過(guò)供體細(xì) 胞同受體細(xì)胞間的直接 接觸而傳遞外源DNA 的方法。 4. 噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法 轉(zhuǎn)導(dǎo)是噬菌 體介導(dǎo)的一 種DNA或 RNA轉(zhuǎn)移過(guò) 程。 DNA 載體能夠承 載較大的外 源DNA片段， 可以達(dá)到 4851kb。 二、 重組子的篩選與鑒定 （一）（一）依據(jù)載體的選擇性標(biāo)記對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步篩選依據(jù)載體的選擇性標(biāo)記對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步篩選 1. 抗藥性篩選法：重組DNA載體上攜帶有受體細(xì)胞敏感的抗 生素抗性基因時(shí)，通?？梢匀∮棉D(zhuǎn)化體系涂布含該抗生素的 選擇培養(yǎng)平板的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的第一輪篩選。 常用的一種顯色篩選法是藍(lán)白斑篩選法，利用的是lacZ基 因的-互補(bǔ)原理，由-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑 IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落。 然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，破壞了 lacZ的N端片段，-互補(bǔ)也遭到破壞，因此使得帶有重組質(zhì) 粒的細(xì)菌形成白色菌落。 2. 顯色篩選法 3. 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法 基因原理: 突變型受體細(xì)胞上缺乏合成某種必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，