活性檢測27日PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1 活性檢測活性檢測27日日 AKP,AKP,大腸桿菌堿性磷酸酶大腸桿菌堿性磷酸酶 ( (大腸桿菌堿性磷酸酯酶，大腸桿菌堿性磷酸酯酶，EC.3.1.3.1) EC.3.1.3.1) 在堿性環(huán)境下在堿性環(huán)境下: : 水解多種磷酸單酯化合物水解多種磷酸單酯化合物 需要鎂和錳離子為激活劑需要鎂和錳離子為激活劑 (E.coli alkaline phosphatase） 第1頁/共32頁 沉降系數(shù)沉降系數(shù)(單體單體)6.0 at pH8.0 沉降系數(shù)沉降系數(shù)(二聚體二聚體)6.2S 沉降系數(shù)沉降系數(shù)(四聚體四聚體)9.6S 固有粘度固有粘度3.4cm3/g 電泳遷移率電泳遷移率3.310-5cm

2、2/V sec at pH7.6 等電點(diǎn)等電點(diǎn)pH 4.5 等離子點(diǎn)等離子點(diǎn)pH 6.3 摩擦比率摩擦比率1.05 MWw(67-98)103 at pH8.0 MWz(88-99)103 at pH8.0 MWZ+1(86-110)103 at pH8.0 吸光率吸光率(278nm for 1mg/ml)0.72 激活劑激活劑Mg2+，Mn2+，Zn2+，Ca2+ 抑制劑抑制劑氰化物氰化物, 焦磷酸鹽焦磷酸鹽 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性85加熱加熱30分鐘仍保留活分鐘仍保留活 性，性，Mg2+存在時(shí)可增加酶存在時(shí)可增加酶 的熱穩(wěn)定性的熱穩(wěn)定性 第2頁/共32頁 第3頁/共32頁 405nm405nm有

3、特征吸收有特征吸收 本實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)410nm410nm測定測定ODOD值值 pNPPpNPP（對硝基酚磷酸）（對硝基酚磷酸） 無色無色 PiPipNP pNP （對硝基酚）（對硝基酚） 黃色黃色 Na3PO4 比爾比爾-朗伯定律：朗伯定律：OD = LC pNP=17500L mol-1 cm-1 C:光吸收物質(zhì)的濃度（ 光吸收物質(zhì)的濃度（molL-1） L:光路長度（光路長度（cm） 第4頁/共32頁 （其中（其中n n為稀釋倍數(shù)）為稀釋倍數(shù)）酶活力單位數(shù)酶活力單位數(shù) 175. 0 100 410 nOD 注注: :通過調(diào)整稀釋倍數(shù)控制通過調(diào)整稀釋倍數(shù)控制ODOD410 410在 在0.10.

4、10.80.8之之 間間 3030反應(yīng)反應(yīng)10min10min 加入加入3.6ml3.6ml終止液終止反應(yīng)終止液終止反應(yīng) 于于410nm410nm處測定吸光值處測定吸光值 4040 L L酶液酶液360360L L測活液測活液+ + 第5頁/共32頁 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 第6頁/共32頁 第7頁/共32頁 組別組別 空白空白 零對照零對照 空載體表達(dá)空載體表達(dá) 陰性對照陰性對照 ( (藍(lán)斑藍(lán)斑) ) pETBlue-AKPpETBlue-AKP 陽性對照陽性對照 AKPAKP表達(dá)表達(dá) 粗勻漿粗勻漿上清上清粗勻漿粗勻漿上清上清 勻漿液（勻漿液（uLuL）40400 00 00 00 00 0 粗勻

5、漿（粗勻漿（uLuL）0 0404040400 040400 0 離心上清離心上清 （uLuL） 0 00 00 040400 04040 測活液（測活液（uLuL） 360360360360360360360360360360360360 室溫反應(yīng)室溫反應(yīng)10min10min 終止液（終止液（mLmL） 3.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.63.6 ODOD410 410 酶的活力酶的活力 第8頁/共32頁 第9頁/共32頁 u自然膠電泳；自然膠電泳； u變性膠電泳變性膠電泳 u等電聚焦等電聚焦 u梯度膠電泳梯度膠電泳 u印跡轉(zhuǎn)移電泳印跡轉(zhuǎn)移電泳 u雙向電泳雙向電

6、泳 SDS-PAGE變性膠電泳用途：變性膠電泳用途： 亞基分子量的測定，變性蛋白的分離，蛋白純化中的質(zhì)量控制亞基分子量的測定，變性蛋白的分離，蛋白純化中的質(zhì)量控制 等等 凝膠電泳的分類：凝膠電泳的分類： 第10頁/共32頁 丙烯酰胺丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺 TEMED (TEMED (加速劑加速劑) ) APS (APS (過硫酸銨過硫酸銨, ,催化劑催化劑 ) ) 聚丙烯聚丙烯 酰胺凝膠酰胺凝膠 T T分離范圍（分離范圍（KD)KD) . . . . T：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的總濃度：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的總濃度 -改變改變T值改變膠孔徑值改變膠孔徑 一般按一般按a:b = 2

7、9:1 或或a:b = 29.2 ：0.8配制儲液配制儲液 a：丙烯酰胺的量：丙烯酰胺的量 b：甲叉丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺 m：溶液的總體積：溶液的總體積 C：表示交聯(lián)劑所占百分比：表示交聯(lián)劑所占百分比a+ba+b T T = = m m * * 100% 100% C C b b a+b a+b * * 100% 100% = = 第11頁/共32頁 第12頁/共32頁 GlyGly 、 、 PrPr 、ClCl 分離膠分離膠 pH 8.8pH 8.8（12%12% ） Tris-Gly pH 8.3Tris-Gly pH 8.3 Tris-Gly pH 8.3Tris-Gly pH 8.3

8、 濃縮后的樣品濃縮后的樣品 濃縮膠濃縮膠 pH 6.8pH 6.8（4%4% ） 未濃縮的樣品未濃縮的樣品 第13頁/共32頁 第14頁/共32頁 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 第15頁/共32頁 第16頁/共32頁 6 6、電泳、電泳 第17頁/共32頁 1). 1). 染色：染色： 將膠置于將膠置于20mL20mL的的R250R250染色液染色液中染色中染色2h2h 3). 3). 脫色：脫色： 將膠轉(zhuǎn)移至將膠轉(zhuǎn)移至20mL20mL的的脫色液脫色液中脫色中脫色1.5h1.5h，以目的條以目的條 帶清晰顯示為準(zhǔn)帶清晰顯示為準(zhǔn) 3). 3). 觀察結(jié)果：觀察結(jié)果： 凝膠成像儀照相并保存結(jié)果凝膠成像儀照相并

9、保存結(jié)果 4). 4). 膠的保存：膠的保存： 將膠轉(zhuǎn)移至將膠轉(zhuǎn)移至20mL20mL的的保存液保存液中，可常溫保存很長時(shí)中，可常溫保存很長時(shí) 間。間。 7 7、染色、脫色與保存、染色、脫色與保存 第18頁/共32頁 空載體空載體 離心后離心后 離心前離心前 M M Kd Kd 9797 6666 5353 3636 1414 第19頁/共32頁 第20頁/共32頁 n 印跡印跡(blotting)(blotting)是是7070年代中后期出現(xiàn)的一種生化技術(shù)年代中后期出現(xiàn)的一種生化技術(shù) n 印跡類似于吸墨跡的過程印跡類似于吸墨跡的過程 n 它常需要和各種凝膠電泳、轉(zhuǎn)移、固定化、分子雜交它常需要和

10、各種凝膠電泳、轉(zhuǎn)移、固定化、分子雜交 及許多靈敏的檢測技術(shù)相匹配而進(jìn)行及許多靈敏的檢測技術(shù)相匹配而進(jìn)行 n 廣泛應(yīng)用于廣泛應(yīng)用于DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)、抗原、受體糖蛋白等、蛋白質(zhì)、抗原、受體糖蛋白等 多種生物大分子的研究多種生物大分子的研究 電泳電泳 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 固定固定/ /封閉封閉 抗體結(jié)合抗體結(jié)合 檢測檢測 第21頁/共32頁 P1:P1:凝膠電泳凝膠電泳 P2:P2:轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜( (印記）印記） P3:P3:封閉封閉 P4:P4:結(jié)合一抗結(jié)合一抗 P5:P5:結(jié)合酶標(biāo)二抗結(jié)合酶標(biāo)二抗 P6:P6:顯色顯色 第22頁/共32頁 1）印記方式：）印記方式： 虹吸作用轉(zhuǎn)移虹吸作用轉(zhuǎn)移

11、 電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移 真空轉(zhuǎn)移真空轉(zhuǎn)移 斑點(diǎn)斑點(diǎn)/狹縫印記狹縫印記 2）膜與蛋白結(jié)合方式）膜與蛋白結(jié)合方式： 半干式轉(zhuǎn)移裝置半干式轉(zhuǎn)移裝置 濾紙濾紙 凝膠凝膠 NCNC膜膜 P2:P2:轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜( (印記）印記） 3）膜的種類）膜的種類：硝酸纖維素膜（：硝酸纖維素膜（ 第23頁/共32頁 印跡在印跡在NCNC膜上的特異抗原的檢出依賴于抗原抗體親和反應(yīng)。一膜上的特異抗原的檢出依賴于抗原抗體親和反應(yīng)。一 般經(jīng)過封閉、一抗結(jié)合、二抗結(jié)合、顯色等步驟。般經(jīng)過封閉、一抗結(jié)合、二抗結(jié)合、顯色等步驟。 一抗一抗對抗原是特異的。酶標(biāo)二抗是商品化的，對某種動(dòng)物的一對抗原是特異的。酶標(biāo)二抗是商品化的，對某種動(dòng)物的一 抗

12、都可以反應(yīng)。抗都可以反應(yīng)。 二抗二抗常用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、熒光素、生物素、同常用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、熒光素、生物素、同 位素等標(biāo)記。辣根過氧化物酶的底物有位素等標(biāo)記。辣根過氧化物酶的底物有DABDAB（二氨基聯(lián)苯氨）（二氨基聯(lián)苯氨） ，OPD(OPD(鄰苯二氨）等鄰苯二氨）等 P4-P6:P4-P6:結(jié)合一抗，結(jié)合酶標(biāo)二抗，顯色結(jié)合一抗，結(jié)合酶標(biāo)二抗，顯色 第24頁/共32頁 膜膜 蛋白蛋白 一抗一抗 HRP HRP HRP HRP 酶標(biāo)二抗酶標(biāo)二抗 H H2 2O ODAB-HDAB-H+ +H H2 2O O2 2DABDAB+ + 顯色顯色 (四甲基二氨基聯(lián)苯氨四甲基二

13、氨基聯(lián)苯氨) 1. 陰性對照陰性對照 2. 實(shí)驗(yàn)組勻漿實(shí)驗(yàn)組勻漿 4. 陽性對照陽性對照 3. 實(shí)驗(yàn)組上清實(shí)驗(yàn)組上清 1 2 3 4 第25頁/共32頁 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作 第26頁/共32頁 P1:P1:凝膠電泳凝膠電泳 P2:P2:轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜( (印記）印記） P3:P3:封閉封閉 P4:P4:結(jié)合一抗結(jié)合一抗 P5:P5:結(jié)合酶標(biāo)二抗結(jié)合酶標(biāo)二抗 P6:P6:顯色顯色 第27頁/共32頁 半干式轉(zhuǎn)移裝置半干式轉(zhuǎn)移裝置 濾紙濾紙 凝膠凝膠 NCNC膜膜 非特異結(jié)合非特異結(jié)合 第28頁/共32頁 6.6. 一抗結(jié)合一抗結(jié)合：倒去倒去封閉液，封閉液， 加入一抗（加入一抗（ 1xPBS 1xPBS

14、按按1 1：100100稀釋稀釋） 37370 0C C輕輕搖動(dòng)輕輕搖動(dòng)，孵育，孵育60min60min 7.7. 漂洗漂洗：1xPBS1xPBS清洗清洗3 3次次( (每次漂洗每次漂洗5min)5min) 8.8.二抗結(jié)合二抗結(jié)合：按按 1 1：10001000稀釋二抗（偶聯(lián)辣根過氧化物酶）稀釋二抗（偶聯(lián)辣根過氧化物酶） 37370 0C C輕輕搖動(dòng)輕輕搖動(dòng)，孵育，孵育60min60min 9.9.漂洗漂洗： 1xPBS1xPBS清洗清洗3 3次次( (每次漂洗每次漂洗5min)5min) 10.10.顯色顯色： 用顯色液顯色至出現(xiàn)清晰條帶，用顯色液顯色至出現(xiàn)清晰條帶， 加水加水沖洗終止顯色反應(yīng)沖洗終止顯色反應(yīng) 第29頁/共32頁 6. 6. 到去封閉液，加入到去封閉液，加入1xPBS1xPBS稀釋的一抗（稀釋的稀釋的一抗（稀釋的 倍數(shù)為倍數(shù)為ELISAELISA所測效價(jià)的所測效價(jià)的1/101/10），加入的一抗工作），加入的一抗工作 液覆蓋住膜即可。液覆蓋住膜即可。370C370C輕輕搖動(dòng)，孵育輕輕搖動(dòng)，孵育45min45min 7. 1xPBS7. 1xPBS清洗清洗3 3次后