苜蓿中華根瘤菌.doc

1、苜蓿中華根瘤菌天藍(lán)苜蓿共生固氮體系對(duì)銅脅迫的響應(yīng)及抗銅工程菌構(gòu)建本研究利用苜蓿中華根瘤菌 (Sinorhizobium meliloti)CCNWSX0020 具有重金屬銅抗性這一特性,將S.melilotiCCNWSX002天藍(lán)苜蓿共生固氮這一重要的生理過(guò)程與銅污染土壤的修復(fù)治理相結(jié)合 , 從植物自身抗氧化酶系統(tǒng)響應(yīng)的角度研究接種 S.meliloti CCNWSX0020 提高植物銅耐受性的機(jī)理 , 并進(jìn)一步探索該共 生固氮體系在重金屬污染土壤修復(fù)中的實(shí)際應(yīng)用潛力。盆栽條件下 , 將 S.melilotiCCNWSX 00及其宿主植物天藍(lán)苜蓿建立適宜的生長(zhǎng)條件和有效的共生體系,并篩選確定2

2、00 mg kg-1 Cu2+為合適的銅脅迫濃度。結(jié)果表明,200 mg kg-1 Cu2+ 脅迫處理對(duì)植物生長(zhǎng)與結(jié)瘤均造成顯著的抑制 作用, 而接種 S.meliloti CCNWSX0020 在不同程度上提高了植物的生物量、株高 以及總氮含量。與不接菌的植物相比 , 接種 S.meliloti CCNWSX0020 的植物地上 部分和根部對(duì)銅的總吸收量分別顯著提高了 34.0%和 120.4%,表明接種 S.meliloti CCNWSX0020 的天藍(lán)苜蓿根部能夠耐受更高濃度的銅脅迫 , 這也顯示 了該共生固氮體系在植物固定技術(shù)中的應(yīng)用潛力。通過(guò)對(duì)植物抗氧酶系統(tǒng)的測(cè)定分析 ,結(jié)果顯示,在

3、共生體系發(fā)育的不同階段 ,過(guò)量銅普遍提高了植物體內(nèi)丙二醛(MDA的含量,并且這種提高作用在不接菌的 植物中表現(xiàn)地更為顯著。與不接菌的植物相比 , 接種 S.meliloti CCNWSX0020 的 植物在接菌后8天,13天,18天地上部分和根部的MDA含量均顯著下降。接菌植物地上部分的超氧化物歧化酶(SOD)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)的 活性, 與不接菌植物相比 , 在不同時(shí)間段表現(xiàn)出顯著提高 ;同樣, 接菌植物根部的SOD過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽還原酶(GR)的活性也表現(xiàn)出不同程度的提高。 另外, 在銅脅迫條件下 ,接菌后植物根部的抗氧化酶基因 Cu Zn SODc、CuZn S

4、ODp、 CAT APX和GR都表現(xiàn)出普遍上調(diào),在接菌植物的地上部分也有類(lèi)似的結(jié)果,即Cu Zn SODc Cu Zn SODp CAT和APX也表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)。不同處理下植物體內(nèi)的各抗氧化酶活性及其基因表達(dá)均隨著共生體系不同 的發(fā)育階段表現(xiàn)出較大的波動(dòng) , 而接種 S.meliloti CCNWSX0020 表現(xiàn)出對(duì)植物抗 氧化酶系統(tǒng)響應(yīng)銅脅迫過(guò)程中的促進(jìn)作用。 根瘤菌對(duì)豆科植物生長(zhǎng)的促進(jìn)除了通 過(guò)固氮作用之外 ,部分根瘤菌還表現(xiàn)出促植物生長(zhǎng)特性 ,例如產(chǎn)生吲哚 -3- 乙酸 (Indole-3-acetic acid,IAA) 鐵載體 溶磷作用 ACC(1-aminocyclopropra

5、ne-1-carboxylate) 脫氨酶活性等。其中,ACC脫氨酶已在許多微生物中得到分離和鑒定,具有ACC兌氨酶活性的 促植物生長(zhǎng)細(xì)菌 (Plant growth-promoting bacteria,PGPB) 能夠通過(guò)降低因環(huán)境 脅迫造成的植物體內(nèi)乙烯含量的增加 , 從而緩解植物受到的不良反應(yīng) , 提高植物 的抗逆性。然而,ACC脫氨酶在根瘤菌中表達(dá)的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他自生的植物促 生菌,盡管已證實(shí)根瘤菌中的ACC脫氨酶對(duì)豆科植物的結(jié)瘤固氮起到一定的促進(jìn) 作用, 但低水平的酶活性可能不足以應(yīng)對(duì)因外界不良環(huán)境造成的植物體內(nèi)的乙烯 脅迫。因此，為進(jìn)一步加強(qiáng)S.melilotiCCNWSX00

6、2天藍(lán)苜蓿這一共生體系在重金屬污染土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用價(jià)值 , 通過(guò)三親本雜交的方法將能夠表達(dá)高水平 ACC脫氨酶活性的植物促生菌 Pseudo mon asputida UW牟勺ACC脫氨酶基因acd S 轉(zhuǎn)入到S.meliloti CCNWSX0020中,構(gòu)建可以過(guò)量表達(dá)ACC脫氨酶活性的工程菌 S.meliloti CCNWSX0020(p RKACC)。酶活性測(cè)定結(jié)果顯示 S.melilotiCCNWSX0020(p RKACC)ACC脫氨酶活性是野生型菌株的12.6倍與接種野生型菌株相比,接種S.meliloti CCNWSX0020(p RKACC),或同時(shí)接種野生菌 S.meli

7、loti CCNWSX0020 和 P.putida UW4 均顯著提高了植物的生物量 及根長(zhǎng)。為進(jìn)一步研究高度銅脅迫對(duì)共生條件下的acd S表達(dá)量的影響，利用qRT-PCR寸 400 mgkg-1 Cu2+脅迫條件下，接種 S.meliloti CCNWSX0020(RKACC) 的植物地上部分和根部的 acd S 表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示 ,400 mg kg-1 Cu2+ 脅迫下的根部 acd S 的表達(dá)量較對(duì)照條件下的 根部acd S表達(dá)量提高了 4倍(4.02 0.27,n=3),而在地上部分沒(méi)有檢測(cè)到acd S 的表達(dá)。 這一結(jié)果與在過(guò)量銅脅迫條件下 , 接種 S.melilot

8、i CCNWSX0020(RpKACC) 的植物根部所產(chǎn)生的乙烯含量顯著下降相一致。通過(guò)對(duì)天藍(lán)苜蓿結(jié)瘤固氮的測(cè)定分析發(fā)現(xiàn) , 盡管在 200 mg kg-1 Cu2+ 的中度 脅迫條件下，接種S.meliloti CCNWSX0020(p RKACC)表現(xiàn)出對(duì)植物根瘤鮮重的提 高作用,但對(duì)其根瘤數(shù)目及固氮酶活性并沒(méi)有明顯的影響 ,相應(yīng)地,植物地上部分 和根部的總N含量也沒(méi)有明顯變化，這也表明過(guò)量表達(dá)ACC兌氨酶的根瘤菌對(duì)植 物生長(zhǎng)的促進(jìn)并不是通過(guò)固氮作用提高植物氮素營(yíng)養(yǎng)而實(shí)現(xiàn)的。另外 ,與接種野 生型菌株的植物相比，接種S.meliloti CCNWSX0020(p RKACC)顯著提高了植物

9、地 上部分和根部對(duì)銅的總吸收量 , 但同時(shí)又降低了植物根部向地上部分對(duì)銅的轉(zhuǎn)運(yùn) 系數(shù)。這顯示出S.meliloti CCNWSX0020(p RKACC)-天藍(lán)苜蓿共生體系在植物固定 技術(shù)中的實(shí)際應(yīng)用潛力 , 降低因水土流失、土壤侵蝕而導(dǎo)致有毒重金屬向食物鏈 轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。基于 q RT-PCR對(duì)植物抗氧化酶基因(Cu Zn SODc Cu Zn SODp Fe SOD Mn SOD CAT APX和GR的表達(dá)情況分析顯示，在400 mg kg-1 Cu2+脅迫 下，接種 S.melilotiCCNWSX0020RKACC的植物地上部分 CuZn SOD、Fe SODCAT和APX勺表達(dá)量表現(xiàn)出略微的上調(diào),在根部也均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá),并且在銅脅迫條件下表現(xiàn)地更為顯著,即在400 mg