ELISA的原理與應用

1、ELISA ELISA 知識簡介知識簡介 03/11/15 12021/3/27 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 1.ELISA的原理的原理 2.ELISA的類型的類型 3.試劑準備試劑準備:免疫吸附劑免疫吸附劑 結合物結合物 酶底物的準備酶底物的準備 4.對照設定對照設定 5.標本的采取和保存標本的采取和保存 6.結果判斷結果判斷 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 ELISA ELISA是一種免疫測定（是一種免疫測定（immunoassay,IAimmunoassay,IA） ?；A?；A: :抗抗 原或抗體的固相化及

2、抗原或抗體的酶標記。加入酶反應的原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應的 底物后底物后, ,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物底物被酶催化成為有色產(chǎn)物, ,產(chǎn)物的量與標本中受產(chǎn)物的量與標本中受 檢物質的量直接相關檢物質的量直接相關, ,由此進行定性或定量分析。由此進行定性或定量分析。 1.ELISA的原理的原理 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 酶免疫測定類型酶免疫測定類型 這種固相酶免疫測定方法在這種固相酶免疫測定方法在19711971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫 吸附劑測定（吸附劑測定（Enzyme Linked ImmunoSorb

3、ent AssayEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay）, ,簡稱簡稱 ELISAELISA。 酶免疫技術酶免疫技術 酶免疫組化酶免疫組化 酶免疫測定酶免疫測定 均相酶免疫測定均相酶免疫測定 非均相酶免疫測定非均相酶免疫測定 固相酶免疫測定固相酶免疫測定 液相酶免疫測定液相酶免疫測定 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 1.11.1抗原抗體反應抗原抗體反應 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài)抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態(tài) 平衡平衡,其反應式為其反應式為: Ag+Ab

4、AgAg+AbAgAbAb 抗體的親和力（抗體的親和力（affinityaffinity）, ,可以用平衡常數(shù)可以用平衡常數(shù)K K表示表示 :K=Ag:K=AgAbAbAgAb ,AgAgAb ,AgAbAb的解離程度與的解離程度與K K值有關。值有關。高高 親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非 常適合常適合,兩者結合牢固兩者結合牢固,不易解離。不易解離。解離后的抗原或抗體均能解離后的抗原或抗體均能 保持原有的結構和活性。保持原有的結構和活性。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 1.1.21.1

5、.2特異性特異性 抗原抗體的結合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結合位點抗原抗體的結合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結合位點 之間?；瘜W結構和空間構型互補關系之間。化學結構和空間構型互補關系, ,具有高度的特異性。具有高度的特異性。 測定某一特定的物質測定某一特定的物質, ,而不需先分離待檢物。而不需先分離待檢物。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 1.1.31.1.3最適比例最適比例 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 1.1.41.1.4敏感性敏感性 化學比色法的敏感度為化學比色法的敏感度為mg/mlmg/ml水平水平 酶反應測定

6、法的敏感度約為酶反應測定法的敏感度約為5-10g/ml5-10g/ml 免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿 標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍標記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍, ,達達ng/mlng/ml水平水平 例如例如, ,HBsAgHBsAg, ,其敏感度可達其敏感度可達0.1ng/ml0.1ng/ml。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 1.41.4免疫測定在臨床檢驗中的應用免疫測定在臨床檢驗中的應用 由于各種抗原成份由于各種抗原成份,包括小分子的半抗原包括小分子的半抗原,均可用以制備特均可用以

7、制備特 異性的抗血清或單克隆抗體異性的抗血清或單克隆抗體,利用此抗體作為試劑就可檢測利用此抗體作為試劑就可檢測 標本中相應的抗原標本中相應的抗原,因此免疫測定的應用范圍極廣。因此免疫測定的應用范圍極廣。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 2 2ELISAELISA的類型的類型 ELISA ELISA可用于測定抗原可用于測定抗原, ,也可用于測定抗體。在這種測定方也可用于測定抗體。在這種測定方 法中有三個必要的試劑法中有三個必要的試劑: : （1 1）固相的抗原或抗體）固相的抗原或抗體, ,即即 免疫吸附劑免疫吸附劑 （immunosorbentimmunos

8、orbent）; ; （2 2）酶標記的抗原或抗體）酶標記的抗原或抗體, ,稱為稱為 結合物結合物 （conjugateconjugate）; ; （3 3）酶反應的底物。）酶反應的底物。 可設計出各種不同類型的檢測方法?？稍O計出各種不同類型的檢測方法。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 2.2.12.2.1雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法測抗原 此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原, ,例如例如HBsAgHBsAg、 HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體,

9、,就可用就可用 于于包被固相載體包被固相載體和制備和制備酶結合物酶結合物而建立此法。而建立此法。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 2.2.2 2.2.2 雙抗原夾心法測抗體雙抗原夾心法測抗體 用特異性抗原進行包被和制備酶結合物。此法中受檢用特異性抗原進行包被和制備酶結合物。此法中受檢 標本不需稀釋標本不需稀釋, ,可直接用于測定可直接用于測定, ,因此其敏感度相對高于間因此其敏感度相對高于間 接法。乙肝標志物中抗接法。乙肝標志物中抗HBsAgHBsAg的檢測常采用本法。本法關鍵的檢測常采用本法。本法關鍵 在于酶標抗原的制備在于酶標抗原的制備, ,應根據(jù)抗原

10、結構的不同應根據(jù)抗原結構的不同, ,尋找合適的尋找合適的 標記方法。標記方法。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 2.2.3 2.2.3 間接法測抗體間接法測抗體 傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用 同一酶標抗抗體同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。建立檢測相應抗體的方法。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 2.2.4 2.2.4 競爭法測抗體競爭法測抗體 當抗原材料中的干擾物質不易除去當抗原材料中的干擾物質不易除去,或不易得到足夠的純化或不易得到足夠

11、的純化 抗原時抗原時,可用此法檢測特異性抗體?？捎么朔z測特異性抗體。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 2.2.5 2.2.5 競爭法測抗原競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點位點, , 因此不能用雙抗體夾心法進行測定因此不能用雙抗體夾心法進行測定, ,可以采用競爭法模式?？梢圆捎酶偁幏Ｊ?。 其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗 體結合。標本中抗原量含量愈多體結合。標本中抗原量含量愈多, ,結合在固相上的酶標抗原結合在固相

12、上的酶標抗原 愈少愈少, ,最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISAELISA測定測定 多用此法。多用此法。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 2.2.6 2.2.6 捕獲包被法測抗體捕獲包被法測抗體 IgMIgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgMIgM抗體包被固相抗體包被固相, , 以捕獲血清標本中的以捕獲血清標本中的IgMIgM（其中包括針對抗原的特異性（其中包括針對抗原的特異性IgMIgM 抗體和非特異性的抗體和非特異性的IgMIgM）。）。此法常用于病毒性感染的早期診此法常

13、用于病毒性感染的早期診 斷。斷。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 2.2.7 ABS-ELISA2.2.7 ABS-ELISA法法 : :固相支持物固相支持物; ; : :樣品樣品; ; : :特異性特異性IgGIgG; ; : :生物素化抗小鼠生物素化抗小鼠IgG IgG （BiotinBiotin）; ; : :辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶HRP-HRP-酶標鏈親和素（酶標鏈親和素（AvidinAvidin）; ; : :DABDAB顯色液顯色液; ; : :顯色顯色; ; 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3. E

14、LISA3. ELISA的試劑的試劑(A(A、B B、C C三部分三部分) ) ELISAELISA中有三個必要的試劑中有三個必要的試劑: :免疫吸附劑、結合物和酶的底免疫吸附劑、結合物和酶的底 物。物。 （1 1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）; ; （2 2）酶標記的抗原或抗體（結合物）酶標記的抗原或抗體（結合物）; ; （3 3）酶的底物）酶的底物; ; （4 4）陰性對照品和陽性對照品）陰性對照品和陽性對照品, ,參考標準品參考標準品; ; （5 5）結合物及標本的稀釋液）結合物及標本的稀釋液; ; （6 6）洗滌液）洗滌液; ; （7

15、 7）酶反應終止液）酶反應終止液 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 ELISAELISA的試劑準備的試劑準備A A 固相載體固相載體 聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能, ,抗體或蛋抗體或蛋 白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高, ,但但 空白值也略高?？瞻字狄猜愿?。 良好的良好的ELISAELISA板應該是板應該是吸附性能好吸附性能好, ,空白值低空白值低, ,孔底透明度孔底透明

16、度 高高, ,各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近性能相近。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3.1.2 3.1.2 包被的方式包被的方式 將抗原或抗體固定在過程稱為包被將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)(coating)。 蛋白質蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的, ,靠的靠的 是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團 間的作用。這種物理吸附是非特異性的間的作用。這種物理吸附是非

17、特異性的, ,受蛋白質的分子量受蛋白質的分子量 、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質較小分子蛋白質通、等電點、濃度等的影響。大分子蛋白質較小分子蛋白質通 常含有更多的常含有更多的疏水基團疏水基團, ,故更易吸附到固相載體表面。故更易吸附到固相載體表面。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 不易吸附不易吸附的非蛋白質抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親的非蛋白質抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親 和層析作用和層析作用, ,包被在固相上的抗原純度大大提高包被在固相上的抗原純度大大提高, ,因此含雜質較因此含雜質較 多的抗原也可采用捕獲包被法。多的抗原也可采用捕獲

18、包被法。 親和素生物素親和素生物素 即用親和素先包被載體即用親和素先包被載體, ,加入生物素化的加入生物素化的DNADNA, , 這種包被方法均勻、牢固這種包被方法均勻、牢固, ,已擴大應用于各種抗原物質的定量已擴大應用于各種抗原物質的定量 測定。測定。 脂類物質脂類物質無法與固相載體結合無法與固相載體結合, ,可將其在有機溶劑（例如乙醇可將其在有機溶劑（例如乙醇 ）中溶解后加入）中溶解后加入ELISAELISA板孔中板孔中, ,開蓋置冰箱過夜或冷風吹干開蓋置冰箱過夜或冷風吹干, ,待待 酒精揮發(fā)后酒精揮發(fā)后, ,讓脂質自然干固在固相表面。讓脂質自然干固在固相表面。 優(yōu)點優(yōu)點: :試驗的特異性

19、、敏感性均由此得以改善試驗的特異性、敏感性均由此得以改善, ,重復性亦佳重復性亦佳 ?？乖昧可??？乖昧可? ,僅為直接包被的僅為直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 包被用抗原包被用抗原: : 天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。 合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。 一般只含有一個抗原決定簇一般只含有一個抗原決定簇, ,純度高純度高, ,特異性也高特異性也高, ,但由于分子量但由于

20、分子量 太小太小, ,往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的 吸附吸附, ,間接地結合到固相載體表面。間接地結合到固相載體表面。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3.1.4 3.1.4 包被用抗體包被用抗體 IgGIgG對聚苯乙烯有強吸附力對聚苯乙烯有強吸附力, ,其聯(lián)結發(fā)生在其聯(lián)結發(fā)生在FcFc段上段上, ,抗體結合點抗體結合點 暴露于外。暴露于外。 取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液. .須除去雜抗體后才能須除去雜抗體后才能 用于用于ELISAELISA,

21、,以保證試驗的特異性。以保證試驗的特異性。 腹水中單抗的濃度較高腹水中單抗的濃度較高, ,特異性亦較強特異性亦較強, ,因此不需要作吸收層因此不需要作吸收層 析處理析處理, ,直接包被。在某些情況下直接包被。在某些情況下, ,用多種單抗混合包被用多種單抗混合包被, ,可取可取 得更好的效果。得更好的效果。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3.1.5 3.1.5 包被的條件包被的條件 pH9.6pH9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液 pH7.2pH7.2的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液 pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL緩沖液。緩沖液。 加入包

22、被液后加入包被液后, ,在在4-84-8冰箱中放置過夜冰箱中放置過夜, ,3737中保溫中保溫2 2小小 時。包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化時。包被濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化, ,每批每批 材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調選定。一般蛋白質的材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調選定。一般蛋白質的 包被濃度為包被濃度為10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3.1.6 3.1.6 封閉封閉 封閉封閉(blocking)(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液是繼包被

23、之后用高濃度的無關蛋白質溶液 再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些 空隙空隙, ,從而排斥從而排斥ELISAELISA后的步驟中干擾物質的再吸附。后的步驟中干擾物質的再吸附。 常用封閉劑常用封閉劑:0.05%-0.5%:0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明膠明膠; ; 脫脂奶粉脫脂奶粉, ,比較價廉比較價廉, ,可以高濃度使用（可以高濃度使用（5%5%）。）。 所有的所有的ELISAELISA固相均需封閉固相均需封閉? ? 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本

24、標本 結果結果 3.4 3.4 洗滌液洗滌液 在板式在板式ELISAELISA中中, ,常用的稀釋液為含常用的稀釋液為含0.05%0.05%吐溫吐溫2020磷酸磷酸 鹽緩沖液。鹽緩沖液。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 ELISA的試劑準備的試劑準備B 3.2 3.2 結合物結合物 即酶標記的抗體（或抗原）是即酶標記的抗體（或抗原）是ELISAELISA中關鍵的試劑中關鍵的試劑 1 1酶的催化活性酶的催化活性 2 2抗體（或抗原）的免疫活性抗體（或抗原）的免疫活性 3 3含有或少含有游離的抗體（或抗原）含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 4結合物尚要有良

25、好的穩(wěn)定性。結合物尚要有良好的穩(wěn)定性。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3.2.1 3.2.1 結合物用的抗原和抗體結合物用的抗原和抗體 制備結合物時所用純度較高的制備結合物時所用純度較高的IgG,IgG,以免在與酶聯(lián)結時其以免在與酶聯(lián)結時其 他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體, ,這樣全部酶結合這樣全部酶結合 物均具有特異的免疫活性物均具有特異的免疫活性, ,可以在高稀釋度進行反應可以在高稀釋度進行反應, ,實驗實驗 結果本底淺淡。在結果本底淺淡。在ELISAELISA中用酶標抗原的模式不多中用酶標抗原的模式不多,

26、,總的要總的要 求是抗原必須是高純度的。求是抗原必須是高純度的。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3.2.23.2.2酶酶 純度高純度高, ,催化反應的轉化率高催化反應的轉化率高, ,專一性強專一性強, ,性質穩(wěn)定性質穩(wěn)定, ,來源豐富來源豐富 , ,價格不貴價格不貴, ,受檢標本中不存在相同的酶。受檢標本中不存在相同的酶。 酶結合物保留活性部分和催化能力酶結合物保留活性部分和催化能力, ,底物易于制備和保存底物易于制備和保存, ,價價 格低廉格低廉, ,有色產(chǎn)物易于測定等。有色產(chǎn)物易于測定等。 在在ELISAELISA中中, ,HRPHRP, ,APAP

27、, ,葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶, ,-D-D-半乳糖苷酶和脲酶半乳糖苷酶和脲酶 等。等。 HRPHRP是一種糖蛋白是一種糖蛋白, ,含糖量約為含糖量約為18%18%, ,分子量為分子量為4400044000, ,是一種復是一種復 合酶合酶, ,由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成, ,是是 一種卟啉蛋白質。一種卟啉蛋白質。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3.2.3 3.2.3 結合物的制備結合物的制備 酶標記抗體的制備方法主要有兩種酶標記抗體的制備方法主要有兩種,即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸即戊二醛交聯(lián)法和過

28、碘酸 鹽氧化法。鹽氧化法。 （1）戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法: :戊二醛是一種雙功能團試劑戊二醛是一種雙功能團試劑, ,可使酶與蛋可使酶與蛋 白質的氨基通過它而聯(lián)結。有效（結合率達白質的氨基通過它而聯(lián)結。有效（結合率達60%-70%60%-70%）和重復）和重復 性好。性好。 交聯(lián)反應是隨機的交聯(lián)反應是隨機的, ,結合物的大小也不均一結合物的大小也不均一, ,酶與酶酶與酶, ,抗體抗體 與抗體之間也有可能交聯(lián)與抗體之間也有可能交聯(lián), ,影響效果。影響效果。 （2 2）過碘酸氧化法）過碘酸氧化法: :適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將適用含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRPHRP分分 子表面的多糖氧化為醛

29、基很活潑子表面的多糖氧化為醛基很活潑, ,可與蛋白質上的氨基形成可與蛋白質上的氨基形成 chiffchiff氏堿而結合。簡便有效氏堿而結合。簡便有效. . 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 結合物中混有的游離酶一般不影響結合物中混有的游離酶一般不影響ELISAELISA中最后的酶活性測中最后的酶活性測 定。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原定。但游離的抗體則會與酶標抗體競爭相應的固相抗原, ,因此因此 制備的酶結合物應予純化制備的酶結合物應予純化, ,去除游離的酶和抗體后用于檢測去除游離的酶和抗體后用于檢測, , 效果更好。效果更好。 制得結合物制

30、得結合物, ,最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度 時時, ,能維護一個低的本底能維護一個低的本底, ,并獲得測定的最佳靈敏度并獲得測定的最佳靈敏度, ,達到最合達到最合 適的測定條件和測定費用的節(jié)省。適的測定條件和測定費用的節(jié)省。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3.2.43.2.4結合物的保存結合物的保存 酶和抗體均為生物活性物質酶和抗體均為生物活性物質, ,易失活。高濃度較為穩(wěn)定易失活。高濃度較為穩(wěn)定 , ,凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結合物溶液中加凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結合物溶液中加 入

31、等體積的甘油入等體積的甘油, ,加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（ 例如慶大霉素）和防腐劑（例如慶大霉素）和防腐劑（HRPHRP結合物加硫柳泵結合物加硫柳泵, ,APAP結合物結合物 可加疊氮鈉）?？杉盈B氮鈉）。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3.2.5 3.2.5 結合物的稀釋液結合物的稀釋液 用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在 反應中直接吸附在固相載體上反應中直接吸附在固相載體上:0.1%:0.1%牛血清白蛋白牛血清白蛋白, , 0.05%0.05%

32、吐溫吐溫20 20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液, ,使用時使用時 不需再行稀釋不需再行稀釋, ,在在4-84-8保存期可達保存期可達6 6個月。個月。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 試劑準備試劑準備 C 酶的底物酶的底物 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3.3 3.3 酶的底物酶的底物 3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物 OPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色, ,用酸終止酶反應后用酸終止酶反應后, ,在在492nm492nm處有處有 最高吸收

33、峰最高吸收峰, ,靈敏度高靈敏度高, ,比色方便比色方便, ,是是HRPHRP結合物最常用的底物結合物最常用的底物 。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2為供氧體，為供氧體， H2O2為受氫體。為受氫體。 DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。 DH2如：鄰苯二胺如：鄰苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。 E 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后共產(chǎn)物顯藍色。作用后共產(chǎn)物顯藍色。TMB

34、TMB性質較穩(wěn)定性質較穩(wěn)定, ,可配成溶液可配成溶液 試劑試劑, ,只需與只需與H H2 2O O2 2溶液混和即成應用液。酶反應終止后溶液混和即成應用液。酶反應終止后, ,TMBTMB產(chǎn)產(chǎn) 物由藍色呈黃色物由藍色呈黃色, ,可在比色計中定量可在比色計中定量, ,最適吸收波長為最適吸收波長為450nm450nm。 ABTSABTS雖不如雖不如OPDOPD和和TMBTMB敏感敏感, ,但空白值極低但空白值極低, ,也為一些試劑盒所也為一些試劑盒所 采用。采用。 HRPHRP對氫受體的專一性很高對氫受體的專一性很高, ,僅作用于僅作用于H2O2H2O2、小分醇的過氧化、小分醇的過氧化 物和尿素過氧

35、化物物和尿素過氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 APAP的底物為磷酸酯酶的底物為磷酸酯酶, ,一般采用對一般采用對硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯作為作為 底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚, ,在在405nm405nm波長處有吸收波長處有吸收 峰。用峰。用NaOHNaOH終止酶反應后終止酶反應后, ,黃色可穩(wěn)定一時間。黃色可穩(wěn)定一時間。APAP也也 有發(fā)熒光底物（磷酸有發(fā)熒光底物（磷酸4-4-甲基傘酮）甲基傘酮）, ,可用于可用于ELISAELISA作熒作熒 光測定光測定, ,

36、敏感度較高于用顯色底物的比色法。敏感度較高于用顯色底物的比色法。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 3.5 3.5 酶反應終止液酶反應終止液 常用的常用的HRPHRP反應終止液為硫酸反應終止液為硫酸, ,其濃度按其濃度按 加量及比色液的最終體積而異加量及比色液的最終體積而異, ,在板式在板式ELISAELISA 中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 4 4 對照設定對照設定 陽性對照品陽性對照品(positive control)(positive control)和陰性對照品和

37、陰性對照品(negative (negative control)control)是檢驗試驗有效性的控制品是檢驗試驗有效性的控制品, ,同時也作為判斷結果的同時也作為判斷結果的 對照。對照。 陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致陽性對照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致, ,多以含多以含 蛋白保護劑的緩沖液為基質。蛋白保護劑的緩沖液為基質。 加入的量應與試劑的敏感度相稱加入的量應與試劑的敏感度相稱; ; 在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較, ,可以估計標本物可以估計標本物 質的量。質的量。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備

38、對照對照 標本標本 結果結果 參考標準品參考標準品 定量測定（如甲胎蛋白質定量測定（如甲胎蛋白質, ,癌胚抗原測定等）應含有制作標癌胚抗原測定等）應含有制作標 準曲線用的參考標準品準曲線用的參考標準品, ,應包括覆蓋可檢測范圍的應包括覆蓋可檢測范圍的4-54-5個濃度個濃度 , ,一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中一般均配入含蛋白保護劑及防腐劑的緩沖液中. . 陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質。例如陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質。例如HBsAgHBsAg檢測的陰檢測的陰 性對照品中不可含性對照品中不可含HBsAg,HBsAg,最好抗最好抗HBsHBs也是陰性。也是陰性。 原理原

39、理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 5 5 標本的采取和保存標本的采取和保存 體液、分泌物和排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體或體液、分泌物和排泄物等均可作標本以測定其中某種抗體或 抗原成份?？乖煞荨?以血清標本為例以血清標本為例: :血漿中除尚含有血漿中除尚含有纖維蛋白原纖維蛋白原和和抗凝劑抗凝劑外外, ,其其 他成份同血清。血漿和血清可同等應用。他成份同血清。血漿和血清可同等應用。 血清標本應避免溶血血清標本應避免溶血: :紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物 酶活性的物質酶活性的物質, ,以以HRPHRP為標記的為標記的ELIS

40、AELISA測定中測定中, ,可能會增加非特可能會增加非特 異性顯色。異性顯色。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 加樣加樣: : 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加樣步聚次加樣步聚, ,即加標本即加標本, ,加酶結合物加酶結合物, , 加底物。加樣時應將所加物加在加底物。加樣時應將所加物加在LEISALEISA板孔的底部板孔的底部, ,避免加避免加 在孔壁上部在孔壁上部, ,并注意不可濺出并注意不可濺出, ,不可產(chǎn)生氣泡。不可產(chǎn)生氣泡。 基本操作注意事項基本操作注意事項 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果

41、保溫保溫 抗原抗體完成反應的保溫過程稱為溫育抗原抗體完成反應的保溫過程稱為溫育(incubation)(incubation)。 ELISAELISA屬固相免疫測定屬固相免疫測定, ,抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā) 生。為什么生。為什么ELISAELISA反應總是需要一定時間的溫育反應總是需要一定時間的溫育? ? 溫育常采用的溫度有溫育常采用的溫度有4343、3737、室溫和、室溫和44（冰箱溫度）等（冰箱溫度）等 。3737是實驗室中常用的保溫溫度是實驗室中常用的保溫溫度, ,也是大多數(shù)抗原抗體結合也是大多數(shù)抗原抗體結合 的合適溫度。的合適溫度。 原理原理

42、類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 保溫方式保溫方式:ELISA:ELISA儀器附有特制的電熱塊儀器附有特制的電熱塊, ,水浴。水浴。 若用保溫箱若用保溫箱: :ELISAELISA板放在濕盒內板放在濕盒內, ,在盒底墊濕的紗布在盒底墊濕的紗布, ,最后將最后將 ELISAELISA板放在濕紗布上。反應板均不宜疊放板放在濕紗布上。反應板均不宜疊放, ,以保證各板的溫以保證各板的溫 度都能迅速平衡。度都能迅速平衡。 室溫溫育的反應室溫溫育的反應, ,操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內操作時的室溫應嚴格限制在規(guī)定的范圍內, , 標準室溫溫度是指標準室溫溫度是指20-252

43、0-25, ,但具體操作時可根據(jù)說明書的要但具體操作時可根據(jù)說明書的要 求控制溫育。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。求控制溫育。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定力求準確。 為保證這一點為保證這一點, ,一個人操作時一個人操作時, ,一次不宜多于兩塊板同時測定一次不宜多于兩塊板同時測定 。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 洗滌洗滌 洗滌在洗滌在ELISAELISA過程中雖不是一個反應步驟過程中雖不是一個反應步驟, ,但卻也決定著實驗但卻也決定著實驗 的成敗。的成敗。 ELSIAELSIA洗滌洗滌: :達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。達到分離游離的

44、和結合的酶標記物的目的。 清除殘留在板孔中游離的物質清除殘留在板孔中游離的物質, ,以及非特異性地吸附的干擾物以及非特異性地吸附的干擾物 質。質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的, ,而在洗滌時又應把這種而在洗滌時又應把這種 非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。 可以說在可以說在ELISAELISA操作中操作中, ,洗滌是最主要的關鍵技術。洗滌是最主要的關鍵技術。 洗滌的方式除某些洗滌的方式除某些ELISAELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外儀器配有特殊的自動洗滌儀外, ,手工手工 操作有操作有流水沖洗式和流水沖洗式和浸泡

45、式兩種浸泡式兩種: : 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 （1 1）流水沖洗式）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌, ,洗洗 滌液為蒸餾水滌液為蒸餾水, ,自來水。洗滌效果更為徹底自來水。洗滌效果更為徹底, ,且也簡便、快速且也簡便、快速 。已有實驗表明。已有實驗表明, ,流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。 讓水流沖擊板孔表面讓水流沖擊板孔表面, ,洗滌效果更佳。洗滌效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑非離子

46、型洗滌劑 的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性疏水性的的, ,非非 離子型洗滌劑既含疏水基團離子型洗滌劑既含疏水基團, ,也含親水基團也含親水基團, ,使蛋白質回復到使蛋白質回復到 水溶液狀態(tài)水溶液狀態(tài), ,從而脫離固相載體。從而脫離固相載體。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 顯色顯色 顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應。反應的顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應。反應的 溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內, ,陰性孔可保陰性孔可保 持

47、無色持無色, ,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度 有助于加速顯色進行。有助于加速顯色進行。 TMBTMB受光照的影響不大受光照的影響不大, ,可在室溫中置于操作臺上可在室溫中置于操作臺上, ,邊反應觀察邊反應觀察 結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性, ,宜在規(guī)定的適當時間閱讀宜在規(guī)定的適當時間閱讀 結果。結果。TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后作用后, ,約約4040分鐘顯色達頂峰分鐘顯色達頂峰, ,隨即逐漸減弱隨即逐漸減弱, , 至至2 2小時后即可完全消退至無色。小時后即可完全消退至無色。 原理原理 類型

48、類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 比色比色 拭干板底附著的液體拭干板底附著的液體, ,然后將板正確放入酶標比色儀中。然后將板正確放入酶標比色儀中。 以蒸餾水校零點以蒸餾水校零點, ,測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液 的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的 孔）孔）, ,以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾 水校零點水校零點, ,以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度, ,然后進然后進

49、 行計算。行計算。 結果以光密度（結果以光密度（oplical densityoplical density, ,ODOD）, ,現(xiàn)按規(guī)定用吸光度現(xiàn)按規(guī)定用吸光度 （absorbenceabsorbence, ,A A）, ,兩者含義相同。通常的表示方法是兩者含義相同。通常的表示方法是, ,將吸將吸 收波長寫于收波長寫于A A字母的右下角字母的右下角, ,如如OPDOPD的吸收波長為的吸收波長為492nm492nm, ,表示表示 方法為方法為AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 酶標比色儀酶標比色儀 酶

50、標比色儀簡稱酶標儀酶標比色儀簡稱酶標儀, ,通常指測讀通常指測讀ELISAELISA光度計。針對固相光度計。針對固相 載體形式的不同載體形式的不同, ,各有特制的適用于板、珠和小試管的設計各有特制的適用于板、珠和小試管的設計 。酶標儀的主要性能指標有。酶標儀的主要性能指標有: :測讀速度、讀數(shù)的準確性、重測讀速度、讀數(shù)的準確性、重 復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)復性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù) 一般可精確到一般可精確到0.0010.001, ,準確性為準確性為1%1%, ,重復性達重復性達0.5%0.5%。 操作時室溫宜在操作時室溫宜在15-3015-30, ,使用前先預熱儀器使用前先預熱儀器15-3015-30分鐘分鐘, ,測讀測讀 結果更穩(wěn)定。測讀結果更穩(wěn)定。測讀A A值時值時, ,要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰, ,如如OPDOPD用用 492nm492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀。波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀。 各種酶標儀性能有所不同各種酶標儀性能有所不同, ,使用中應詳細閱讀說明書。使用中應詳細閱讀說明書。 原理原理 類型類型 試劑試劑 準備準備 對照對照 標本標本 結果結果 6 6 結果判斷結果判斷 6.1 6.1 定性測定定性測定 定性測定的結果判斷作出定性測定