小鼠海馬蛋白質(zhì)影響管理論文

1、小鼠海馬蛋白質(zhì)影響管理論文 【摘要】目的運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)觀察益智健腦顆粒對(duì)SAMP8小鼠海馬蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，從而探討益智健腦顆粒治療阿爾茨海默病(AD)的部分作用機(jī)制。方法將6月齡SAMP820只隨機(jī)分為治療組(n=10)和對(duì)照組(n=10)，治療組以益智健腦顆粒濃縮液灌胃，對(duì)照組以等劑量雙蒸水灌胃。8w后，應(yīng)用雙向凝膠電泳(2DE)技術(shù)分別分離治療組和對(duì)照組SAMP8海馬區(qū)組織總蛋白，經(jīng)膠體考馬斯亮藍(lán)染色，利用ImageScanner圖像掃描儀及ImageMaster雙向凝膠電泳軟件對(duì)圖像進(jìn)行掃描分析，將有意義的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOFMS)分析得

2、到肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，經(jīng)MSDB和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，鑒定差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。結(jié)果鑒定出治療組13個(gè)差異表達(dá)大于2倍的蛋白質(zhì)，其中有8個(gè)上調(diào)，5個(gè)下調(diào)。結(jié)論益智健腦顆粒可調(diào)節(jié)SAMP8小鼠海馬組織的多種蛋白質(zhì)表達(dá),提示該藥具有多靶點(diǎn)治療的作用。 【關(guān)鍵詞】益智健腦顆粒；SAMP8小鼠；海馬；雙向凝膠電泳；質(zhì)譜分析 益智健腦顆粒是董克禮教授多年臨床實(shí)踐治療阿爾茨海默病(AD)的中藥處方，臨床上用于治療AD之腎虛血瘀型,取得滿意療效1，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究能改善SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力2。本研究則在臨床觀察及前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定益智健腦顆粒干預(yù)前后P8品系快速老化小鼠(SAMP

3、8)海馬組織的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，試圖從蛋白質(zhì)組水平探討中藥益智健腦顆粒治療AD的作用機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。 1材料與方法 1.1動(dòng)物及分組選用6月齡20只雄性SAMP8小鼠，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組,每組各10只，由天津中醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院動(dòng)物部提供。 1.2藥物、試劑與儀器益智健腦顆粒由淫羊藿、鎖陽、川斷、田七等組成，其水提濃縮液，相當(dāng)于1ml含3g生藥，由湖南德康制藥有限公司加工制成。雙向凝膠電泳試劑：2DQuantKit蛋白定量試劑盒，尿素，硫脲，NP40，TritonX100，二硫蘇糖醇，碘乙酰胺，固相pH梯度干膠條（pH310，24cm），IPG緩沖液（pH310），兩性電解質(zhì)（

4、pH310），覆蓋液，雙向凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)G250,溴酚藍(lán)均為瑞典AmershamBiosciences公司產(chǎn)品；瓊脂糖，過硫酸氨,丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，甘氨酸，三羥甲基氨基甲烷，CHAPS和十二烷基硫酸鈉，碳酸氫銨，三氟乙酸、乙腈和基質(zhì)氰基4羥基肉桂酸均為美國(guó)SigmaAldrich公司產(chǎn)品。胰蛋白酶，美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。PDQuest雙向凝膠圖譜分析軟件是美國(guó)BioRad公司產(chǎn)品，MascotMS/MS數(shù)據(jù)庫(kù)查詢軟件是英國(guó)Matrixscience公司產(chǎn)品，IPGphor等電聚焦儀，Imagescanner掃描儀均為瑞典AmershamBiosciences公司產(chǎn)

5、品，DataExplorer質(zhì)譜分析軟件，VoyagerDESTR4307MALDITOFMS質(zhì)譜儀是美國(guó)AppliedBiosystem公司產(chǎn)品。 1.3方法 1.3.1動(dòng)物喂養(yǎng)及標(biāo)本收集治療組和對(duì)照組小鼠喂養(yǎng)于層流室，溫度1822，濕度55%58%，飲水及飼料高溫蒸汽滅菌。小鼠灌胃劑量每天30g/kg計(jì)算。治療組給予中藥益智健腦顆粒濃縮液灌胃，1次/d。對(duì)照組給予相同體積的雙蒸水灌胃，1次/d，持續(xù)8w。8w后，迅速斷頭處死治療組和對(duì)照組小鼠，置于冰上，剝出腦組織，用冷生理鹽水沖洗干凈，除去血漬，取出所需的海馬，置于EP管中，迅速置于液氮中保存。 1.3.2海馬組織總蛋白的提取及濃度測(cè)定將

6、海馬組織從液氮中取出，立即放入預(yù)先稱重的EP管中進(jìn)行稱重。然后根據(jù)50mg樣品組織加入約400l組織裂解液的比例加入組織裂解液（7mol/L尿素、2mol/L硫脲，2%NP40，1%TritonX100，0.5mmol/LEDTA，40mmol/LTris，4%CHAPS，100mmol/LDTT，5mmol/LPMSF）混合后，用研磨工具使海馬組織充分研磨裂解，室溫下靜置孵育1h，間或渦旋混勻，然后1200r/min，4離心1h，吸取上清即為組織的總蛋白質(zhì)。取少許（5l）上清液（組織總蛋白質(zhì)）測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。采用AmershamBiosciences公司專門針對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的蛋白質(zhì)抽提設(shè)計(jì)

7、的2DQuantKit定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。 1.3.3雙向凝膠電泳每塊膠的上樣量1500g。將膠條槽放置于平臺(tái)上，將樣品加入膠條槽中，取出IPG干膠條（pH310）置入含蛋白質(zhì)樣品的膠條槽中，再將膠條槽平行放置于IPGphor等電聚焦儀上進(jìn)行第一向電泳。等電聚焦電泳結(jié)束后，將膠條先后放在平衡緩沖A液(平衡緩沖貯液10mlDTT100mg)和平衡緩沖B液(平衡緩沖貯液10ml碘乙酰胺250mg)中各平衡15min。然后將膠條轉(zhuǎn)移至12.5%的PAGE分離膠上端，進(jìn)行第二向電泳。 1.3.4圖像染色與掃描將凝膠從玻璃板上剝離下來，雙蒸水清洗干凈后用考馬斯亮藍(lán)G250的藍(lán)銀染色方法進(jìn)行藍(lán)銀顯色

8、，通過掃描儀及掃描軟件進(jìn)行掃描獲取圖像，使用PDQuest圖像分析軟件進(jìn)行凝膠圖像分析。 1.3.5質(zhì)譜分析將蛋白質(zhì)點(diǎn)從凝膠上切取下來，脫色、酶解后對(duì)樣品萃取、點(diǎn)樣。用MALDITOFMS質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF），再利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。 2結(jié)果 得到背景清晰、分辨率高、重復(fù)性好的2DE圖譜各3張。每張2DE圖譜約有900個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，大多數(shù)蛋白質(zhì)點(diǎn)在位置和豐度上是一致的，主要分布在pH48的范圍內(nèi)。選擇差異在兩倍以上的16個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)作為差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，最后得到鑒定的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)為13個(gè)(各個(gè)蛋白具體在凝膠上的分布見圖1)。這些蛋白質(zhì)的功能分別涉

9、及到細(xì)胞骨架蛋白、代謝相關(guān)酶類、信號(hào)傳導(dǎo)和激素等多個(gè)方面。在治療組中表達(dá)上調(diào)的有8個(gè)，分別為1、2、4、5、9、10、11、13號(hào)蛋白，表達(dá)下調(diào)的有5個(gè)，分別為3、6、7、8、12號(hào)蛋白。每個(gè)蛋白的具體情況見表1。表1差異表達(dá)蛋白質(zhì)信息 3討論 AD發(fā)病機(jī)制現(xiàn)存在多種假說：能量代謝障礙、激素缺乏、細(xì)胞凋亡、淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性作用、炎癥、自由基損傷等。本實(shí)驗(yàn)鑒定的13種蛋白質(zhì)點(diǎn)，分別涉及到能量代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨架、激素等多個(gè)方面。肽酰脯氨酰順反式異構(gòu)酶A(Pin1)屬于微小菌素蛋白的一種酶，Pin1蛋白是一種相對(duì)大分子量(18kD)的肽酰脯氨酰異構(gòu)酶。Pin1與磷酸化的微管相關(guān)蛋白(tau)

10、蛋白結(jié)合，而磷酸化的tau蛋白聚集形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，這樣就使Pin1過多結(jié)合于纖維結(jié)上，使可利用的游離Pin1減少或缺乏，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，這可能是AD發(fā)病機(jī)制之一35。有研究表明，外源性Pin1的加入可以恢復(fù)tau蛋白使微管聚集的生物學(xué)特征，即加入的Pin1與磷酸化的tau蛋白結(jié)合，使其異構(gòu)化，成為磷蛋白磷酸酶2A型(ProteinPhosphatase2A,PP2A)的最適底物，PP2A使tau蛋白去磷酸化，從而恢復(fù)tau蛋白使微管蛋白聚集的生物學(xué)功能，減少神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成6。磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解的關(guān)鍵酶，PGK基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致智力減退7，這個(gè)酶是一個(gè)有重要價(jià)值的、具有

11、潛力的藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo)8。 近年研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可通過多種途徑和環(huán)節(jié)影響AD的發(fā)生和發(fā)展9，10。流行病學(xué)調(diào)查表明，絕經(jīng)后婦女AD的發(fā)病率較同齡男性高1.53.1倍，原因與絕經(jīng)后婦女喪失了雌激素的保護(hù)作用有關(guān)11。接受雌激素治療的患者腦血流量增加,尤其是在海馬、海馬溝回、顳葉等與認(rèn)知功能相關(guān)的腦區(qū)12。大腦的海馬區(qū)與記憶和學(xué)習(xí)的關(guān)系密切，在此區(qū)域發(fā)現(xiàn)了大量的雌激素受體(ER)。雌激素受體主要在海馬錐體層神經(jīng)元中表達(dá)，雌激素受體陽性神經(jīng)元主要分布在CA3和CA4亞區(qū)，而在CA1區(qū)較少。AD病理學(xué)上的一個(gè)重要特征為CA1區(qū)較CA3區(qū)更易發(fā)生神經(jīng)退變，雌激素受體分布與AD病理變化部位的高度重合提示雌激

12、素可能參與了AD的發(fā)病13。 中藥益智健腦顆粒是由淫羊藿、鎖陽、川斷、刺五加、柏仁、水蛭、田七等藥物組成的復(fù)方，適用于腎虛血瘀型的老年癡呆。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中藥益智健腦顆粒通過改善能量代謝、抑制細(xì)胞凋亡、構(gòu)成細(xì)胞骨架、增加激素等多途徑、多靶點(diǎn)治療AD。 【參考文獻(xiàn)】 1董克禮,宋治.益智健腦顆粒治療早老性癡呆64例臨床觀察J.湖南中醫(yī)雜志，1999；15(4):56. 2楊聘,董克禮,曾望遠(yuǎn).益智健腦顆粒對(duì)快速老化鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶的改善作用J.中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué),2005;14(7):6012. 3LuPJ，WulfG，ZhouXZ,etal.TheprolylisomerasePinlrest

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