HPLC高性能液相色譜使用說(shuō)明及注意事項(xiàng)

1、HPLC-高性能液相色譜使用說(shuō)明及注意事項(xiàng)一、開(kāi)機(jī)操作：1，打開(kāi)計(jì)算機(jī)，進(jìn)入Window操作系統(tǒng)。2，打開(kāi)1200LC各模塊的電源，等待儀器自檢完畢，1-2min。3，雙擊桌面上“Instrument 1 Online”圖標(biāo)，進(jìn)入1200化學(xué)工作站。進(jìn)入的工作站畫面如下所示：泵、柱溫箱、DAD檢測(cè)器為灰色（OFF狀態(tài)），其他綠色部分表示狀態(tài)已經(jīng)Ready。泵柱溫箱DAD檢測(cè)器4，把流動(dòng)相放入溶劑瓶中A為10%甲醇，B為100%甲醇。點(diǎn)擊泵下面的瓶圖標(biāo)，輸入溶劑的實(shí)際體積，點(diǎn)擊OK。5，逆時(shí)針打開(kāi)Purge閥。6，點(diǎn)擊Pump圖標(biāo)，點(diǎn)擊Setup pump選項(xiàng)，進(jìn)入泵編輯畫面。設(shè)泵Flow:5m

2、l/min， 點(diǎn)擊OK。7，點(diǎn)擊Pump圖標(biāo)，點(diǎn)擊Control選項(xiàng)，選中On, 點(diǎn)擊OK，沖洗A通道至無(wú)氣泡從廢液管排出，切換通道B繼續(xù)Purge，直到所有要用通道無(wú)氣泡為止。一般為5-10min即可，閥打開(kāi)時(shí)，溶劑流向廢液管；關(guān)閉時(shí)，溶劑由毛細(xì)管出口流向進(jìn)樣器。8，點(diǎn)擊Pump圖標(biāo)，點(diǎn)擊Control選項(xiàng)，選中Off, 點(diǎn)擊OK關(guān)泵。9，點(diǎn)擊Pump圖標(biāo)，點(diǎn)擊Setup pump選項(xiàng)，設(shè)Flow:1ml/min，順時(shí)針關(guān)閉Purge閥。（不要太過(guò)用力，輕輕旋緊即可）。注意：一定要按順序操作，開(kāi)啟時(shí)：Purge閥改泵流量為5ml/min開(kāi)泵；關(guān)閉時(shí)：關(guān)泵改流量為1ml/min-關(guān)閉Purge

3、閥。若是在流量在5ml/min把Purge閥關(guān)閉，則過(guò)大的壓力會(huì)損害色譜柱。10，從右至左分別點(diǎn)擊DAD檢測(cè)器，柱溫箱右下角的開(kāi)關(guān)，選擇Yes，打開(kāi)儀器。預(yù)熱45min。11，點(diǎn)擊Pump右下角的開(kāi)關(guān)，選擇Yes，打開(kāi)泵。點(diǎn)擊Pump圖標(biāo)，點(diǎn)擊Setup pump選項(xiàng)，將流動(dòng)相比例改為如下設(shè)置，點(diǎn)擊OK。用100%甲醇沖洗系統(tǒng)30min。12，等儀器Ready，基線平穩(wěn)后，即可按照樣品檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)。因?yàn)閮x器的準(zhǔn)備時(shí)間較長(zhǎng)，所以在儀器信號(hào)平穩(wěn)前，可以用來(lái)準(zhǔn)備樣品和輸入樣品信息以便節(jié)約操作時(shí)間。二、樣品檢測(cè)過(guò)程（一）準(zhǔn)備過(guò)程1、溶液配置1.1 20%NA2SO4清洗用酸溶液的準(zhǔn)備A,稱量200

4、1g NA2SO4粉末。B,用漏斗將NA2SO4粉末裝入1000ml容量瓶中，用純凈水反復(fù)沖洗漏斗以及容量瓶?jī)?nèi)壁。C,加水至750ml(不必很準(zhǔn)確)，塞緊容量瓶瓶塞，反復(fù)搖晃至NA2SO4粉末完全溶解。D,加水至刻度1000ml。E,取出部分溶液，用冰醋酸（色譜級(jí)純）調(diào)溶液的PH值在2.0-3.0。將調(diào)好的溶液裝入20ml樣品瓶中以便取用。1.2 5% K2SO4溶液（凝聚劑）的配置A,稱量501g K2SO4粉末。B,用漏斗將K2SO4粉末裝入1000ml容量瓶中，用純凈水反復(fù)沖洗漏斗以及容量瓶?jī)?nèi)壁。C,加水至750ml(不必很準(zhǔn)確)，塞緊容量瓶瓶塞，反復(fù)搖晃至K2SO4粉末完全溶解。D,加

5、水至刻度1000ml。E,備好，用時(shí)將溶液裝入K2SO4溶液儲(chǔ)瓶（裝有瓶口移液器）中即可。1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置在一號(hào)20ml樣品瓶中先滴加0.10000.0300g 14%Kathon（AMV-1568），記錄重量W1；繼續(xù)加入5% 的K2SO4溶液至總重為15.0000.5000g，記錄總重W2。在二號(hào)20ml樣品瓶中先滴加0.10000.0300g一號(hào)樣品瓶中的溶液，記錄重量W3；繼續(xù)加入5% 的K2SO4溶液至總重為15.0000.5000g，記錄總重W4。 將結(jié)果輸入到EXCEL表格參數(shù)計(jì)算中，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液的參數(shù)：Non-chlorinated Kathon PPM, Chlorin

6、ated Kathon PPM。 這三個(gè)參數(shù)將會(huì)在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中用到，將結(jié)果填入儀器旁邊的標(biāo)準(zhǔn)溶液參數(shù)記錄表中，以便實(shí)驗(yàn)操作。1.4 流動(dòng)相的配備Bottle A： 10% 甲醇， 量取1002ml 甲醇至1000ml容量瓶中，加水至刻度。輕輕搖勻。Bottle B： 100% 甲醇（色譜級(jí)純）。注意：將配好的10% 甲醇裝入BOTTLE A 時(shí)，要將溶液延瓶壁輕輕倒入，不可引入氣泡。1.5 樣品的準(zhǔn)備A,將Tube放置在天平上，清零。B,稱取1.00000.0500g樣品，記錄樣品重量Ws。C,用瓶口移液器移取5ml 5% K2SO4溶液至Tube中，記錄總重Wt。（應(yīng)該在6.0-6.25g）

7、將Tube放入架子中，由于樣品多，一定要記住放入順序，以免搞混。D,重復(fù)步驟A-C，稱取多個(gè)樣品。將結(jié)果輸入到EXCEL表格參數(shù)計(jì)算中，得到樣品的參數(shù)：Multiplier。E,待樣品全部稱完后，分別在振蕩器上振30s，然后放入離心機(jī)中以17000rpm的轉(zhuǎn)速，離心20min。F,打開(kāi)Tube蓋，用3ml進(jìn)樣器抽取上層清液后，在進(jìn)樣器上裝上0.2-micron PEFE過(guò)濾器，將樣品注入到2ml進(jìn)樣瓶中，蓋緊進(jìn)樣瓶的蓋子，一個(gè)樣品準(zhǔn)備完畢。G,對(duì)所有樣品重復(fù)操作E。清洗Tube，處理廢液。注意：1、3ml進(jìn)樣器、0.2-micron PEFE過(guò)濾器、2ml進(jìn)樣瓶均為一次性使用。2、若離心后樣品

8、上層清液仍然渾濁，則對(duì)該樣品再次離心15min。若仍然渾濁，則需要找出原因。上層清液仍然渾濁的樣品，說(shuō)明樣品的處理不當(dāng)，不可以進(jìn)行檢測(cè)。3、由于Tube大，取樣量少，稱取樣品時(shí)盡量不要滴到Tube 內(nèi)壁上。加入5ml 5% K2SO4溶液時(shí)也要注意不滴加在內(nèi)壁上。操作時(shí)最好將滴管深入到Tube里。H, 將樣品按順序放入自動(dòng)進(jìn)樣器中，等待檢測(cè)。（二）檢測(cè)過(guò)程1、運(yùn)行單個(gè)樣品A,在Method and Run control 界面下，從Run control 菜單中選擇Sample Info選項(xiàng)，如下圖所示，輸入操作者姓名，樣品位置，樣品名稱，子目錄名稱，Multiplier。 點(diǎn)擊OK。B,等儀

9、器Ready, 基線平穩(wěn)后，Method-Load Method，彈出對(duì)話框問(wèn)當(dāng)前的Method已經(jīng)被更改，是否需要保存，選擇NO。彈出方法選擇界面，選擇方法KATHON，點(diǎn)擊確定。C,點(diǎn)擊Start，運(yùn)行樣品?；蛘?，從Method菜單中選擇Run Method也可。2、多個(gè)樣品進(jìn)樣（序列）原理和單個(gè)樣品一樣，就是需要編輯進(jìn)樣序列表格A,進(jìn)入Method and Run Control界面，在菜單中選擇Sequence New SequenceB,在菜單中選擇Sequence Sequence Parameters,輸入操作者姓名、子目錄名稱（要求以當(dāng)天日期作為子目錄名），其他設(shè)置如下。C,

10、在菜單中選擇Sequence Sequence Table按如下規(guī)則輸入所有樣品信息：*數(shù)據(jù)輸入規(guī)則*：STD1：輸入vial-樣品放置位置，一般為1-4; sample name-輸入STD; Method name-KATHON ; Inj/vial-輸入1；Sample type-輸入Calibration; cal level-輸入1; Update RF-Replace; Update RT-Replace。STD2：其他不變，只作改動(dòng)Update RF-Average; Update RT- Average。Sample：輸入vial-樣品放置位置，一般為5以后; sample n

11、ame-輸入待測(cè)樣品名稱; Method name-KATHON ; Inj/vial-輸入1；Sample type-輸入；Sample; Multiplier。Append line-添加輸入行 Inset插入輸入行 樣品編輯順序（為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確和防止色譜柱被堵請(qǐng)按以下順序編輯樣品）1- Cleaning agent of acetic acid （PH=2.0-3.0 的20%NA2SO4溶液）2-STD1（REPLACE）3-STD2 (AVERAGE)Calibration and save method, creating and running a new sequence.

12、4-10-15 Samples5- Cleaning agent of acetic acid （PH=2.0-3.0 的20%NA2SO4溶液）6-STD （REPLACE）若STD 0.05則立刻停止運(yùn)行，重新平衡系統(tǒng)7-若STD 0.05則運(yùn)繼續(xù)運(yùn)行10-15 Samples8-Repeat 5,6,7 (If there are many samples)9-2 injections of Cleaning agent of acetic acid （PH=2.0-3.0 的20%NA2SO4溶液）D, 在菜單中選擇Sequence Save Sequence as, 將名稱改為上圖中

13、子目錄Subdirectory（即當(dāng)天日期），點(diǎn)擊確定。E,在菜單中選擇Runcontrol RunSequence運(yùn)行注意：1、不要在同一天同一個(gè)VAIL（位置）上運(yùn)行兩個(gè)樣品，標(biāo)樣除外。三、數(shù)據(jù)分析方法編輯-手動(dòng)校正注意：1、每次更換新的標(biāo)準(zhǔn)溶液后都需要重新校正。2、每次測(cè)樣品前都要進(jìn)兩針標(biāo)樣，第一針作為標(biāo)準(zhǔn)，第二針用來(lái)確認(rèn)標(biāo)樣值是否準(zhǔn)確。要求兩針差值小于0.05。數(shù)據(jù)分析步驟1、 從View菜單中，點(diǎn)擊Data analysis 進(jìn)入數(shù)據(jù)分析畫面。2、 從File菜單中選擇Load Signal選中所要的數(shù)據(jù)文件名，如下圖所示，點(diǎn)擊OK，則數(shù)據(jù)被調(diào)出。3、 做譜圖優(yōu)化從Graphics菜

14、單中選擇Signal options 選項(xiàng)，如下圖所示。從Ranges中選擇Full或Auto scale 及合適的顯示時(shí)間調(diào)整。反復(fù)進(jìn)行，直到圖的比例合適為止。點(diǎn)擊OK。4、 積分A,從Integration菜單中選擇Auto Integrate自動(dòng)積分。選擇Integration Events選項(xiàng)，將參數(shù)Slope Sensitivity，Peak Width，Area Reject，Height Reject更改至合適的范圍。B,從Integration菜單中選擇Integrate選項(xiàng)，則數(shù)據(jù)被積分。C,如積分結(jié)果不理想，則修改相應(yīng)的積分參數(shù)，直到滿意為止。D,點(diǎn)擊左邊圖表，將積分參數(shù)存入方法。5、 校正曲線的建立A, 從Calibration菜單中選擇Calibration settings選項(xiàng)，如下圖所示。一般已經(jīng)設(shè)置好，無(wú)需再做更改。B, 從Calibration菜單中選擇New Calibration table 選項(xiàng)，如下圖所示。LEVEL為1，選擇是取代原有校正值（REPLACE）還是與上次校正值平均（AVERAGE），參考進(jìn)樣檢測(cè)部分進(jìn)行設(shè)置。C,選擇是否覆蓋原有校正曲線，如下圖所示。D, 在表中輸入化合物名稱和相應(yīng)化合物名稱和濃度。注意：只需選擇A通道的參數(shù)進(jìn)行校正，刪除其他通道的參數(shù)。E,刪除零濃度行。F,再校正-一定要選