碩士研究生開題報告

1、 皮膚是人體最大的器官，在抵御微生物入 侵，紫外線輻射以及防止水分的丟失、調 節(jié)體溫方面起重要作用，同時也是免疫系 統(tǒng)的組成部分之一 大面積度燒傷、廣泛瘢痕切除、外傷性 皮膚缺損以及皮膚潰瘍等導致的嚴重皮膚 缺損，特別是大面積度燒傷，傷及皮膚 全層及其附屬器，因而僅靠創(chuàng)面自身難以 實現(xiàn)皮膚的再生，需要足夠的皮膚替代物 進行修復。 雖然組織工程化皮膚是世界上第一種獲得 批準的組織工程產品，并在治療頑固性潰 瘍和嚴重燒傷患者方面取得很好的療效， 但是迄今未能合成還有皮膚附屬器（毛囊、迄今未能合成還有皮膚附屬器（毛囊、 汗腺、皮脂腺等）的皮膚。汗腺、皮脂腺等）的皮膚。 目前尚無一種人工皮膚能完全滿足

2、創(chuàng)面修 復在功能上的需要，存在一個共同問題是 均不能重建毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附均不能重建毛囊、汗腺、皮脂腺等皮膚附 屬器屬器降低了皮膚對環(huán)境的適應能力，如 何實現(xiàn)皮膚的功能重建成為當前創(chuàng)傷修復 的研究熱點。 隨著干細胞理論技術的發(fā)展，給重建皮膚 創(chuàng)傷組織解剖結構的同時恢復其生理功能 帶來希望。 干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞，胚 胎干細胞由于涉及倫理學的問題，目前大 規(guī)模的基礎研究和臨床應用受到一定限制， 因此成體干細胞的研究備受重視。 骨髓間充質干細胞（骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem mesenchymal stem cells, MSCs)cells, MSCs)

3、 具有自我更新與多向分化潛 能，在一定條件下，可以分化為同胚層的 骨、軟骨、脂肪、心肌細胞以及肝細胞等， 也可以跨胚層分化為肺上皮細胞、腸上皮 細胞、神經細胞以及表皮細胞等。 1. 取材方便，分離培養(yǎng)技術簡單。 2. 具有高度增殖的特性，并且體外培 養(yǎng)時，保持了生物學特性的穩(wěn)定。 3. 體外擴增以及導入外源性基因相對 方便。 4. 可以通過骨髓穿刺取自自體，因而 由它誘導來的組織在進行移植時不 存在組織配型及免疫排斥的問題。 已有研究證實MSCsMSCs經自體移植作用于 創(chuàng)面局部后，在皮膚微環(huán)境中分化為 血管內皮細胞、表皮細胞和皮脂腺導 管細胞。 因此，MSCsMSCs在將來皮膚創(chuàng)傷修復的實

4、際應用中具有潛在的優(yōu)勢，特別是跨 胚層的分化潛能促使人們探討能否利 用骨髓間充質干細胞的誘導分化來完 整重建皮膚的解剖結構和生理功能。 大多數(shù)人的觀點認為MSCs的分化與其所處 的微環(huán)境微環(huán)境“壁龕壁龕”密切相關，不同的組織 細胞微環(huán)境有著不同的細胞因子，可能是 誘導MSCs獲得靶組織的表型，并向不同細 胞譜系分化的主要原因之一。 但是近來有人認為以前有關MSCs轉化為不 同胚層細胞的現(xiàn)象可能是由于干細胞與所 處的環(huán)境中細胞發(fā)生融合所致，但是這種 質疑一方面不能解釋在體外比較單一的條 件下，誘導MSCs向骨、軟骨以及神經等細 胞分化的現(xiàn)象，同時質疑者本身也認為融 合現(xiàn)象發(fā)生率比細胞發(fā)生轉化的發(fā)

5、生率更 低，因而不能完全用細胞融合來解釋。 MSCs體外培養(yǎng)時保持干細胞的特性自 身不斷的增殖，在不同的誘導條件下 能夠向不同的譜系分化，為重建皮膚 的解剖結構和生理功能帶來了希望。 因此，研究利用MSCs與毛囊共培養(yǎng)來 誘導MSCs分化來重建毛囊、汗腺、皮重建毛囊、汗腺、皮 脂腺的生理功能脂腺的生理功能，從而完整重建皮膚完整重建皮膚 的解剖結構和生理功能的解剖結構和生理功能，探討MSCs在 皮膚組織損傷修復過程中的作用及其 機理，為皮膚組織的修復重建開辟新 的思路。 1. 觀察MSCs與毛囊聯(lián)合培養(yǎng)后的不同 時期MSCs的形態(tài)學變化。 2. 研究MSCs與毛囊聯(lián)合培養(yǎng)后，MSCs 經誘導以后

6、不同時期細胞表型的變 化及細胞表型的轉化率。 3. 研究MSCs與毛囊聯(lián)合培養(yǎng)后，比較 誘導前后向MSCs毛囊分化過程中相 關表達相關蛋白的變化。 1. MSCs的培養(yǎng)、形態(tài)學觀察以及繪制 生長曲線，MSCs的鑒定及標記 2. 毛囊的器官培養(yǎng)、形態(tài)學以及組織 學觀察 3. MSCs與毛囊聯(lián)合培養(yǎng)后，觀察MSCs 經誘導后的細胞形態(tài)學的變化以及 測定細胞活力 4. 觀察MSCs經誘導后細胞表型的變化 及計算細胞轉化率 5. 研究MSCs經誘導后向毛囊分化過程 中蛋白質表達的變化 1. 成功完成MSCs與毛囊聯(lián)合培養(yǎng) 2. 確定向毛囊、汗腺、皮脂腺定向轉 化的干細胞類別。 3. 探討分別將其移植于

7、人造皮膚上構 建含有皮膚附屬器（毛囊、汗腺、 皮脂腺等）的人工皮膚。 MSCs的培養(yǎng)、形態(tài)學觀察以及鑒定毛囊的器官培養(yǎng) MSCs的標記以及標記物的檢測選取生長明顯的毛囊（24h0.1mm） MSCs與毛囊的聯(lián)合培養(yǎng)與毛囊的聯(lián)合培養(yǎng) 免疫細胞化學雙染色 法檢測共培養(yǎng)的細胞 MSCs細胞表型的變 化及細胞表型轉化率 MSCs細胞形態(tài)學的變化 及細胞活力的檢測 100gWistar雄性大鼠 頸椎脫臼法處死 取出股骨和脛骨 無菌條件下 DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔 剪去股骨及脛骨的骨骺端 取沖出的細胞懸液約2mL 37、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 10%FCS的DMEM中 1：2消化傳代 每2-3d換液1次 取

8、第三代取第三代 CD29、CD44、CD105免疫細胞化學染色免疫細胞化學染色 取第3代MSCs，待細胞融合為50%-60% 時，向培養(yǎng)液中加入BrdU (終濃度 5molL)，置37、5%CO2孵育箱 內培養(yǎng) 每兩天換一次液，同時加入新的BrdU 直至MSCs融合 免疫細胞化學法行BrdU檢測。 Wistar雄性大鼠的觸須部皮膚 無菌條件下取上述同一只 D-Hanks液連續(xù)沖洗3遍，每遍3-5分鐘 顯微外科器械分離出毛囊 解剖顯微鏡下用眼科剪刀和 小心移入24孔培養(yǎng)板中，每孔1根 選取完整無損傷的生長期毛囊 每孔加入培養(yǎng)液0.5ml 在37、5%CO2孵育箱內培養(yǎng) 將標記好的MSCs細胞懸液

9、移入24孔培 養(yǎng)板中，每孔0.5ml，然后選取培養(yǎng) 24h后生長明顯的毛囊（0.1mm）移 入此培養(yǎng)板中，共移入12根，每孔一 根，分成“毛囊組”和“對照組”， （共培養(yǎng)6組，“毛囊組”和“對照 組”各3組），每2-3天換液一次 倒置顯微鏡下觀察毛囊的生長情況和 MSCs的形態(tài)學變化，并測定細胞活力。 分別在誘導后3、7、10、15d用免疫細胞化免疫細胞化 學雙染色法學雙染色法檢測共培養(yǎng)的細胞，觀察“毛 囊組”與“對照組”BrdUBrdU與與K15K15、BrdUBrdU與與 K19K19和BrdUBrdU與與11整合素整合素分別共表達的情況， 以PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色，在 20

10、0倍光學顯微鏡下觀察,細胞膜1整合素 和細胞質K15、K19免疫組化染色后呈棕黃 色BrdU染核為藍黑色。“毛囊組”與“對 照組”BrdU與K15、BrdU與K19和BrdU與1 整合素雙染色細胞計數(shù)，結果以雙染色陽雙染色陽 性細胞百分率性細胞百分率表示，比較不同時相細胞 BrdU與K15、BrdU與K19和BrdU與1整合素 雙染色細胞中陽性表達情況。 數(shù)據以均數(shù) 標準差表示,毛囊組 與對照組之間采用t檢驗,P0.01為差 異具有顯著統(tǒng)計學意義. 用SPSS10.0 軟件進行方差分析. 1. 本實驗室有成功培養(yǎng)骨髓間充質干細胞的 工作基礎，可以順利成功培養(yǎng)骨髓間充質 干細胞。 2. 本實驗室

11、具有多年從事皮膚組織工程的基 礎，可以成功的完成毛囊的取材和培養(yǎng)。 3. 本實驗室具備完備的組織培養(yǎng)和顯微解剖 的設備，可以完成此項工作。 4. 經費預算: 文獻檢索:100元 實驗動 物:300元 實驗藥品:2600元 裝訂論 文:500元 其它:200元 合計:3900元 通過研究MSCs與毛囊聯(lián)合培養(yǎng)后的不 同時期MSCs的形態(tài)學變化，探討MSCs 經誘導以后不同時期細胞表型的變化 以及細胞表型轉化率如何，國內外未 見報道。 通過比較誘導前后MSCs向毛囊分化過 程中蛋白質表達的變化，國內外未見 報道。 2005.092006.04 綜述 2006.052006.11 開題報告、預 實驗

12、 2006.122007. 7 細胞培養(yǎng)以及相 關指標的檢測 2007.8-2008.6 總結資料、寫論文 及答辯 成功培養(yǎng)誘導前MSCs，細胞接種后12h可見少數(shù)細 胞開始貼壁生長，細胞形態(tài)成梭形，懸浮在溶液 中的細胞呈圓形，主要是造血細胞和造血干細胞。 24h后首次換液，去除非貼壁細胞，3天后細胞增 殖加快，呈集落樣迅速生長，7天后細胞達到80% 融合，傳代采用12，每3天傳1次，隨著傳代次 數(shù)的增加而逐漸達到純化的目的。 成功培養(yǎng)毛囊，通過倒置顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)培 養(yǎng)第1天大部分毛囊開始生長，表現(xiàn)為毛囊逐漸延 長，毛干及內、外根鞘的共同生長，毛囊的生長 延長主要集中在前4天，到第7天后部

13、分毛囊開始 貼壁，可見真皮鞘成纖維樣細胞和上皮樣細胞從 毛囊的上端或中下端長出，逐漸向周圍擴散，呈 鋪路石樣外觀；到第10天以后毛囊大部分貼壁， 生長緩慢，基本無變化。 誘導后MSCs的形態(tài)。誘導前MSCs呈成纖維 細胞樣，誘導后形態(tài)發(fā)生變化，3天可見細 胞趨向于多角形，隨著時間的延長呈現(xiàn)卵 圓形或梭形，到15d時開始出現(xiàn)圓形細胞以 及梭形的集落形成，有一定的增殖分化能 力。 4、誘導前、后MSCs免疫細胞化學比較， “毛囊組” MSCs1整合素，K15、K19 表 達明顯高于“對照組”，統(tǒng)計學處理數(shù)據， P0.01，有顯著的統(tǒng)計學意義。 實驗儀器：CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、 超凈工作臺、顯微