GB∕T 40226-2021 環(huán)境微生物宏基因組檢測 高通量測序法

?ICS07.080

CCSA40

中華人民共和國國家標準

GB/T40226—2021

環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測序法

Detectionofenvironmentalmicrobialmetagenome—Highthroughputsequencing

2021-05-21發(fā)布

2021-12-01實施

GB/T40226—2021

目次

ttiw m

i 難 i

2規(guī)范性引用文件 1

3術語和定義 1

4鶴? 2

5綱 2

6試驗條件 2

7刪 2

8儀器設備 2

9牛羊& 3

10試驗步驟 3

11試驗報告 4

12質量控制 5

附錄A（規(guī)范性）糞便樣品采集、保存、運輸方法 6

附錄B（規(guī)范性）土壤樣品采集、保存、運輸方法 7

附錄C（規(guī)范性）水體樣品采集、保存、運輸方法 8

附錄D（資料性）樣品信息單 9

附錄E（資料性）DNA樣品的完整性圖譜和質量級別分類 10

附錄F（資料性）參考數(shù)據(jù)庫 11

12

本文件按照GB/T1.1—2020((標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由全國生化檢測標準化技術委員會(SAC/TC387)提出并歸口。

本文件起草單位：深圳華大生命科學研究院、深圳華大基因科技有限公司、深圳市生命科技產(chǎn)學研資聯(lián)盟、中國測試技術研究院生物研究所、深圳華大臨床檢驗中心。

本文件主要起草人：陳冰、肖亮、鐘煥姿、李俊樺、李倩一、賈慧玨、姜華艷、周李華、唐美芳、吳昊、李陶莎、周媛、鐘宏彬。

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環(huán)境微生物宏基因組檢測高通量測序法

1范圍

本文件描述了采用高通量測序技術進行環(huán)境微生物宏基因組檢測的術語和定義、原理、試驗條件、試劑、儀器設備、樣品、試驗步驟、試驗報告和質量控制要求。

本文件適用于運用高通量測序法進行環(huán)境微生物宏基因組的檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析試驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB19489實驗室生物安全通用要求

GB/T35537—2017高通量基因測序結果評價要求

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

環(huán)境environment

相對某項中心事物的周圍世界。

注：在本文件中特指人體（動物）環(huán)境與自然環(huán)境。人體（動物）環(huán)境包括但不限于口腔、皮膚、生殖道、腸道等；自然環(huán)境包括但不限于空氣、水體、土壤、沉積物等。

3.2

相對豐度relativeabundance

某一特定種類微生物在環(huán)境微生物群落中所占的相對比例。

注：通常以百分比表示。

3.3

微生物宏基因組microbialmetagenome

以特定環(huán)境中整個微生物群落作為研究對象，不分離培養(yǎng)，直接提取得到的所有微生物基因組DNA。

注：可用于分析其遺傳信息、物種分類、系統(tǒng)進化、基因功能及代謝網(wǎng)絡等。

3.4

堿基識別質量qualityofbasecalling

評價堿基準確識別的概率。

注：簡稱為Q，通常以數(shù)值表示。堿基識別質量值與堿基識別錯誤率負相關，二者遵循對數(shù)函數(shù)關系。堿基識別質量值越高，錯誤率越低。

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3.5

Q20

測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質量值為20的堿基識別準確率為99%，或錯誤率為1%。

3.6

Q30

測序數(shù)據(jù)中，堿基識別質量值為30的堿基識別準確率為99.9%,或錯誤率為0.1%。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)

ID:識別碼(identifier)

PCR：聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction)

RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)

5原理

運用高通量測序技術對環(huán)境樣品中微生物基因組DNA進行測序，再將測序結果與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中序列進行比對.從而檢測樣品中所含微生物種類和相對豐度。

6試驗條件

6.1實驗室設施和設備要求應符合GB19489的規(guī)定。

6.2實驗室用水應符合GB/T6682的規(guī)定。

6.3實驗室應做到防止污染，應根據(jù)不同工作內容劃分獨立區(qū)域，并有明顯標志.如試劑儲備和準備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴增區(qū)等，各區(qū)域間應避免交叉污染。

7試劑

7.1DNA提取試劑。

7.2PCR產(chǎn)物純化試劑。

7.3文庫制備試劑。

7.4高通量測序試劑。

8儀器設備8.1高通量測序儀。

8.2PCR儀。

8.3冷凍離心機:最大離心力12000g以上。

8.4微量移液器。

8.5紫外分光光度計。

8.6熒光定量儀。

8.7電泳儀。

8.8凝膠成像系統(tǒng)。

8.9水浴鍋。

8.10低溫冰箱：-20°C和一80°C。

9樣品

9.1樣品采集、保存和運輸

9.1.1樣品采集應經(jīng)過倫理審查和生物安全評價審查。

9.1.2應即刻采樣，減少樣品暴露于空氣中的時間，同時應避免樣品被其他物質污染。

9.1.3應根據(jù)環(huán)境樣品類型等情況選擇相應的采樣方法以保證樣品中微生物群落的代表性和準確性。糞便樣品采集、保存和運輸方法按附錄A，土壤樣品采集、保存和運輸方法按附錄B，水體樣品采集、保存和運輸方法按附錄C執(zhí)行。

9.2樣品接收與處理

應核對樣品編號，記錄樣品信息，檢查樣品狀態(tài)，避免密封不嚴導致泄漏或污染等，否則該樣品應廢棄，重新采樣。應記錄樣品信息（見附錄D），以保證樣品的可追溯性。

10試驗步驟

10.1DNA提取

10.1.1原理

將環(huán)境樣品懸浮于裂解緩沖液中，通過抽提等步驟提取微生物基因組DNA，充分去除樣品中的蛋白質、脂類、多糖、RNA等雜質。宜選用手工提取方法或相應DNA提取試劑盒。

10.1.2DNA樣品濃度和完整性檢測

環(huán)境樣品提取微生物基因組DNA后，應使用熒光定量儀檢測DNA樣品濃度，使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA樣品完整性。宜綜合DNA樣品濃度及完整性，判斷DNA樣品質量級別，判斷依據(jù)見附錄E。

10.2文庫構建與高通量測序

10.2.1應使用合適的DNA樣品和文庫構建試劑進行文庫構建。進行文庫構建的DNA樣品類別選擇標準按表1。

表1進行文庫構建的DNA樣品類別選擇標準

DNA樣品類別

是否滿足文庫構建

A類

滿足文庫構建要求.DNA總景＞1.0fig

B類

滿足文庫構建要求，DNA總量＞0.5ftg，且＜1.0MS

C類

不完全滿足文庫構建要求，可以嘗試進行該步驟，但不保證測序質量。建議重新采樣.重新提取樣品微生物基因組DNA

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10.2.2應使用合適的文庫和高通量測序試劑進行高通量測序。高通量測序按GB/T35537—2017的附錄A進行。

10.3數(shù)據(jù)處理

10.3.1數(shù)據(jù)質控

質控步驟

樣品經(jīng)過高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)，應進行質量控制，去除含接頭或低質量的序列、外源或宿主基因組序列，再進行后續(xù)生物信息學分析。

堿基識別質量值要求

測序完成后，應進行Q2O.Q3O的統(tǒng)計和評估。每個DNA樣品可用數(shù)據(jù)對應的堿基識別質量值應符合如下要求：

——大于Q2O的堿基比例＞90%;

——大于Q30的堿基比例＞80%。

可用數(shù)據(jù)量要求

可用測序數(shù)據(jù)量應達到聲明目標物種可從樣品中檢測到的最小測序數(shù)據(jù)量。每個樣品測序生成的可用高質量序列數(shù)目應大于1X1O7條。

注：序列數(shù)目為單端測序序列條數(shù)，或雙端測序序列對數(shù)。

10.3.2物種注釋

數(shù)據(jù)質控后對樣品數(shù)據(jù)進行物種注釋。除特殊方法外，對于已知物種，宜使用數(shù)據(jù)庫中序列相似度95%以上，覆蓋度90%以上的物種信息進行注釋。數(shù)據(jù)庫見附錄F。

10.3.3序列拼接與組裝

數(shù)據(jù)質控后對樣品數(shù)據(jù)可進行序列拼接與組裝。使用組裝軟件將序列進行拼接，得到更長的疊連群，將這些疊連群片段聚集起來，與參考數(shù)據(jù)庫進行比對，得到新的參考基因集。數(shù)據(jù)庫見附錄F。

10.3.4微生物物種相對豐度計算

數(shù)據(jù)質控后對樣品數(shù)據(jù)進行物種相對豐度計算，應對所使用的相對豐度計算方法進行記錄。除特殊方法外，宜將可用高質量測序數(shù)據(jù)比對到組裝好的參考基因集或合適的數(shù)據(jù)庫上，按相似度95%以上，覆蓋度90%以上進行統(tǒng)計，得到基因水平上的相對豐度分布情況，再將注釋到同一物種分類水平的基因序列相對豐度進行疊加，得到該物種的相對豐度結果。

11試驗報告

試驗報告應包含環(huán)境樣品中微生物群落的物種組成及各成分相對豐度，可增加個性化功能分析部分.并應至少包括下列內容：

a） 檢測機構名稱、聯(lián)系方式和地址、檢測員、樣品接收時間、樣品檢測時間及報告時間；

b） 測序平臺與測序策略；

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C）數(shù)據(jù)分析對應使用的注釋方法、軟件、參數(shù)、流程和數(shù)據(jù)庫版本等;

d）樣品物種組成及各相應豐度，宜選擇多元展現(xiàn)方式。

12質量控制

12.1宜使用標準物質進行質量控制，評估定性與定量檢測結果的準確性。

12.2在描述結果時應注明檢測結果的局限性.說明非本文件規(guī)定的可能影響檢測結果的所有操作細節(jié)。

附錄A

（規(guī)范性）

糞便樣品采集、保存、運輸方法

A.1糞便杯采集法

A.1.1采集

應使用潔凈的器皿收集糞便樣品.確認器皿中無水、尿液或其他分泌物（如經(jīng)血）等污染。排便后即刻使用一次性糞便杯配套取樣勺對糞便樣品中部取樣，將糞便樣品從潔凈器皿轉移至糞便杯，立刻旋緊蓋子。每個糞便杯中轉移至少2cm3大小的糞便樣品。

A.1.2保存與運輸

A.1.2.1糞便杯采集糞便樣品后，應立即置于干冰或一80°C保存。若不能即刻轉移，可暫存于＜4°C條件下（如冰盒），30min內轉移至干冰或一80°C保存。

A.1.2.2應在干冰條件下進行運輸。保存及運輸過程應避免反復凍融。

A.2含穩(wěn)定液自采樣套裝采集法

A.2.1采集

應使用潔凈的器皿收集糞便，確認器皿中無水、尿液或其他分泌物（如經(jīng)血）等污染，按照自采樣套裝操作要求取中段糞便，將采集的糞便樣品迅速轉移至含有穩(wěn)定劑的保存管中，使穩(wěn)定液完全浸沒糞便樣品，蓋緊管蓋。

A.2.2保存與運輸

含穩(wěn)定液保存管采樣后，該保存管按操作說明可于常溫保存和運輸，避免陽光直射。常溫放置時間應不超過自采樣套裝操作說明限定的常溫保存時間范圍。對將超出自采樣套裝操作說明限定時間的常溫糞便保存管需轉移至一80°C凍存，應在干冰條件下進行運輸。保存及運輸過程應避免反復凍融。

附錄B

（規(guī)范性）

土壤樣品采集、保存、運輸方法

B.1采集

宜取土壤表層5cm?10cm處土壤，如果土壤有翻動，應更深處采樣，避免空氣微生物污染。采樣區(qū)內設置至少3個重復采樣點，保證所取樣本對所在地域的代表性。每個點取樣量應一致（＞5g），去除土樣里植物根系或礫石，將重復土樣混合均勻，做好標記，裝人滅菌封口聚乙烯袋或其他無菌容器。

B.2保存與運輸

B.2.1采集樣品后，應立即置于干冰或一80°C保存。若不能即刻轉移，可暫存于＜4°C條件下（如冰盒）,30min內轉移至干冰或一80°C保存。

B.2.2應在干冰條件下進行運輸。保存及運輸過程應避免反復凍融。如需常溫保存或運輸，宜將樣品浸潤于穩(wěn)定劑中。

附錄C

（規(guī)范性）

水體樣品采集、保存、運輸方法

C.1采集

C.1.1根據(jù)水體不同的濁度，應使用無菌器材采集4L-200L不等的水樣。采集好的水樣需要通過濾膜進行過濾，可選擇不同孔徑大小的濾膜。

示例：20ptm、3ftm、0.8pcm、0.4pm、0.2ftm、0.1等孔徑濾膜。

C.1.2濁度較大水樣應先靜置，分離懸浮顆粒;再使用20 孔徑濾膜預過濾，再選擇小孔徑濾膜進行

過濾。濁度較小清涼水樣，可選擇小孔徑濾膜直接過濾。

C.2保存與運輸

C.2.1樣品最后一次過濾后的濾膜應放置于無菌容器，并將無菌容器立即置于干冰或一80°C進行保存。若不能即刻轉移，可暫存于＜4°C條件下（如冰盒），30mm內應轉移至干冰或一80°C保存。

C.2.2應在干冰條件下進行運輸。保存及運輸過程中應避免反復凍融。如常溫保存或運輸，宜將樣品浸潤于穩(wěn)定劑中。

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附錄D

（資料性）

樣品信息單

樣本信息單記錄見表D.1。

表D.1樣本信息單

I運輸信息

運輸公司： 快遞單號： 城市：

樣品寄件人： 樣品寄件人聯(lián)系電話：

運輸狀態(tài)：口干冰 □冰袋 □常溫 □其他：

樣品聯(lián)系人*

樣品聯(lián)系人電話

樣品聯(lián)系人郵箱*

樣品聯(lián)系人單位

有無傳染性、

致病性*

□無 □有（致病傳染性說明： ） □未知

實驗室要求*

□普通實驗室 □P2實驗室（生物安全柜）

詳細提取方案*

樣品信息

信息欄

填寫標準

樣品名稱

1.樣品名稱必需唯一化以區(qū)分其他樣本

2.樣品名稱可由字母及數(shù)字組成；不能包含和“*”等非常規(guī)符號

3.人體相關樣品名稱不能包含任何可識別個體身份的信息

樣品狀態(tài)

樣本狀態(tài)包括：DNA、速凍組織（速凍糞便、速凍土壤、速凍水體等）、含穩(wěn)定劑組織等

分類單元ID

按照NCBItaxonID提供樣品分類單元信息。例如：410658代表土壤宏基因組樣品;749906代表腸道宏基因組樣品；412755代表海洋沉積物宏基因組樣品；408172代表海洋水體宏基因組樣品;449393代表淡水宏基因組樣品。

NCBI無記錄ID的樣品類型歸為408169

樣品環(huán)境名稱

樣本環(huán)境名稱必需與上述分類單元ID—致。包括土壤宏基因組、腸道宏基因組、海洋沉積物宏基因組、海洋水體宏基因組等

宿主名稱

（僅針對宿主相關樣本，含中文名與拉丁名）

宿主名稱：人(.Homosapiens)、豬(Susscrofa)

采集時間

樣本采集時間，按照年-月-日“yyyy-mm-dd”規(guī)范記錄，對無法精確日期的樣本可精確到月份或年份。例如：2017-01-23,

2017-01和2017

采集地點

采集地點信息需包括國家和省份信息（詳細位置信息由經(jīng)緯度提供）。例如：中國廣東省

采集經(jīng)度

采集地點經(jīng)度，正值代表東經(jīng)，負值代表西經(jīng)。例如：40.743和一10.530

采集緯度

采集地點緯度.正值代表北緯，負值代表南緯。例如:18.580和一89.122

注1：樣本信息標準參考國際基因組學標準聯(lián)盟的宏基因組序列最小信息（MIMS）標準。注2:"*”欄目為必填項。

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附錄E

(資料性)

DNA樣品的完整性圖譜和質量級別分類

E.1DNA完整性判斷

使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測基因組DNA樣品的完整性，進行完整性判斷的電泳圖譜見圖E.1。

M2 1

2 3

Ml

標引序號說明：

1—重度降解：電泳圖中對應樣品的泳道無明顯主帶，拖尾嚴重;

2—中度降解：電泳圖中對應樣品的泳道可見主帶，略有拖尾；

3—輕微降解：電泳圖中對應樣品的泳道可見主帶，略有拖尾；

Ml——DNA標準品1；

M2——DNA標準品2；

bp 堿基對(basepair)0

圖E.1基因組DNA樣品降解程度示意圖

E.2DNA質量級別分類

結合基因組DNA樣品濃度和完整性，對DNA樣品質量級別進行分類，分類標準見表E.1。

表E.1DNA樣品質量級別分類表

樣品類型

檢測結果

判定結論

基因組DNA

m^l.Optg

^o^lOng//iL

無降解

或輕微降解

A類

0.5ptg^m<C1.0ftg

B類

m<0.5ptg

^<10ng/^L

中度降解或重度降解

C類

注1:m 指DNA總量。

注2:p 指DNA質量濃度。

注3：A類樣品同時滿足Mg，p>10.0ng/fzL，無降解或輕微降解二個條件，合格。

注4：B類樣品同時滿足0.5 <??<1.0Mg^>10.0ng/ML，無降解或輕度降解三個條件，合格。

注5:C類樣品滿足m<0.5Mg,(o<10.0ng/^L,中度降解或重度降解三個條件其中之一或以上，不完全合格。

附錄F

（資料性）

參考數(shù)據(jù)庫

數(shù)據(jù)處理過程可使用如下參考數(shù)據(jù)庫：

a） 國家生物信息中心（CNCB）/國家基因組科學數(shù)據(jù)中心（NGDC）的基因組數(shù)據(jù)庫https：///gwh/

b） 國家微生物科學數(shù)據(jù)中心（NMDC）的微生物宏基因組數(shù)據(jù)庫

https：///

c） 國家微生物科學數(shù)據(jù)中心（NMDC）的全球微生物菌種目錄數(shù)據(jù)庫

http:///

d） 中國國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺的微生物數(shù)據(jù)庫

https：///datamart/microbe

e） 美國國立生物技術信息中心（NCBI）的基因銀行數(shù)據(jù)庫

https：///genbank

f） 美國國立生物技術信息中心（NCBI）的參考序列數(shù)據(jù)庫

https：///refseq

g） 美國國立生物技術信息中心（NCBI）的微生物基因組數(shù)據(jù)庫

http://www.ncbi.nlm.nih,gov/genome/microbes

h） 美國國立生物技術信息中心（NCBI）的物種分類數(shù)據(jù)庫

http:///taxonomy

i） 美國能源部聯(lián)合基因組研究中心（DOE-JGI）的微生物基因組數(shù)據(jù)庫/

j） 美國能源部聯(lián)合基因組研究中心（DOE-JGI）的細菌核糖體RNA基因序列數(shù)據(jù)庫http://

k） 歐洲生物信息研究所（EBI）的核酸數(shù)據(jù)庫

http://www.ebi.ac.uk/embl/

l） 歐洲生物信息研究所（EBI）的蛋白數(shù)據(jù)庫

https:///

m） 斯坦福國際研究所（SRIinternational）的代謝組學數(shù)據(jù)庫

https：///

n） 日本京都大學的基因與基因組百科全書

https://www.genome.jp/kegg/

o） 日本國立遺傳學研究所（NIG）的核酸數(shù)據(jù)庫

http://www.ddbj.nig.ac.jp

P）加拿大麥克馬斯特大學的抗性基因數(shù)據(jù)庫

https：//card.mcmaster.ca/

q）全球海洋微生物數(shù)據(jù)庫（TARAOceans）

https：///

參考文獻

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[2]Fierer,N.etal.Comparativemetagenomic,phylogeneticandphysiologicalanalysesofsoilmicrobialcommunitiesacrossnitrogengradients.ISMEJ.6,1007-1017(2012).

[3]Handelsman,J.,Rondon,M.R.，Brady,S.F.，Clardy,J.&Goodman,R.M.Molecularbiologicalaccesstothechemistryofunknownsoilmicrobes:anewfrontierfornaturalproducts.Chem.Biol.5，R245-R249(1998).

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