EBNA2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物的功能(一).doc

1、EBNA2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物的功能(一)【關(guān)鍵詞】 EBNA2ConstructionofeukaryoticexpressionvectorofEBNA2andfunctionaldetectionofitsproduct【Abstract】AIM:ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorofEBNA2andtoexpressitineukaryoticcellsanddetectthefunctionofitsproduct.METHODS:EBNA2genewasobtainedbyPCRandDNArecombinationfrom

2、theplasmidpSG5EBNA2.PCRproductofEBNA2bwastheninsertedintoplasmidpMD18Tandsequenced.ThefulllengthEBNA2genewascutandinsertedintoeukaryoticexpressionplasmidpCMVHA.UsingLipofectamineTM2000,theplasmidpCMVEBNA2wastransfectedintoCos7andthendetectedbyWesternblotandimmunofluorescence.TheactivityofEBNA2wasdet

3、ectedbyluciferasereporterassay.RESULTS:TheEBNA2genewassuccessfullyclonedanditssequencewasidenticaltothatinGenBank.AfterplasmidpCMVEBNA2wastransfectedintoCos7,theexpressedproductofEBNA2wasdetectedbyWesternblotandimmunofluorescence.ThetranscriptionalactivityofEBNA2wasdemonstratedbyreporterassay.CONCLU

4、SION:TheeukaryoticexpressionvectorpCMVEBNA2hasbeensuccessfullyconstructedandsuccessfullyexpressedineukaryoticcellline.TheEBNA2proteinhastranscriptionalactivation.【Keywords】EBNA2;clone;expression;geneticvector【摘要】目的：構(gòu)建EB 病毒核心抗原2（EBNA2）的真核表達(dá)載體，在真核細(xì)胞中表達(dá) ,并檢測其表達(dá)產(chǎn)物的功能.方法：應(yīng)用DNA 重組和PCR方法從質(zhì)粒 pSG5EBNA2中亞克隆 E

5、BNA2的編碼基因， 插入到真核表達(dá)載體 pCMVHA中.應(yīng)用脂質(zhì)體的方法將重組質(zhì)粒 pCMVEBNA2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 Cos7細(xì)胞，通過 Westernblot 和免疫熒光方法檢測 EBNA2的表達(dá) .應(yīng)用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測EBNA2蛋白的活性 .結(jié)果：克隆 EBNA2的編碼基因，經(jīng)序列分析證實(shí)與GenBank中的序列完全一致 .以含有 EBNA2編碼基因的真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞， EBNA2基因的表達(dá)產(chǎn)物通過 Westernblot 和免疫熒光方法得到證實(shí).熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示所表達(dá)的蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性.結(jié)論：成功構(gòu)建 EBNA2的真核表達(dá)載體，證實(shí)其在真核細(xì)胞Cos7可以表達(dá)，并

6、具有轉(zhuǎn)錄激活功能.【關(guān)鍵詞】 EBNA2基因；克??；表達(dá)；遺傳載體0 引言EB病毒核心抗原 2（EBNA2）的編碼產(chǎn)物是EB病毒體外感染細(xì)胞時(shí)最先表達(dá)的蛋白，作為一種轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)節(jié)病毒及細(xì)胞內(nèi)多種基因表達(dá)，如 LMP1，LMP2A1，CD21，CD23及 cmyc 等，同時(shí)還可以抑制細(xì)胞免疫球蛋白重鏈的轉(zhuǎn)錄.Notch 信號途徑是體內(nèi)一個(gè)非常保守的信號途徑，在體內(nèi)分布十分廣泛2.EBNA2可以與 Notch 信號途徑中的重要分子 RBPJ相結(jié)合，激活下游靶基因， 并通過模仿 Notch 信號途徑對體內(nèi)淋巴細(xì)胞的分化和發(fā)育方向起調(diào)控作用3 .同時(shí) EBNA2還可以促進(jìn)抑癌分子p53 的磷酸

7、化 4，調(diào)節(jié)癌基因的表達(dá).我們對EBNA2 基因進(jìn)行了克隆，并在真核細(xì)胞中表達(dá)，為進(jìn)一步探討其對小鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育過程的影響奠定基礎(chǔ).1 材料和方法1.1 材料大腸桿菌XL10；質(zhì)粒載體 pCMVHA，pBluscript（-），pGA9816為本室保存 .載體 pMD18T 購自 TaKaRa公司 .Cos7細(xì)胞為本室保存 .脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000 及細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購自 Invitrogene 公司 .抗EBNA2抗體購自 Dako 公司， HRP標(biāo)記抗小鼠 IgG,FITC標(biāo)記抗小鼠 IgG購自博士德公司 .小量質(zhì)粒提取試劑盒、 DNA 膠回收試劑盒均購自華瞬生物工程

8、公司 .PCR試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶購自 TaKaRa公司 .根據(jù)GenBank中 EBNA2基因的序列，設(shè)計(jì) 2 條引物：引物 2 的 5端加入Xho位點(diǎn)，引物 1 和引物 2 用于擴(kuò)增 EBNA2基因的 3端部分（ EBNA2b）.引 物 1 ： 5 CTCGGGGCCACCATGGTGGC3； 引 物 2:5 CGCCTCGAGTTACTGGATGGAGGGG3.1.2 方法1.2.1EBNA2基因的克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建EcoR/Bgl/Sal三酶切質(zhì)粒pSG5EBNA2，膠回收4.0kb 大小片段，將回收片段插入經(jīng)EcoR/BamH雙酶切開的 pBluscript（-）載體中，命

9、名為 pBSSKEBNA2.以 pSG5EBNA2為模板，用引物1 和引物 2 進(jìn)行常規(guī) PCR反應(yīng)，擴(kuò)增EBNA2基因的 3部分 EBNA2b.PCR反應(yīng)條件：于 94變性 5min 后，按下列參數(shù)循環(huán) 35 次：即 94變性 30s，60退火 30s，72延伸 30s，最后于 72延伸 7min.PCR產(chǎn)物克隆到 pMD18T 載體中， Nco/Xho酶切鑒定陽性克隆，命名為 pMDEBNA2b用. Nco/Xho從 pMDEBNA2b中切下EBNA2b 片段插入用Nco/Xho切開的pBSSKEBNA2載體pBSSKEBNA2a中， Nco單酶切和 EcoR/Xho雙酶切鑒定，命名為pB

10、SSKEBNA2（ a+b ） .pCMVEBNA2 用 EcoR /Xho 雙 酶 切 質(zhì) 粒pBSSKEBNA2（a+b），回收 1500bp 片段，將其插入 EcoR/Xho切開的 pCMVHA載體中，酶切鑒定陽性克隆，命名為 pCMVEBNA2.1.2.2EBNA2表達(dá)的檢測 WesternblotCos7 細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前1d 接種于直徑60mm中 皿 ， 接 種4105 個(gè) 細(xì) 胞 , 接 種16h后 ， 應(yīng) 用LipofectamineTM200010轉(zhuǎn)L染質(zhì)粒 pCMVEBNA24 g.轉(zhuǎn)染 60h 后裂解細(xì)胞 收集蛋 白 上清， 加入2加 樣 緩 沖液 ， 煮 沸5min. 然

11、后 進(jìn)行120g/LSDSPAGE電泳，于 180mA 穩(wěn)壓狀態(tài)下轉(zhuǎn)膜3h.于室溫用 20g/L 蛋白干粉封閉 1h 后，一抗 antiEBNA2（11000）4過夜 .PBST洗滌 3 次，每次 5min.二抗抗鼠 IgGHRP（14000）室溫作用 1h，同上洗滌后，進(jìn)行放射性顯影 . 免疫熒光 Cos7細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前 1d 接種于直徑 60mm 中皿，于皿底事先加入圓形玻片， 轉(zhuǎn)染過程同上，對照組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pCMVHA. 轉(zhuǎn)染 60h 后取出爬有細(xì)胞的玻片， PBS洗滌 3 次，每次 5min；10g/LBSA37封閉 1h；一抗 antiEBNA2（1200）37避光濕盒中染色 1h；同上洗滌；二抗抗鼠 IgGFITC（1500）37避光濕盒中染色 1h；同上洗滌后，熒光顯微鏡觀察 .1.2.3 共轉(zhuǎn)