梭曼及其代謝產(chǎn)物的分析方法和應(yīng)用

1、梭曼及其代謝產(chǎn)物的分析方法和應(yīng)用 摘要綜述了梭曼及其代謝產(chǎn)物分析方法以及它們在梭曼的毒理學、毒代動力學及毒檢中的應(yīng)用。其中，手性毛細管柱氣相色譜法或氣質(zhì)聯(lián)用儀是實現(xiàn)梭曼四個異構(gòu)體分離測定的較好手段；對梭曼酸性代謝產(chǎn)物的分析測定可以作為監(jiān)測梭曼中毒的有力工具。 關(guān)鍵詞：梭曼；代謝產(chǎn)物；毒代動力學 梭曼（soman）是難防難治的神經(jīng)性毒劑，其主要毒性作用是不可逆地抑制乙酰膽堿酯酶（ache），使乙酰膽堿（ach）積聚而產(chǎn)生膽堿能癥狀，嚴重中毒者可迅速發(fā)生驚厥、呼吸衰竭而導致死亡。梭曼有一個不對稱的碳原子和一個不對稱的磷原子，因此有四個光學異構(gòu)體，即 c(+)p(+), c(+)p(-), c(-)

2、p(+), c(-)p(-),這些異構(gòu)體的毒理學特性差別很大。其中，c()p(-) 對ache抑制速率比c()p(+)快5個數(shù)量級，毒性大2050倍，因此，c()p(-)是消旋梭曼中起主要毒性作用的一對異構(gòu)體，c(-)p(-)較c(+)p(-)毒性更大。另外，梭曼的毒代動力學顯示，相對無毒的c()p(+)與高毒的c()p(-)梭曼在體內(nèi)的代謝過程有顯著差異，c()p(+)主要通過酶水解而迅速消除，而c()p(-)異構(gòu)體則主要通過與羧酸酯酶（cae）及丁酰膽堿酯酶（buche）結(jié)合解毒1。對不同的中毒途徑，四個光學異構(gòu)體在體內(nèi)的處置過程也有差別，如在豚鼠皮下注射或吸入梭曼較等毒劑量靜脈注射后血中

3、c()p(-)高毒性異構(gòu)體濃度高出近一倍2，3。梭曼進入體內(nèi)后迅速消除，血中僅存少量母體化合物，而尿中的酸性代謝物濃度高，半衰期長，可以作為監(jiān)測梭曼中毒的化學標記物4。所以，建立靈敏、特異的梭曼四個光學異構(gòu)體及其代謝產(chǎn)物的分析方法對研究梭曼中毒后體內(nèi)代謝過程、解毒藥物的藥理學評價及中毒診斷都具重要意義。本文對梭曼及其代謝產(chǎn)物的主要分析方法及應(yīng)用情況作一綜述。 1放射性同位素標記方法 早期的研究主要是用14c或3h標記梭曼，檢測其放射性活性來研究梭曼體內(nèi)的分布與排泄。但它不能區(qū)分梭曼的非水解產(chǎn)物與大量的水解產(chǎn)物，并且用此方法不能分別研究梭曼四個異構(gòu)體的代謝過程，特異性較差，因此其應(yīng)用受到一定的限

4、制5。 2生物學檢測方法 早在80年代初，hunter等6就用梭曼的單克隆抗體結(jié)合技術(shù)競爭性抑制酶免疫測定方法來檢測梭曼，但因其抗體親和力不高，特異性較差，此技術(shù)并未得到充分的應(yīng)用與發(fā)展。 2.1外源性酶抑制法測定血中游離梭曼 目前多采用高氯酸沉淀血漿中蛋白（酶），再外加外源性ache，通過殘留酶活性與梭曼濃度之間的線性關(guān)系來確定梭曼在血中的殘余量。此方法操作簡單，重復性好，靈敏度高，測定范圍在181820 pg/ml血，測定精密度在10%以內(nèi)。此方法可作為研究梭曼毒代動力學血中殘余量的監(jiān)測手段，也適用于其他多種有機磷毒劑體內(nèi)外快速檢測。但此方法主要檢測的是血中高毒性的梭曼c()p(-)異構(gòu)體

5、，不能精確研究c()p()四個異構(gòu)體體內(nèi)的代謝解毒過程7。 2.2基于膽堿酯酶抑制的液相色譜檢測法 sipponen8等用甲醇-水作流動相，在有線性梯度系統(tǒng)的反相色譜將梭曼分離，再用梭曼與膽堿酯酶柱后反應(yīng)，以殘余酶活性與梭曼濃度的線性關(guān)系定量梭曼。此方法檢測限可達10 pg，重復性在1%，但也不能區(qū)分梭曼四個光學異構(gòu)體而使用受限。 3氣相色譜（gc）、氣質(zhì)聯(lián)用（gc-ms）儀檢測梭曼四個異構(gòu)體 真正能實現(xiàn)梭曼四個異構(gòu)體分離測定的是手性毛細管柱的氣相色譜法或氣質(zhì)聯(lián)用儀。benschop等9在1985年就以2h標記梭曼異構(gòu)體作為內(nèi)標，用手性毛細管柱分離，氮磷檢測器檢測實現(xiàn)了梭曼四個異構(gòu)體的分離測定

6、。檢測靈敏度可達250 pg。在處理血樣時，采用酸化血液（ph 4.2），加入鋁離子中和氟離子，以及加入特戊基-甲基氟膦酸酯以占據(jù)梭曼的結(jié)合位點等方法，保持了梭曼四個異構(gòu)體的穩(wěn)定性。近年來，熱解吸/冷捕獲的大體積進樣（200l）毛細管氣相色譜法的發(fā)展 可使梭曼的檢測達到100 ng/l水平，為研究梭曼毒代動力學提供了有力手段10。并適用于沙林、塔崩、 vx等神經(jīng)性毒劑的微量測定。 呼吸道染毒是梭曼重要的中毒途徑，用手性毛細管柱的氣相色譜術(shù)可以研究動物呼吸道中毒后梭曼四個異構(gòu)體的毒代動力學。benschop等與langenberg等11，12分別用豚鼠研究發(fā)現(xiàn)，動物吸入梭曼數(shù)分鐘，c()p(-)

7、異構(gòu)體在染毒期迅速升高，其濃度-時間關(guān)系的數(shù)學模型可用非線性回歸獲得，動力學模型呈不連續(xù)過程，即染毒期單冪關(guān)系，染毒后期雙冪關(guān)系。其中，c(+)p(-)較c(-)p(-)異構(gòu)體吸收相落后，可能是c(+)p(-)較多地與cae結(jié)合的原因。而吸入中毒較等毒劑量靜脈給藥，梭曼末端半衰期長，可能由于在上呼吸道存在一個梭曼的儲存庫，染毒終止后又緩慢釋放的原因。結(jié)合梭曼的測定、血與組織中ache的測定、梭曼水解率的測定、血與各組織勻漿梭曼結(jié)合能力的測定及心輸出量與組織血流量的測定等，可以建立起梭曼中毒的毒代動力學生理模型12，13。 用gc-ms可以靈敏而準確地檢測梭曼的四個異構(gòu)體，在處理血標本時，可以用

8、高氯酸沉淀蛋白，梭曼提取率可達81%14?？捎么朔椒ㄑ芯克幬飳λ舐悩?gòu)體體內(nèi)解毒的影響。karlsson15等研究了鈣拮抗劑尼莫地平對抗梭曼兔中毒作用，發(fā)現(xiàn)尼莫地平可能通過肺解毒機制，降低了毒性梭曼c()p(-)的初始濃度。 4梭曼主要代謝產(chǎn)物的檢測方法 梭曼主要代謝產(chǎn)物是通過酶催化水解和（或）自發(fā)水解產(chǎn)生的甲基磷酸頻哪基酯（pama）。另外，梭曼還可與cae或buche能可逆或不可逆性結(jié)合，生成的pama由尿排泄。而梭曼對酶不可逆的膦?；饔脛t使梭曼代謝產(chǎn)物的毒代動力學過程與沙林、塔崩等其他神經(jīng)性毒劑不同，表現(xiàn)出更復雜、緩慢、不完全消除的特點。shih等4，16用gc-ms分析了梭曼大鼠皮下

9、染毒后尿中pama的排泄速率，發(fā)現(xiàn)其呈雙相，t1/2分別為3.6 h與18.5 h，早期排出的是p(+)的水解產(chǎn)物， 而后期排出的以p(-)的水解產(chǎn)物為主，總回收率僅為62%，肺是主要的蓄積器官。與酶不可逆結(jié)合的梭曼可通過加入表面活性劑（triton-x100）與10 mol/l naoh，在高溫高壓下水解后再提取，并用gc-ms測定pama來檢測。katagi等17應(yīng)用陰離子交換柱的間接光度檢測器的離子色譜術(shù)（ipd-ic）檢測人血清中的pama，線性測定范圍為100 ng/ml1 g/ml血清，回收率可達72.9%。另外，nassar等18用毛細管電泳法測定pama，定量測定限在500 n

10、g/ml以內(nèi)，回收率可達86%以上，具有樣本制備簡單、分析迅速等優(yōu)點。 目前，檢測pama最靈敏的方法是通過對pama進行對溴甲基甲酰苯衍生化，用在線固相提取（spe）液相色譜連接快原子轟擊質(zhì)譜（lc-ms）和串級質(zhì)譜測定（lc-ms-ms），檢測范圍在0.53 ng/ml, 精密度在6%以下，pama 在血清與河水中的回收率分別是88%和94.1%，有效地提高偵毒檢毒水平19。 梭曼及其代謝物的分析方法的進展，為深入研究梭曼毒性作用及梭曼的偵檢提供了有力的工具，在實際應(yīng)用時，要根據(jù)研究的目的，各種方法的檢測靈敏度與精密度，結(jié)合現(xiàn)有的條件綜合考慮。 參考文獻 1benschop hp, de

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