Western Blot檢測 SOP(待改)

1、-作者xxxx-日期xxxxWestern Blot檢測 SOP(待改)【精品文檔】Western Blot檢測 SOP1 目的 為了使生產(chǎn)活動正常進行，特制定本規(guī)程。2 范圍 適用于Western Blot檢測工作人員的生產(chǎn)活動。3 責(zé)任 生產(chǎn)部門組織制定和實施，行政部負責(zé)監(jiān)督。4 程序 4.1 WB檢測原理蛋白質(zhì)印跡(Western blot)，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。WB采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)

2、，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。 4.3 細胞和組織裂解液制備標(biāo)準(zhǔn)流程 .1 貼壁細胞: 去除培養(yǎng)基，用冰冷的的PBS洗三次， 6孔板加50-100ul EBC裂解液，直徑10cm平皿或25cm2(T25)培養(yǎng)瓶加200-400ul裂解液，一般加200ul合適，用細胞刮使裂解液與細胞充分接觸（通常裂解液接觸細胞1-2秒后，細胞就會裂解），再將刮下的裂解液收集于離心管中。.2 懸浮細胞:離心收集細胞，用冰冷的PBS洗

3、三次，每次5ml左右，用手指輕彈收集細胞管管壁，使細胞均勻散開，1000-2000rpm離心根據(jù)細胞壓積每100ul加1ml裂解液，再用手輕彈細胞管管壁，使裂解液與細胞充分接觸，以便于充分裂解細胞。.3 組織：分析天平準(zhǔn)確稱取組織，將組織用PBS清洗干凈，按照1g組織加10ml裂解液（Tissue lysis buffer）的比例加入適量裂解液并將組織剪碎，轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中，研磨1020min，直到將組織充分磨碎，將研磨液轉(zhuǎn)移到離心管中。.4 將收集出來的裂解液于冰浴(冰盒)中置搖床上孵育2小時，待細胞充分裂解后，13000rpm離心15min，小心取上清（避免殘渣和脂肪），重復(fù)一次（除盡殘

4、渣，殘渣內(nèi)含大量DNA,RNA）加入6x loading buffer（上樣緩沖液），煮沸(5-10min)，分裝，于-80冰箱長期貯存。（一般可貯存1-2年）.5 蛋白定量與質(zhì)控，采用酶標(biāo)儀定量，然后蛋白電泳考馬斯亮藍染色觀察條帶是否清晰，有拖帶或條帶不完整的應(yīng)丟棄。根據(jù)電泳也可目測蛋白濃度。4.4 WB檢測標(biāo)準(zhǔn)流程4.4.1 制備SDS-PAGE膠視蛋白分子大小來選擇不同的膠濃度，通常為6%-12% （分子量5-20KDa用雙層Tricine-SDS-PAGE小于5KDa用三層Tricine-SDS-PAGE配方見下表）；分子量15-30KDa，15% SDS-PAGE；分子量30-90K

5、Da ，12% SDS-PAGE；分子量60-120KDa ，10% SDS-PAGE；分子量90-120KDa，8% SDS-PAGE；分子量大于120KDa，6% SDS-PAGE）比例配制分離膠，加入異丙醇封閉，靜置10-20min（視溫度而定，一般手指輕壓短玻板，液面肉眼不見上升即聚合。室溫 15min已聚合，37 30KDa ，24V 18min 大分子根據(jù)凝膠濃度適當(dāng)延長時間)4. 染色步驟（可選）4. 洗膜3次，每次5min，輕搖4. 放入氨基黑染液中染色30sec，輕搖4. 在脫色緩沖液中脫色，換液幾次，輕搖，直到蛋白條帶清晰而背景變白。4. 如果馬上使用膜，保持膜的濕潤。也可

6、干燥后常溫下放置一年。干燥的膜使用前浸泡甲醇。4.4.4.5 封閉用PBST配制5%的脫脂奶粉（封閉液），每張膜加50ml左右封閉液，根據(jù)時間安排選擇放入電熱恒溫箱么37搖動封閉1-2h，或4過夜。一抗孵育用抗體稀釋液（5% 脫脂奶粉的PBST溶液）稀釋抗體至合適的倍數(shù)（細胞上清不稀釋，小鼠血清1：500、腹水1：1000、純化后腹水1：2000不等）；對于細胞上清1:1稀釋。將膜封至雜交袋中，加入稀釋后的抗體，根據(jù)時間安排37 1-2h或4溫孵育過夜。二抗孵育一抗孵育后將膜取出，PBST洗滌3次，每次5min左右。用抗體稀釋液（3%脫脂奶粉或的PBST溶液）稀釋二抗（羊抗鼠、羊抗兔）至合適倍

7、數(shù)（視購買二抗效價而定，現(xiàn)在使用的稀釋度為3萬倍稀釋）。將膜封至雜交帶中，加入稀釋后的抗體，室溫搖動孵育40min-2h左右。 X-光片顯影曝光將二抗孵育后的膜取出，洗滌3-5次，每次5min左右。將顯色A、B液按1：1放入EP管中，充分混勻，使之恢復(fù)至室溫；在膜上充分混勻AB混合液（一般每張膜400ulAB液），平鋪在玻璃紙上， X-光片壓入曝光暗盒，曝光幾秒至幾小時不等，視與AB液混合后的膜發(fā)出的熒光亮度而定（根據(jù)曝光經(jīng)驗而定，肉眼可見熒光壓片5-15s肉眼不可見，曝光1分鐘左右，若洗片后無條帶或條帶較淡適當(dāng)延長時間）。用顯影液浸泡10-20秒，清水沖洗，定影液沖洗10-20秒，再清水沖洗

8、洗凈晾干。4.5 工作難點和注意事項 SDS-PAGE凝膠制備.1 玻璃板檢漏 .2 按配方準(zhǔn)確配液 .3 灌膠過程避免產(chǎn)生氣泡 .4 壓膠液充分吸凈，插梳子過程避免產(chǎn)生氣泡4.5.2 電泳4.5. 電泳槽安裝過程避免漏液 4.5. 點樣過程勿串孔，點不同樣品時注意換槍頭。 4.5. 電泳時正負極安裝正確（紅正黑負或白正黑負） 4.5. 電泳之前查清楚目的蛋白大小，以確定所用凝膠濃度、電源電壓、時間等實驗條件（一般情況下，蛋白分子量越大，電泳時間越長，轉(zhuǎn)膜時間越長）。電泳過程若有漏液注意及時補滿 轉(zhuǎn)膜.1 PVDF膜用前用甲醇浸泡5分鐘，再用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡5分鐘 .2 所用的濾紙，纖維墊等用緩

9、沖液浸泡透 .3 從正極到負極按墊子-濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙-墊子的順序裝好。注意檢查正負極。每層之間用玻棒將其中的氣泡全部趕出.4 卡子夾好后不要錯位，避免PVDF膜-凝膠錯位.5 開始轉(zhuǎn)移時檢查電源正負極。 .6 轉(zhuǎn)膜過程冰浴 .7 PVDF膜全程都應(yīng)在液體中,避免膜干燥。對膜的各種操作都要帶手套、盡量輕柔，不能有任何刮痕。 4.5.4 一抗孵育用塑料雜交袋封閉一抗時，避免袋中有大量氣泡，以免一抗孵育不均勻。4.5.5 二抗孵育4.5. 注意二抗種屬需根據(jù)一抗確定4.5. 用塑料雜交袋封閉二抗時，避免袋中有大量氣泡，以免二抗孵育不均勻。 4.5. 二抗稀釋倍數(shù)可根據(jù)所選用的不同公司二

10、抗效價調(diào)節(jié)。 4.5.6 顯色曝光4.5. 在用化學(xué)發(fā)光底物顯色前需將膜上洗滌液吸干 4.5. 盡量避光，以免熒光快速猝滅 4.5. 曝光過程完全避光，曝光時間由發(fā)光強度而定，從3秒到幾個小時不定。4.5.7 裂解液制備4.5. 裂解液制備注意全程必須在冰上進行 4.5. 細胞或者組織使用前必須先用PBS洗干凈，比保證將血清等洗凈，盡量避免引入雜蛋白4.5. 洗滌完成后盡可能的吸干殘留的PBS 4.5. 保證裂解充分4.5. 離心后取上清要避免取到碎片沉淀和漂浮的脂類 4.5. 制備好的裂解液按200ul每管分裝，使用時避免反復(fù)凍融。4.6 WB相關(guān)溶液配制.1 30%聚丙烯酰胺丙烯酰胺29g

11、，N,N-二甲基甲叉雙丙烯酰胺1g，用去離子水定容至100ml，pH值不超過，過濾除菌，4棕色玻璃瓶貯存。有神經(jīng)毒，配置時需戴口罩，手套。.2 1.5mol/L, pH 8.8 Tris-HCl貯存液在80ml去離子水中溶解堿，加入濃HCl調(diào)節(jié)pH值至，加去離子水定容至100ml，分裝后高壓滅菌。.3 1.0mol/L, pH 6.8 Tris-HCl貯存液在80ml去離子水中溶解堿，加入濃HCl調(diào)節(jié)pH值至，加去離子水定容至100ml，分裝后高壓滅菌。.4 5 x Tris-甘氨酸緩沖液在900ml去離子水中溶解堿和72g甘氨酸，然后加入50ml 10%電泳級SDS溶液，加去離子水定容至1L

12、。.5 10%SDS溶液稱取10gSDS，加90ml超純水，68加熱溶解，加微量鹽酸調(diào)pH至中性，定容至100ml。注意佩戴口罩，致肺癌性。.6 10%APS溶液（過硫酸銨）稱取1gAPS，將加入9ml超純水，待溶解后定容至10ml，-20保存。.7 TEMED(四甲基乙二胺)分裝4保存4.6.8 轉(zhuǎn)膜緩沖液10 x轉(zhuǎn)膜：甘氨酸144g，Tris堿30g4.6.9 2xSDS加樣緩沖液100mmol/L Tris-HCl(pH6.8)，200mmol/L DTT或-巰基乙醇(臨用前加入)，4%SDS，0.02%溴酚蘭，20%甘油4.6.10 5xPBST2g KCl，2g KH2PO4,80g

13、 NaCl2HPO4,去離子水配制至2L，再加入5ml Tween-20 ，快速攪拌3-4h，室溫保存 封閉液5g脫脂奶粉，100ml 1xPBST，混勻，4保存 細胞裂解液EBC buffer：20mM Tris-HCl(pH8.0)，125mM NaCl，0.5%NP-40,20mM NaF， Na3VO4，2mM EDTA，高壓滅菌，4保存。臨用前加入DTT(1:1000),PMSF(1:200),COCKTAIL(1:100),EDTA(1:500)1mM EDTA，1mM DTT,1mM PMSF 組織裂解液50mM Tris (pH7.5)，650mM NaCl， 5%Triton-X100,50mM NaF，50mM NaPi(pH7.5)，50mM NaPPi(pH7.5)。臨用前加入DTT(1:1000), PMSF(1:200), COCKTAIL(1:100),EDTA(1:500)1mM EDTA，1mM DTT,1mM PMSF SDS-PAGE電泳緩沖液陰(負)極緩沖液： PH8.25 Tris： （）Tricin