梭曼及其代謝產(chǎn)物的分析方法和應(yīng)用

1、梭曼及其代謝產(chǎn)物的分析方法和應(yīng)用 摘要綜述了梭曼及其代謝產(chǎn)物分析方法以及它們?cè)谒舐亩纠韺W(xué)、毒代動(dòng)力學(xué)及毒檢中的應(yīng)用。其中，手性毛細(xì)管柱氣相色譜法或氣質(zhì)聯(lián)用儀是實(shí)現(xiàn)梭曼四個(gè)異構(gòu)體分離測(cè)定的較好手段；對(duì)梭曼酸性代謝產(chǎn)物的分析測(cè)定可以作為監(jiān)測(cè)梭曼中毒的有力工具。 關(guān)鍵詞：梭曼；代謝產(chǎn)物；毒代動(dòng)力學(xué) 梭曼（soman）是難防難治的神經(jīng)性毒劑，其主要毒性作用是不可逆地抑制乙酰膽堿酯酶（ache），使乙酰膽堿（ach）積聚而產(chǎn)生膽堿能癥狀，嚴(yán)重中毒者可迅速發(fā)生驚厥、呼吸衰竭而導(dǎo)致死亡。梭曼有一個(gè)不對(duì)稱的碳原子和一個(gè)不對(duì)稱的磷原子，因此有四個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，即 c(+)p(+), c(+)p(-), c(-)

2、p(+), c(-)p(-),這些異構(gòu)體的毒理學(xué)特性差別很大。其中，c()p(-) 對(duì)ache抑制速率比c()p(+)快5個(gè)數(shù)量級(jí)，毒性大2050倍，因此，c()p(-)是消旋梭曼中起主要毒性作用的一對(duì)異構(gòu)體，c(-)p(-)較c(+)p(-)毒性更大。另外，梭曼的毒代動(dòng)力學(xué)顯示，相對(duì)無毒的c()p(+)與高毒的c()p(-)梭曼在體內(nèi)的代謝過程有顯著差異，c()p(+)主要通過酶水解而迅速消除，而c()p(-)異構(gòu)體則主要通過與羧酸酯酶（cae）及丁酰膽堿酯酶（buche）結(jié)合解毒1。對(duì)不同的中毒途徑，四個(gè)光學(xué)異構(gòu)體在體內(nèi)的處置過程也有差別，如在豚鼠皮下注射或吸入梭曼較等毒劑量靜脈注射后血中

3、c()p(-)高毒性異構(gòu)體濃度高出近一倍2，3。梭曼進(jìn)入體內(nèi)后迅速消除，血中僅存少量母體化合物，而尿中的酸性代謝物濃度高，半衰期長(zhǎng)，可以作為監(jiān)測(cè)梭曼中毒的化學(xué)標(biāo)記物4。所以，建立靈敏、特異的梭曼四個(gè)光學(xué)異構(gòu)體及其代謝產(chǎn)物的分析方法對(duì)研究梭曼中毒后體內(nèi)代謝過程、解毒藥物的藥理學(xué)評(píng)價(jià)及中毒診斷都具重要意義。本文對(duì)梭曼及其代謝產(chǎn)物的主要分析方法及應(yīng)用情況作一綜述。 1放射性同位素標(biāo)記方法 早期的研究主要是用14c或3h標(biāo)記梭曼，檢測(cè)其放射性活性來研究梭曼體內(nèi)的分布與排泄。但它不能區(qū)分梭曼的非水解產(chǎn)物與大量的水解產(chǎn)物，并且用此方法不能分別研究梭曼四個(gè)異構(gòu)體的代謝過程，特異性較差，因此其應(yīng)用受到一定的限

4、制5。 2生物學(xué)檢測(cè)方法 早在80年代初，hunter等6就用梭曼的單克隆抗體結(jié)合技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶免疫測(cè)定方法來檢測(cè)梭曼，但因其抗體親和力不高，特異性較差，此技術(shù)并未得到充分的應(yīng)用與發(fā)展。 2.1外源性酶抑制法測(cè)定血中游離梭曼 目前多采用高氯酸沉淀血漿中蛋白（酶），再外加外源性ache，通過殘留酶活性與梭曼濃度之間的線性關(guān)系來確定梭曼在血中的殘余量。此方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，靈敏度高，測(cè)定范圍在181820 pg/ml血，測(cè)定精密度在10%以內(nèi)。此方法可作為研究梭曼毒代動(dòng)力學(xué)血中殘余量的監(jiān)測(cè)手段，也適用于其他多種有機(jī)磷毒劑體內(nèi)外快速檢測(cè)。但此方法主要檢測(cè)的是血中高毒性的梭曼c(diǎn)()p(-)異構(gòu)體

5、，不能精確研究c()p()四個(gè)異構(gòu)體體內(nèi)的代謝解毒過程7。 2.2基于膽堿酯酶抑制的液相色譜檢測(cè)法 sipponen8等用甲醇-水作流動(dòng)相，在有線性梯度系統(tǒng)的反相色譜將梭曼分離，再用梭曼與膽堿酯酶柱后反應(yīng)，以殘余酶活性與梭曼濃度的線性關(guān)系定量梭曼。此方法檢測(cè)限可達(dá)10 pg，重復(fù)性在1%，但也不能區(qū)分梭曼四個(gè)光學(xué)異構(gòu)體而使用受限。 3氣相色譜（gc）、氣質(zhì)聯(lián)用（gc-ms）儀檢測(cè)梭曼四個(gè)異構(gòu)體 真正能實(shí)現(xiàn)梭曼四個(gè)異構(gòu)體分離測(cè)定的是手性毛細(xì)管柱的氣相色譜法或氣質(zhì)聯(lián)用儀。benschop等9在1985年就以2h標(biāo)記梭曼異構(gòu)體作為內(nèi)標(biāo)，用手性毛細(xì)管柱分離，氮磷檢測(cè)器檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了梭曼四個(gè)異構(gòu)體的分離測(cè)定

6、。檢測(cè)靈敏度可達(dá)250 pg。在處理血樣時(shí)，采用酸化血液（ph 4.2），加入鋁離子中和氟離子，以及加入特戊基-甲基氟膦酸酯以占據(jù)梭曼的結(jié)合位點(diǎn)等方法，保持了梭曼四個(gè)異構(gòu)體的穩(wěn)定性。近年來，熱解吸/冷捕獲的大體積進(jìn)樣（200l）毛細(xì)管氣相色譜法的發(fā)展 可使梭曼的檢測(cè)達(dá)到100 ng/l水平，為研究梭曼毒代動(dòng)力學(xué)提供了有力手段10。并適用于沙林、塔崩、 vx等神經(jīng)性毒劑的微量測(cè)定。 呼吸道染毒是梭曼重要的中毒途徑，用手性毛細(xì)管柱的氣相色譜術(shù)可以研究動(dòng)物呼吸道中毒后梭曼四個(gè)異構(gòu)體的毒代動(dòng)力學(xué)。benschop等與langenberg等11，12分別用豚鼠研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物吸入梭曼數(shù)分鐘，c()p(-)

7、異構(gòu)體在染毒期迅速升高，其濃度-時(shí)間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型可用非線性回歸獲得，動(dòng)力學(xué)模型呈不連續(xù)過程，即染毒期單冪關(guān)系，染毒后期雙冪關(guān)系。其中，c(+)p(-)較c(-)p(-)異構(gòu)體吸收相落后，可能是c(+)p(-)較多地與cae結(jié)合的原因。而吸入中毒較等毒劑量靜脈給藥，梭曼末端半衰期長(zhǎng)，可能由于在上呼吸道存在一個(gè)梭曼的儲(chǔ)存庫，染毒終止后又緩慢釋放的原因。結(jié)合梭曼的測(cè)定、血與組織中ache的測(cè)定、梭曼水解率的測(cè)定、血與各組織勻漿梭曼結(jié)合能力的測(cè)定及心輸出量與組織血流量的測(cè)定等，可以建立起梭曼中毒的毒代動(dòng)力學(xué)生理模型12，13。 用gc-ms可以靈敏而準(zhǔn)確地檢測(cè)梭曼的四個(gè)異構(gòu)體，在處理血標(biāo)本時(shí)，可以用

8、高氯酸沉淀蛋白，梭曼提取率可達(dá)81%14。可用此方法研究藥物對(duì)梭曼異構(gòu)體體內(nèi)解毒的影響。karlsson15等研究了鈣拮抗劑尼莫地平對(duì)抗梭曼兔中毒作用，發(fā)現(xiàn)尼莫地平可能通過肺解毒機(jī)制，降低了毒性梭曼c(diǎn)()p(-)的初始濃度。 4梭曼主要代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法 梭曼主要代謝產(chǎn)物是通過酶催化水解和（或）自發(fā)水解產(chǎn)生的甲基磷酸頻哪基酯（pama）。另外，梭曼還可與cae或buche能可逆或不可逆性結(jié)合，生成的pama由尿排泄。而梭曼對(duì)酶不可逆的膦?；饔脛t使梭曼代謝產(chǎn)物的毒代動(dòng)力學(xué)過程與沙林、塔崩等其他神經(jīng)性毒劑不同，表現(xiàn)出更復(fù)雜、緩慢、不完全消除的特點(diǎn)。shih等4，16用gc-ms分析了梭曼大鼠皮下

9、染毒后尿中pama的排泄速率，發(fā)現(xiàn)其呈雙相，t1/2分別為3.6 h與18.5 h，早期排出的是p(+)的水解產(chǎn)物， 而后期排出的以p(-)的水解產(chǎn)物為主，總回收率僅為62%，肺是主要的蓄積器官。與酶不可逆結(jié)合的梭曼可通過加入表面活性劑（triton-x100）與10 mol/l naoh，在高溫高壓下水解后再提取，并用gc-ms測(cè)定pama來檢測(cè)。katagi等17應(yīng)用陰離子交換柱的間接光度檢測(cè)器的離子色譜術(shù)（ipd-ic）檢測(cè)人血清中的pama，線性測(cè)定范圍為100 ng/ml1 g/ml血清，回收率可達(dá)72.9%。另外，nassar等18用毛細(xì)管電泳法測(cè)定pama，定量測(cè)定限在500 n

10、g/ml以內(nèi)，回收率可達(dá)86%以上，具有樣本制備簡(jiǎn)單、分析迅速等優(yōu)點(diǎn)。 目前，檢測(cè)pama最靈敏的方法是通過對(duì)pama進(jìn)行對(duì)溴甲基甲酰苯衍生化，用在線固相提取（spe）液相色譜連接快原子轟擊質(zhì)譜（lc-ms）和串級(jí)質(zhì)譜測(cè)定（lc-ms-ms），檢測(cè)范圍在0.53 ng/ml, 精密度在6%以下，pama 在血清與河水中的回收率分別是88%和94.1%，有效地提高偵毒檢毒水平19。 梭曼及其代謝物的分析方法的進(jìn)展，為深入研究梭曼毒性作用及梭曼的偵檢提供了有力的工具，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，要根據(jù)研究的目的，各種方法的檢測(cè)靈敏度與精密度，結(jié)合現(xiàn)有的條件綜合考慮。 參考文獻(xiàn) 1benschop hp, de

11、jong lpa.toxicokinetics of soman: species variation and stereospecificity in elimination pathwaysj. neurosci biobehav, 1991,15(1):73. 2langenberg jp, spruit he, van der wiel hj, et&nbs p;al. inhalation toxicokinetics of soman stereoisomers in the atropinized guinea pig with nose-only exposure to som

12、an vaporj.toxicol appl pharmacol, 1998 ,151(1):79. 3due ah, trap hc, langenberg jp, et al. the toxicokinetics of soman stereoisomers subcutaneous administration to atropinized guinea pigsj. arch toxicol, 1994, 68(1): 60. 4 shih ml, mcmonagle jd, dolzine tw, et al. metabolite pharmacokinetics of soma

13、n,sarin and gf in rats and biological monitoring of exposure to toxic organophosphorus agentsj. j appl toxicol, 1994,14(3):195. 5reynolds ml, little pj, thomas bf, et al. relationship between the biodisposition of 3h soman and its pharmacological effects in micej. toxicol appl pharmacol,1985, 80(3):

14、 409. 6hunter kw, lenz de, brimfield aa, et al. quantification of the organophosphorus nerve agent soman by competitive inhibition enzyme immunoassay using monoclonal antibodyj.febs lett, 1982, 149(1):147. 7loke wk, kalsson b, waara l，et al. enzyme-based microassay for accurate determination of soma

15、n in blood samplesj.anal biochem,1998,257(1): 12. 8 sipponen kb. detector for orga nophosphorus compounds in liquid chromatography based on the cholinesterase inhibition reactionj. j chromatogr, 1987 ,389(1): 87. 9benschop hp, bijleveld ec, otto mf, et al. stabilization and gas chromatographic analy

16、sis of the four stereoisomers of soman in rat bloodj. anal biochem ,1985, 151(2): 242. 10degenhardt -langelaan ceam, kienz ce.capillary gas chromatographic analysis of nerve agents using large volume injectionsj. j chromatogr a,1996,723(1): 210. 11benschop hp, trap hc, spruit he, et al. low level no

17、se-only exposure to the nerve agent soman: toxicokinetics of soman stereoisomers and cholinesterase inhibition in atropinized guinea pigsj. toxicol appl pharmacol, 1998, 153(2): 179. 12langenberg jp, van dijk c, sweeney re, et al. development of a physiologically based model for the toxicokinetics o

18、f c()p()-soman stereoisomers in the atropinized guinea pigj.arch toxicol,1997,71(5):5320. 13maxwell dm, vlahacos cp, lenz de. a pharmacodynamic model for soman in the ratj. toxicol lett,1988, 43(1-3):175. 14singh ak, zeleznikar rj jr，drewes lr. analysis of soman and sarin in& nbsp;blood utilizing a

19、sensitive gas chromatography-mass spectrometry methodj. j chromatogr, 1985,24(1):163. 15karlsson bm, waara lm, freriksson sa，et al. the effect of the calcium antagonist nimodipine on the detoxification of soman in anaesthetized rabbitsj. j pharm pharmacol, 1997, 49(3):296. 16shih ml, smith jr,mcmonagle jd, et al. detection of metabolites of toxic alkylmethylphosphonates in biological samplej. biol mass spectrom,1991, 20(11):717. 17katagi m, nishikawa a, tatsuno m, et al. determination of main hydrolysis products of organophosphorus nerve agents, meth