人子宮內(nèi)膜異位癥在位和異位內(nèi)膜細胞原代培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

1、人子宮內(nèi)膜異位癥在位和異位內(nèi)膜細胞原代培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 作者：俞超芹，石書芳，劉玉環(huán)，王瑞霞，宋艷華，俞瑾 【關(guān)鍵詞】 子宮內(nèi)膜異位癥 摘要 目的：探討子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis, em）異位子宮內(nèi)膜細胞原代培養(yǎng)方法，并比較em在位及異位子宮內(nèi)膜細胞與正常對照在位子宮內(nèi)膜細胞形態(tài)的差異。方法：采用改良em細胞原代培養(yǎng)方法，免疫細胞化學(xué)法鑒定細胞類型，在光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡下觀察細胞形態(tài)差異。結(jié)果：正常對照子宮內(nèi)膜細胞及em在位、異位子宮內(nèi)膜細胞分離培養(yǎng)成功率分別為91.67%、93.75%和75.00%。em異位、在位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞與正常在位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞大小相似，但

2、em異位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞染色質(zhì)增多，核增大。em異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞較em在位及正常在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞小，且細胞膜表面有較多的微絨毛和胞漿突起。結(jié)論：注意取材方式，采用改良原代培養(yǎng)方法，可以提高em異位子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)成功率。em異位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞和間質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)與正常婦女及em在位子宮內(nèi)膜細胞有顯著不同。 關(guān)鍵詞 子宮內(nèi)膜異位癥; 原代培養(yǎng); 腺上皮細胞; 間質(zhì)細胞 primary culture and morphologic observation of eutopic and ectopic endometrial cells from patients with endom

3、ehiosis abstract objective: to explore the method of primary culture for endometriotic cells and to find out the differences in morphological manifestations among endometriotic cells and eutopic endometrial cells sampled from patients with endometriosis and endometriosisfree women. methods: endometr

4、iotic and eutopic endometrial cells were cultured by modified method of primary culture. the endometriotic cell types were observed and differentiated under optical and electron microscopes. results: the success rates for culture of eutopic endometrial cells from endometriosisfree women and patients

5、 with endometriosis were 91.67% and 93.75% respectively. the success rate for culture of endometriotic cells was 75.00%. the size of endometriotic glandular cells was similar to those of eutopic endometrial glandular cells from endometriosisfree women and patients with endometriosis. the chromatin w

6、as manifold and the nucleus was augmented in the endometriotic glandular cells. the endometriotic stromal cells were smaller than the eutopic endometrial stromal cells from endometriosisfree women and patients with endometriosis. many tiny villi and protuberances on plasma membrane could be seen in

7、the endometriotic stromal cells. conclusion: the success rate for culture of endometriotic cells can be elevated through improving the method of primary culture. the ultrastructures of endometriotic glandular and stromal cells are obviously different from those of eutopic endometrial glandular and s

8、tromal cells from endometriosisfree women and patients with endometriosis. key words endometriosis; primary culture; glandular cells; stromal cells 子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis, em）是子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和腺上皮細胞種植于子宮腔以外的雌激素依賴性疾病，具有侵襲性生長、廣泛種植、易復(fù)發(fā)等惡性腫瘤樣特性。雖然em的發(fā)現(xiàn)已有一百多年的歷史，但其病因尚不十分清楚，亦無有效的治療方法。因此，em是目前婦科學(xué)界研究的熱點之一。已有的大量研究表明，

9、異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞與腺上皮細胞的功能及相互作用不同于在位內(nèi)膜1,2，而原代培養(yǎng)細胞由于剛離開機體，因此能較好地反映體內(nèi)細胞的生物學(xué)特性，故原代培養(yǎng)已成為em體外研究的一個重要方法。實踐表明，在位和異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞及腺上皮細胞的分離培養(yǎng)成功率并不高，尤其是異位內(nèi)膜細胞培養(yǎng)的成功率較低，故本研究對em在位內(nèi)膜細胞及異位內(nèi)膜細胞的分離培養(yǎng)方法進行了探索，觀察正常子宮內(nèi)膜細胞、em在位內(nèi)膜細胞及em異位內(nèi)膜細胞之間形態(tài)學(xué)的差異，從細胞形態(tài)學(xué)角度研究em的發(fā)病機制，以期為em的研究提供有價值的體外細胞模型。 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 標本采集 （1）2002年12月2003年7月在長海

10、醫(yī)院婦產(chǎn)科行手術(shù)治療的em患者共16例，年齡2347歲，平均（41.132.78）歲；所有患者均無內(nèi)科合并癥，月經(jīng)規(guī)律；術(shù)前3個月內(nèi)未服用激素類藥物；剖腹行全子宮切除術(shù)或子宮附件切除術(shù)后，分離子宮內(nèi)膜、巧克力囊腫內(nèi)皮及盆腔異位灶。（2）因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)患者共12例，年齡2347歲，平均（41.832.79）歲；無內(nèi)科合并癥；術(shù)前3個月內(nèi)未服用激素類藥物；剖腹行子宮附件切除術(shù)后刮取子宮內(nèi)膜。 1.1.2 主要儀器 co2細胞培養(yǎng)箱（德國hereaus公司產(chǎn)品）；swcj2f型凈化工作臺（江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；微量可調(diào)移液器（法國glison公司產(chǎn)品）；倒置相差顯微鏡（上海光學(xué)

11、儀器廠產(chǎn)品）；ka1000臺式離心機和sh288型37 恒溫水浴搖床（上海安亭科技儀器廠產(chǎn)品）。 1.1.3 主要試劑 f12培養(yǎng)基、達氏改良依氏培養(yǎng)基（dulbecoos modified eagles medium, dmem）、谷氨酰胺（美國gibco公司產(chǎn)品）；型膠原酶、牛血清白蛋白、胎牛血清（美國sigma公司產(chǎn)品）；dnase酶（華美生物工程有限公司產(chǎn)品）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品）；鼠抗人細胞角蛋白單克隆抗體、鼠抗人波形蛋白單克隆抗體（美國santa公司產(chǎn)品）；鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化酶連接法（streptavidinbiotin peroxidase, sp

12、）免疫組織化學(xué)試劑盒（美國doka公司產(chǎn)品）。 1.2 實驗方法 將組織標本用無菌f12/dmem（fd）培養(yǎng)液沖洗后，按文獻方法3,4經(jīng)不斷實踐后改良進行分離培養(yǎng)操作。具體實驗步驟如下：將子宮內(nèi)膜標本用無菌生理鹽水沖洗后，放入冰浴的fd培養(yǎng)液中。用fd清洗后剪碎標本，加入fd培養(yǎng)液，再加入型膠原酶（終濃度為1 mg/ml），37 恒溫水浴搖床中消化60 min后，加入dnase（終濃度為15 u/ml），繼續(xù)消化30 min。將消化后的組織吸入離心管中，700 r/min離心7 min，棄上清液，加入含10%胎牛血清的fd培養(yǎng)液，700 r/min，離心7 min，棄上清液。加入fd培養(yǎng)液，

13、用吸管將細胞吹打開，然后經(jīng)100目（孔徑150 m）和200目（孔徑74 m）不銹鋼細胞濾網(wǎng)依次過濾（在培養(yǎng)皿中進行）。200目網(wǎng)上細胞團主要為腺上皮細胞。將濾液（主要為間質(zhì)細胞）經(jīng)1 000 r/min離心7 min，用適量fd培養(yǎng)液懸浮細胞。制作3.0%和1.5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, bsa）梯度，將間質(zhì)細胞懸液鋪于梯度層上，室溫沉降2030 min。棄去上層bsa液，用fd培養(yǎng)液洗滌1遍（1 000 r/min離心7 min），將細胞按5105/ml的密度接種于含10%胎牛血清的fd培養(yǎng)液中，置于37 5% co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用fd培養(yǎng)液沖洗200目

14、濾網(wǎng)上的細胞（主要為腺上皮細胞），收集沖洗液，700 r/min離心5 min，棄上清，用適量fd培養(yǎng)液懸浮。將細胞懸液鋪于裝有8 ml fd培養(yǎng)液的15 ml玻璃離心管中，重力沉降10 min，棄上清，反復(fù)操作4次，使腺上皮細胞團沉降至底層。用含10%胎牛血清的fd培養(yǎng)液懸浮腺上皮細胞團后，接種于玻璃培養(yǎng)皿中，待混雜其中的間質(zhì)細胞貼壁，3 h后吸出腺上皮細胞團，磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline, pbs）離心洗2遍（700 r/min離心7 min）。用含0.02%依地酸（edetic acid, edta）的0.025%胰酶消化5 min，使腺上皮細胞團分

15、散成單個細胞，然后吸入離心管，700 r/min離心7 min。將細胞接種于含10%胎牛血清的fd培養(yǎng)液中，置于37 5% co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 1.3 觀察指標與方法 1.3.1 細胞類型鑒定 細胞角蛋白（cytokeratin）廣泛存在于人類上皮組織及培養(yǎng)的上皮細胞內(nèi)，而波形蛋白（vimentin）則主要位于間質(zhì)細胞中5。所以分別選擇鼠抗人細胞角蛋白單克隆抗體和鼠抗人波形蛋白單克隆抗體作為第一抗體，以sp染色法進行染色，對分離獲得的子宮內(nèi)膜兩種細胞進行鑒定。 1.3.2 光學(xué)顯微鏡觀察 將無菌蓋玻片放入六孔培養(yǎng)板中，消化分離后的間質(zhì)細胞接種于六孔培養(yǎng)板蓋玻片上，置于37 5% co2培養(yǎng)箱

16、中培養(yǎng)。從培養(yǎng)皿中取出間質(zhì)細胞生長良好的載玻片，用pbs液洗去原培養(yǎng)液。消化分離后的腺上皮細胞予以常規(guī)涂片。間質(zhì)細胞和腺上皮細胞用95%乙醇固定，常規(guī)he染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。 1.3.3 細胞超微結(jié)構(gòu)觀察 將消化分離的正常對照子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞及腺上皮細胞，em在位和異位間質(zhì)細胞及腺上皮細胞分別用2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定，618環(huán)氧樹脂包埋，lkb型超薄切片機切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，在ecnai12型透視電鏡下進行觀察并攝像。 2 結(jié)果 2.1 原代細胞分離培養(yǎng)情況 分離培養(yǎng)的12份正常對照（子宮肌瘤）子宮內(nèi)膜標本，成功11例，分離培養(yǎng)成功率為91.67%；分離培養(yǎng)的16份em

17、在位子宮內(nèi)膜標本，成功15例，分離培養(yǎng)成功率為93.75%；分離培養(yǎng)的16份em異位子宮內(nèi)膜標本，成功12例，分離培養(yǎng)成功率為75.00%。 2.2 細胞類型鑒定結(jié)果 腺上皮細胞角蛋白染色大多數(shù)呈陽性反應(yīng)，細胞純度達85%；間質(zhì)細胞波形蛋白染色呈陽性反應(yīng)，細胞純度達80%，經(jīng)1次傳代后，純度可達85%以上。見圖1。 2.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 2.3.1 光學(xué)顯微鏡觀察 （1）腺上皮細胞：正常對照、em在位和異位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞均呈團狀排列生長，為致密細胞集落，細胞呈多角形或蝌蚪形，邊界清楚，排列緊密，胞漿飽滿，核圓大。（2）間質(zhì)細胞：em在位和異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞接種24 h后基本都能貼壁

18、。正常對照子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞與em在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞體積均較大，呈多角形或梭形排列，胞漿薄而透明，核橢圓。細胞融合后類似成纖維細胞，貼壁后呈旋渦狀生長。em異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞形態(tài)較在位間質(zhì)細胞小，分散生長，呈伸展、挺直狀，中間稍寬，兩頭尖，似紡錘狀。見圖2。 圖1 em異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和腺上皮細胞形態(tài)鑒定（sp染色, 300）（略） figure 1 morphological identification of human endometriotic stromal and glandular cells (sp staining, 300) a: endometriotic stro

19、mal cells; b: endometriotic glandular cells. a: eutopic endometrial glandular cells from endometriosisfree women; b: eutopic endometrial stromal cells from endometriosisfree women; c: eutopic endometrial glandular cells from patients with endometriosis; d: eutopic endometrial stromal cells from pati

20、ents with endometriosis; e: endometriotic glandular cells; f: endometriotic stromal cells. 圖2 正常對照和em在位、異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和腺上皮細胞形態(tài)特征（he染色, 300）（略） figure 2 morphological characterization of glandular and stromal cells from patients with endometriosis and endometriosisfree women (he staining, 300) 2.3.2 電子顯微

21、鏡觀察 （1）正常對照子宮內(nèi)膜腺上皮細胞：細胞膜表面可見微絨毛，部分細胞膜表面有長絨毛，細胞間見緊密連接及橋粒連接，胞漿線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富，可見脂滴，核大，核仁明顯。（2）正常對照子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞：一種是呈多角形的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，具有上皮樣形態(tài)的細胞表面未見微絨毛，細胞間無連接結(jié)構(gòu)，胞漿有散在核糖體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可見溶酶體及一些囊泡，核膜平滑，核染色質(zhì)均勻。另一種細胞呈梭形，電鏡下見細胞無微絨毛，無連接結(jié)構(gòu)，胞漿粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和空泡較多，外周胞漿中有豐富的微絲。（3）em在位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞：細胞成團，有極性，圓形，胞膜表面有微絨毛，核大，呈橢圓形或有切跡，細胞間見橋粒連接，

22、胞漿線粒體、核糖體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富，可見脂滴，核仁明顯。（4）em在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞：電鏡下見細胞表面無微絨毛，無連接結(jié)構(gòu)，胞漿內(nèi)有線粒體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和空泡較多，溶酶體多見，核大，有不規(guī)則切跡、凹陷，核內(nèi)染色體稀疏，核仁明顯。（5）em異位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞：細胞游離，呈橢圓形，表面有細小微絨毛，細胞間有橋粒連接及緊密連接，核圓大，異染色質(zhì)多，胞漿內(nèi)多粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、溶酶體及空泡。（6）em異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞：呈長梭形細胞，有較多微絨毛和胞漿突起，核大，橢圓形，核仁明顯，細胞間少有橋粒連接，胞漿內(nèi)有不規(guī)則線粒體和空泡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體可見。見圖3。 圖3 正常對照和em在位

23、、異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和腺上皮細胞形態(tài)的電鏡觀察（略） figure 3 morphological characterization of glandular and stromal cells from patients with endometriosis and endometriosisfree women by electron microscope a: eutopic endometrial glandular cells from endometriosisfree women (11 000); b: eutopic endometrial stromal cells fr

24、om endometriosisfree women (9 300); c: eutopic endometrial glandular cells from patients with endometriosis (11 000); d: eutopic endometrial stromal cells from patients with endometriosis (11 000); e: endometriotic glandular cells (13 000); f: endometriotic stromal cells (6 300). 3 討論 em的病因至今仍不清楚，較為

25、經(jīng)典并被廣泛接受的是經(jīng)血逆流學(xué)說。隨著腹腔鏡的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)經(jīng)血逆流在生育期婦女十分普遍，但發(fā)展為em的則只是少數(shù)。目前主要有兩種觀點：一種認為em與免疫缺陷有關(guān)，由于em患者存在免疫缺陷，不能清除隨經(jīng)血逆流的“異位”子宮內(nèi)膜細胞，而導(dǎo)致其在盆腔內(nèi)種植6,7；另一種觀點則提出em的發(fā)生與em患者在位子宮內(nèi)膜細胞的特性有關(guān)，由于其發(fā)生了某些類似腫瘤細胞樣的改變，使之逃脫了免疫監(jiān)視和清除而得以在盆腔內(nèi)種植8。有學(xué)者提出子宮內(nèi)膜干細胞假說，即隨經(jīng)血逆流的具有分化潛能和自我更新特征的子宮內(nèi)膜干細胞促使了最初異位病灶的產(chǎn)生，并維持病灶的存在，促使病灶的進一步發(fā)展9。無論何種學(xué)說，顯然em在位、異位子宮內(nèi)

26、膜細胞與正常生育期婦女在位子宮內(nèi)膜細胞在基因、蛋白表達及生物學(xué)行為等方面均存在差異。因此，原代培養(yǎng)正常對照在位子宮內(nèi)膜細胞和em在位及異位子宮內(nèi)膜細胞，對于研究細胞的生長、分化和代謝以及卵巢激素的作用機制，揭示em的發(fā)病機制及臨床治療均具有重要意義。 但是，目前在位和異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞及腺上皮細胞的分離培養(yǎng)成功率并不高，尤其是異位子宮內(nèi)膜細胞的培養(yǎng)成功率較低。本研究采用自行改良方法對正常對照子宮內(nèi)膜和em在位和異位子宮內(nèi)膜中腺上皮細胞及間質(zhì)細胞進行了體外原代培養(yǎng)，分別獲得純度較高的腺上皮細胞和間質(zhì)細胞，正常對照子宮內(nèi)膜細胞分離培養(yǎng)成功率達91.67%；em在位子宮內(nèi)膜細胞分離培養(yǎng)成功率達93

27、.75%；em異位子宮內(nèi)膜細胞分離培養(yǎng)成功率達75.00%，高于ryan等10報道的56%和赫敏等11報道的68.1%。 em異位子宮內(nèi)膜體外培養(yǎng)需注意以下幾點：（1）體積較大的卵巢巧克力囊腫，其內(nèi)皮分離培養(yǎng)后，細胞數(shù)量很少，不易分離培養(yǎng)成功。（2）巧克力囊腫內(nèi)壁有新鮮出血且囊腫體積較?。ㄖ睆? cm），分離培養(yǎng)后的細胞容易生長。（3）子宮韌帶異位結(jié)節(jié)以及腹膜異位灶的分離培養(yǎng)不易成功，但取材時若能獲取較大的紫紅色異位結(jié)節(jié)，亦可分離出數(shù)量較多的間質(zhì)細胞和腺上皮細胞。（4）本研究中內(nèi)膜標本消化時使用的是型膠原酶和dnase，雖然價格較常用的胰酶貴，但是經(jīng)其消化后的間質(zhì)細胞容易貼壁生長?？梢赃m當(dāng)延長

28、型膠原酶和dnase的消化時間（一般為2 h），使內(nèi)膜組織充分消化以獲取更多的細胞。而胰酶消化時間過長會影響細胞的活性，使間質(zhì)細胞不易貼壁，甚至造成細胞培養(yǎng)失敗。（5）在子宮內(nèi)膜細胞分離培養(yǎng)過程中，離心次數(shù)不宜過多，離心轉(zhuǎn)速不宜過高，否則易造成細胞丟失，并影響細胞活性。在本研究中，間質(zhì)細胞和腺上皮細胞的離心次數(shù)不超過4次，而離心轉(zhuǎn)速最高為1 000 r/min。 離體在位和異位子宮內(nèi)膜細胞的爬片，排除了內(nèi)膜組織中非內(nèi)膜成分的干擾，有利于進行各項指標的檢測，使免疫細胞化學(xué)檢測定性、定位準確，還能進行半定量分析12。 在光鏡及電鏡下，可對3種形態(tài)特征的細胞類型進行鑒別：（1）腺上皮細胞；（2）2種

29、形態(tài)的間質(zhì)細胞，其中一種是呈多角形的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，另一種是呈梭形的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞。透視電鏡下em異位子宮內(nèi)膜腺上皮細胞中異染色質(zhì)增多，核增大，這種形態(tài)與癌細胞基本相似，可能與em的惡性行為有關(guān)。而em異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的體積比正常對照及em在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞小，并且其細胞膜表面有較多的微絨毛和胞漿突起，說明em異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的運動能力和侵襲能力增強。caetje等13用膠原凝膠體實驗檢測原代培養(yǎng)異位子宮內(nèi)膜細胞的侵襲活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異位子宮內(nèi)膜細胞的侵襲活性與轉(zhuǎn)移性膀胱癌細胞株（e128）相似，而正常在位子宮內(nèi)膜細胞與非轉(zhuǎn)移性癌細胞株（rt112）相似，表明無侵襲性，證實了em具

30、有惡性腫瘤樣的侵襲特征。而本實驗中所觀察到em異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的形態(tài)改變，也可能與這種惡性腫瘤樣的侵襲特征有關(guān)。此外，em異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞胞漿內(nèi)存在不規(guī)則線粒體，是否與這種侵襲特征相關(guān)，尚待進一步研究。 本研究中采取的內(nèi)膜組織標本均為增生期內(nèi)膜，今后的研究中需注意補充分泌期的內(nèi)膜標本，以進一步完善對離體在位和異位子宮內(nèi)膜的觀察和監(jiān)測，為em研究提供充分的理論依據(jù)。 參考文獻 1 harada t, kaponis a, iwabe t, et al. apoptosis in human endometrium and endometriosis. hum reprod update,

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32、胞分離、培養(yǎng)作為子宮內(nèi)膜異位癥體外細胞模型的探索. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展, 2002, 11(1): 3032. 4 王小敏, 黃海鵬, 何福仙. 簡易人子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)法及其優(yōu)點. 贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2002, 22(3): 256258. 5 matthews cj, redfern cp, hirst bh, et al. characterization of human purified epithelial and stromal cells from endometrium and endometriosis in tissue culture. fertil steril, 1992, 57(5): 990997. 6 sharpetimms kl, zimmer rl, ricke ea, et al. endometriotic haptoglobin bind