細(xì)胞凋亡的流式檢測應(yīng)用

1、北京利文公司 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞凋亡的流式 檢測應(yīng)用檢測應(yīng)用 北京利文公司 1. 細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)知識細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)知識 2. 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的研究方法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的研究方法 3. 細(xì)胞凋亡檢測面臨的問題細(xì)胞凋亡檢測面臨的問題 北京利文公司 1. 細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)知識：細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)知識： 細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是指細(xì)胞基因調(diào)控的一種自主性的自殺 現(xiàn)象?；蛘哒f在一定的生理或病理條件下，細(xì)胞遵循自身的 程序，自我結(jié)束生命的死亡方式。 程序性細(xì)胞死亡(Programmed Cell Death, PCD) 細(xì)胞凋亡同細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化一樣，是機(jī)體生存和發(fā)育離 不開的最基本生物

2、現(xiàn)象，通過凋亡可以平衡機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的數(shù) 目，清除衰老、過剩、有害的細(xì)胞。 細(xì)胞凋亡異常會引起免疫性疾病或腫瘤等。 細(xì)胞凋亡不足：腫瘤，自身免疫病 細(xì)胞凋亡過度：心肌缺血/心力衰竭/神經(jīng)元 退行性疾病/病毒感染 北京利文公司 與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病 北京利文公司 細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征 凋亡的起始：微絨毛消失，細(xì)胞間接觸消失，與周圍細(xì)胞 脫離，細(xì)胞質(zhì)中線粒體大體完整，染色質(zhì)固縮； 細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放 細(xì)胞色素C到胞漿，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面； 凋亡小體的形成。核膜核仁破碎，核染色質(zhì)斷裂為大小不 等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一

3、起聚集，為反折的細(xì) 胞膜所包圍； 凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。 北京利文公司 北京利文公司 細(xì)胞壞死細(xì)胞壞死 北京利文公司 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別 北京利文公司 北京利文公司 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的研究方法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的研究方法 北京利文公司 2.1 PI單染檢測單染檢測 2.2 Annexin V/PI(7-AAD)雙染檢測雙染檢測 2.3 細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定 2.4 線粒體膜電位檢測線粒體膜電位檢測 2.5 Caspases細(xì)胞酶的檢測細(xì)胞酶的檢測 2.6 DNA 碎片分析：碎片分析：Apo-BrdU 2.7 凋亡相關(guān)

4、蛋白：凋亡相關(guān)蛋白：Fas、Bcl-2、P53 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的研究方法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的研究方法 北京利文公司 與細(xì)胞周期相同，利用PI染色，通過檢測DNA含量來同時 判定細(xì)胞周期和凋亡。 凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶釋放，細(xì)胞DNA發(fā)生有序降解 ，被降解的低分子量DNA片段從變性細(xì)胞膜（經(jīng)乙醇及透 膜劑處理）漏出細(xì)胞外，使得凋亡細(xì)胞內(nèi)的DNA含量減低 ，在流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞DNA含量直方圖中G0/G1峰前可出 現(xiàn)亞二倍體峰，即凋亡峰 2.1 PI單染檢測單染檢測 北京利文公司 北京利文公司 PI單染色法的最大優(yōu)點(diǎn)在于獲得凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的 同時可以與細(xì)胞周期中其他時相的細(xì)胞進(jìn)行

5、比較 該法簡便、標(biāo)本制備容易、檢測費(fèi)用低 缺點(diǎn)：PI單染色法無法確認(rèn)來自哪一時相的凋亡， 對于S 期和G2/M 期的細(xì)胞發(fā)生凋亡時，凋亡峰有 時與G1 峰或S 峰相互重疊，導(dǎo)致G1 峰或S 峰增寬 而無典型的sub-G1 峰出現(xiàn)，所以無法分析來自S 期 或G2/M 期細(xì)胞的凋亡，應(yīng)借助其他方法進(jìn)行檢測 北京利文公司 注意事項注意事項 單細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)要充足，過少的細(xì)胞數(shù)會影響PI直方 圖上各時相的變異系數(shù)(CV)。當(dāng)G0/G1 期的CV10% 時，結(jié) 果的可信度下降。 終濃度為70% 的乙醇固定效果最好，而甲醛或多聚甲醛均 會影響亞二倍體峰的出現(xiàn)。 4C 或-20C 固定較37C 固定效果好

6、。 固定后PBS懸浮時間為510min ，不宜過長，否則容易與細(xì) 胞碎片混淆 固定過程中充分混勻細(xì)胞，減少細(xì)胞粘連成團(tuán)。 北京利文公司 磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）異位：正常情況下， PS位于細(xì)胞膜內(nèi)層，細(xì)胞發(fā)生凋亡時PS從細(xì)胞膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)并 暴露在細(xì)胞膜外層，是細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期事件。 2.2 Annexin V/PI(7-AAD)雙染檢測雙染檢測 北京利文公司 Annexin V選擇性結(jié)合PS 。用帶有熒光標(biāo)記的Annexin V， 就可以用流式細(xì)胞儀非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨 酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。 PI(7-AAD)可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪

7、失細(xì)胞膜完整 性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的 完整性已經(jīng)喪失， Annexin V可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位 于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈 現(xiàn)綠色熒光。 2.2 Annexin V/PI(7-AAD)雙染檢測雙染檢測 北京利文公司 檢測方法檢測方法 收集細(xì)胞并重懸于收集細(xì)胞并重懸于Binding Buffer(Binding Buffer(結(jié)合液結(jié)合液) )中中 加熒光標(biāo)記的加熒光標(biāo)記的Annexin VAnnexin V和和PI PI 室溫、避光孵育5分鐘 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 北京利文公司 注意事項注意事項 細(xì)胞制備(如貼壁細(xì)胞)或儲

8、存時細(xì)胞膜的破損會導(dǎo) 致PS跨膜分布的改變，造成假陽性； 巨噬細(xì)胞或其他細(xì)胞吞飲凋亡小體時，Annexin V 檢測也會陽性。 北京利文公司 Annexin V細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸檢測：細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸檢測： Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒及相關(guān)試劑 Annexin V/7-AAD凋亡檢測試劑盒及相關(guān)試劑 此法簡單、可靠，由于凋亡時細(xì)胞膜的改變大大早于 DNA 的改變，因此Annexin V/PI(或7- AAD )雙染色是檢 測早期凋亡細(xì)胞的敏感方法。 由于該法必須用活細(xì)胞，因此檢測時間受到限制，且對 凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞無法準(zhǔn)確區(qū)分。 北京利文公司 Fluo-3-Am為新型的高度

9、特異性Ca2+熒光指示劑，進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng) 非特異性酯酶脫去Am酯，成為脂溶Fluo-3留在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)Fluo-3 與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度是Fluo-3本身的40倍以上，當(dāng) 用480nm波長激發(fā)時，其熒光強(qiáng)度與游離鈣離子濃度成正比。 Fluo-4 將Fluo-3結(jié)構(gòu)中的Cl替換成F ， 熒光強(qiáng)度比Fluo-3強(qiáng)1倍 Fluo-4與鈣離子的親和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本相 同，可以使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。 Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通過培養(yǎng)，能夠輕易進(jìn) 入細(xì)胞中。AM進(jìn)入細(xì)胞后會被胞內(nèi)酯酶所水解，產(chǎn)生的Fluo-4 隨后會和鈣離

10、子結(jié)合并發(fā)出熒光。 2.3 細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定 北京利文公司 北京利文公司 JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential) m 的理想熒光探針。 線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中， 形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光正常細(xì)胞 線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此 時JC-1為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光凋亡細(xì)胞 線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通 過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì) 胞膜電位的下降

11、，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光 的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。 2.4 線粒體膜電位檢測線粒體膜電位檢測 喜樹堿(CPT)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，3 小時后用JC-1檢測線粒體膜電位的改 變?？梢?，凋亡細(xì)胞紅色熒光降低。 檢測方法：檢測方法： 收集細(xì)胞于收集細(xì)胞于JC-1JC-1溶液中溶液中 37度孵育15-20min 離心、去上清離心、去上清 重懸于孵育緩沖液中重懸于孵育緩沖液中 流式分析流式分析 FL1: FL1:凋亡細(xì)胞；凋亡細(xì)胞； FL2: FL2:正常細(xì)胞正常細(xì)胞 北京利文公司 caspases家族在凋亡過程中起到非常重要的作用，其中 caspases - 3 是

12、最重要的指示蛋白酶。 研究結(jié)果表明， caspases - 3 可在凋亡發(fā)生的早期被激活， 激活的caspases - 3 繼而使其他caspases 裂 解并被激活，同 時還可激活細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的相關(guān)成分。 caspases - 3 的活性只有在凋亡的早期才能檢測到，隨后在 凋亡的過程中持續(xù)升高，在凋亡的晚期快速下降。 對caspases - 3 的連續(xù)監(jiān)測，可動態(tài)觀察凋亡的整個過程。 2.5 Caspases細(xì)胞酶的檢測細(xì)胞酶的檢測 北京利文公司 該法簡單、快速，但不適于常規(guī)多功能流式細(xì)胞儀( 不具備紫外光源)的檢測。 主要有Caspases-3流式細(xì)胞檢測試劑盒，Caspases-2/

13、 Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗體 3.5 Caspases細(xì)胞酶的檢測細(xì)胞酶的檢測 北京利文公司 2.6 DNA 碎片分析：碎片分析：Apo-BrdU 核酸內(nèi)切酶活化使核小體內(nèi)DNA斷裂為50300kb片段，裂解為200bp DNA碎片，暴露出多個3羥基末端。利用外源性TdT使外源性dUTP或 BrdUTP 連接到DNA 碎片的3羥基末端。 以熒光標(biāo)記抗dUTP或抗BrdUTP抗體檢測dUTP或BrdUTP數(shù)量，從而間 接檢測凋亡 加PI 染色，在定量檢測凋亡細(xì)胞同時顯示凋亡細(xì)胞在細(xì)胞周期中所位置 北京利文公司 3.6 DNA 碎片

14、分析：碎片分析：Apo-BrdU 在此法中，細(xì)胞固定先用甲醛，再用乙醇 因為在凋亡細(xì)胞中可以檢測出兩群DNA： p 一群是低分子量的DNA (100200bp) ，彌散分布在凋亡細(xì)胞 p 另一群是高分子量的DNA 或仍然黏附在核基質(zhì)上的DNA ， 乙醇固定后沖洗不能將其從細(xì)胞中洗去。 主要產(chǎn)品有Apo-BrdU FITC 檢測試劑盒 北京利文公司 用樹堿(CPT)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，0、120和150分鐘時用 TUNEL(BrdUTP)/PI雙染法檢測DNA斷裂，同時分析細(xì) 胞周期?？梢姷蛲鲭S著誘導(dǎo)時間的增加而增多，且可知 凋亡發(fā)生的時相。 檢測方法：檢測方法： 固定細(xì)胞/組織 洗細(xì)胞 A

15、po-BrdU Kit Apo-BrdU Kit TdT/BrdU標(biāo)記細(xì)胞 洗細(xì)胞 Anti-BrdU-FITC染細(xì)胞 PI/Rnase處理 流式分析 此方法靈敏度高、特異性好，目前己被廣泛采用。 由于DNA 斷裂發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早期階段，先于其形態(tài) 學(xué)上的改變，可用于早期凋亡的研究。 通過與PI 雙染色，克服了PI 單染色法的缺點(diǎn)，可以鑒定 細(xì)胞凋亡發(fā)生在細(xì)胞周期的具體時相。 北京利文公司 2.7 凋亡相關(guān)蛋白：凋亡相關(guān)蛋白：Fas、Bcl-2、P53的檢測的檢測 在細(xì)胞凋亡的研究中，要重視對凋亡相關(guān)蛋白的檢測，它們 在特定的信號傳導(dǎo)通路中與啟動凋亡的信號分子相互作用。 從凋亡的開始到凋亡的

16、結(jié)束，許多信號傳導(dǎo)通路都需要或受 到特定的蛋白間相互作用的調(diào)控。 凋亡相關(guān)蛋白：主要有Apo -1 (Fas) 、FasL的相關(guān)抗體， Bcl-2相關(guān)檢測抗體、p53等調(diào)控凋亡的基因蛋白產(chǎn)物 北京利文公司 2.7 凋亡相關(guān)蛋白：凋亡相關(guān)蛋白：Fas、Bcl-2、P53的檢測的檢測 有些蛋白存在于細(xì)胞膜表面，如Fas； 有些則存在于胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，如p53 、bc1-2 標(biāo)本的處理方法不同 破膜是關(guān)鍵，最佳的破膜既能使膜通透性增強(qiáng)，又 能保持膜的完整性，使膜表面的抗原分子不被破壞。 皂角素( saponin) 是目前最佳的破膜劑，它優(yōu)于乙醇、 甲醇和甲醛等。 北京利文公司 細(xì)胞凋亡研究細(xì)胞凋亡研

17、究 1.鑒別凋亡與壞死: Annexin /PI(7-AAD) 2.測定凋亡率: Annexin V、TUNEL 3.研究凋亡觸發(fā)機(jī)制： Caspase、Fas及FasL、bcl-2/bax 3. 細(xì)胞凋亡檢測面臨的問題細(xì)胞凋亡檢測面臨的問題 3.1 凋亡假陽性產(chǎn)生原因：凋亡假陽性產(chǎn)生原因： PS外翻使凋亡細(xì)胞和凋亡小體容易被鄰近細(xì)胞所吸附并被吞噬 吞噬細(xì)胞 并非僅為專職的吞噬細(xì)胞(如單核和粒細(xì)胞)，成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞也具吞噬作用。 尤其是實體瘤，常可見在凋亡細(xì)胞周圍的腫瘤和非腫瘤細(xì)胞中有含有凋亡小體的吞噬體。 鄰近細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞后的殘留物中即包含了變化的細(xì)胞膜、 斷裂DNA等凋亡特征物。

18、 即使很輕微處理（胰酶消化/機(jī)械振蕩/細(xì)胞刮取等）均會造成PS 的外翻。 3.2 區(qū)分凋亡、壞死和凋亡的區(qū)分凋亡、壞死和凋亡的“壞死期壞死期”： 產(chǎn)生原因產(chǎn)生原因 晚期凋亡與壞死相似 細(xì)胞膜破裂，用PI排染和AnnexinV結(jié)合實驗無法區(qū)分。 胰酶消化時間過長、機(jī)械損傷(如細(xì)胞刮取、腫瘤細(xì)胞分 離或反復(fù)離心等)、電穿孔或某些藥物處理時，細(xì)胞膜的 通透性和對稱性均會改變。 解決方法：解決方法： 形態(tài)學(xué)特征是區(qū)分凋亡和壞死的“金標(biāo)準(zhǔn)”。 3.3 樣本制備過程中凋亡細(xì)胞的選擇性丟失：樣本制備過程中凋亡細(xì)胞的選擇性丟失： 貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的分離 p 凋亡早期，細(xì)胞即脫離培養(yǎng)瓶表面并懸浮在培養(yǎng)液中。因此去除培養(yǎng)液， 然后加胰酶或EDTA消化的方法不可避免的會失去很多凋亡細(xì)胞。 -將培養(yǎng)液和消化下來的細(xì)胞合在一起將培養(yǎng)液和消化下來的細(xì)胞合在一起 p 胰酶消化本身就傾向于破壞細(xì)胞膜已破損的晚期凋亡和壞死細(xì)胞，導(dǎo)致 丟失。 密度梯度離心 密度梯度離心選擇性丟失即將死亡和死亡細(xì)胞，因凋亡早 期細(xì)胞脫水，核和胞漿皺縮，其