DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制課件

1、DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制第第 四四 節(jié)節(jié)DNADNA限制酶切反應和限制酶切反應和限制酶譜繪制限制酶譜繪制 DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制一一DNADNA的限制酶反應的限制酶反應 1. 1. 酶單位定義酶單位定義: : 使使1g1g某種某種DNADNA在最適反應條件下和在最適反應條件下和1 1小時小時內(nèi)完全酶切所需的限制酶活性。內(nèi)完全酶切所需的限制酶活性。 2. 2. 酶切反應類型酶切反應類型 1) 1) 完全酶切完全酶切 SV40(5243bp) SV40(5243bp) pBR322(4363bp)pBR322(4363bp) 2) 2) 部分酶切部分酶切 3. 3. 酶切反應最適

2、條件酶切反應最適條件 1) 1) DNADNA分子的組成分子的組成 i. i. 堿基組成與排列方式堿基組成與排列方式 ii. ii. 識別位點兩側(cè)的堿基組成與排列方式，同一識別位點兩側(cè)的堿基組成與排列方式，同一DNADNA分子中分子中不同識別位點的酶切速度可相差不同識別位點的酶切速度可相差1010倍（如倍（如中的中的EcoEcoRIRI位位點）點） 2) 2) 反應條件反應條件 i. i. DNADNA溶液的純度和濃度溶液的純度和濃度（反應濃度）（反應濃度）依實驗目的而定依實驗目的而定HpaHpaI I(C CGG) (C CGG) 1 261 26ThaThaI I (CG CG) (CG

3、CG) 0 230 23DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 ii. ii. 限制酶的純度和穩(wěn)定性限制酶的純度和穩(wěn)定性 i) i) 純度：盡可能保持廠家推薦的反應條件純度：盡可能保持廠家推薦的反應條件 ii) ii) 穩(wěn)定性：保存和反應穩(wěn)定性：保存和反應 iii. iii. 反應緩沖液反應緩沖液：常用三種核心緩沖液，即高（常用三種核心緩沖液，即高（H H），中），中（M M），低（），低（L L）鹽緩沖液，不同溫度下的）鹽緩沖液，不同溫度下的pHpH值值 iv. iv. 反應溫度反應溫度：大多數(shù)為大多數(shù)為3737 v.v. 雙酶切和多酶切反應雙酶切和多酶切反應 同時酶切和分別酶切。前者要求兩種酶使

4、用的緩沖液和反同時酶切和分別酶切。前者要求兩種酶使用的緩沖液和反應溫度必須相同，即使相同時，一旦發(fā)生部分酶切反應，應溫度必須相同，即使相同時，一旦發(fā)生部分酶切反應，便無法判斷是何種酶造成的，因此最好采用后者便無法判斷是何種酶造成的，因此最好采用后者-分別酶分別酶切。切。 i) i) 第一種酶切第一種酶切 電泳檢查電泳檢查 酚酚/ /氯仿純化氯仿純化 第二種酶切。第二種酶切。 可不考慮酶切先后順序，但操作步驟多。可不考慮酶切先后順序，但操作步驟多。 ii) ii) 采用低濃度鹽緩沖液的限制酶切采用低濃度鹽緩沖液的限制酶切 電泳檢查電泳檢查 采用采用高濃度鹽緩沖液的限制酶切。操作簡單，但要分先后。

5、高濃度鹽緩沖液的限制酶切。操作簡單，但要分先后。 假如兩酶切位點相距很近（如多克隆位點區(qū)），首先考慮假如兩酶切位點相距很近（如多克隆位點區(qū)），首先考慮的則是相互間的酶切是否有影響，兩種酶切順序不同時，的則是相互間的酶切是否有影響，兩種酶切順序不同時，其結(jié)果大不相同。其結(jié)果大不相同。 如如SmaSmaI-I-BamBamH(c), H(c), BamBamH HI-I-SmaSmaI(p)I(p)DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制二、限制酶圖譜的繪制二、限制酶圖譜的繪制 1. 1. 完全酶切作圖法完全酶切作圖法 1 1）單酶切作圖法單酶切作圖法 一長度為一長度為5Kb5Kb的線狀的線狀DNADNA

6、分子用兩種限制酶完全酶切的凝膠電分子用兩種限制酶完全酶切的凝膠電泳結(jié)果和各位點的可能性排列。要確定其位置，可采用下述輔泳結(jié)果和各位點的可能性排列。要確定其位置，可采用下述輔助方法之一。助方法之一。 i. i. 單酶部分酶切單酶部分酶切：部分酶切時，各種可能性均存在，但：部分酶切時，各種可能性均存在，但只有相鄰的兩個只有相鄰的兩個DNADNA片段才有可能出現(xiàn)在凝膠上。片段才有可能出現(xiàn)在凝膠上。 DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 ii. ii. 末端標記完全酶切末端標記完全酶切 DNADNA片段片段 末端標記末端標記 完全酶切完全酶切 凝膠電泳凝膠電泳 EtBrEtBr染染 色觀察色觀察 放射自顯

7、影放射自顯影 2) 2) 雙酶切作圖法雙酶切作圖法 單酶切結(jié)果只能確定一種酶的位點，要將兩種單酶切結(jié)果畫單酶切結(jié)果只能確定一種酶的位點，要將兩種單酶切結(jié)果畫在一張圖上時則不行在一張圖上時則不行DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制分別作圖時，同一種酶的兩種作圖法都是對的，但當作在一張分別作圖時，同一種酶的兩種作圖法都是對的，但當作在一張圖上時，上述兩種可能性中只有一種是對的，因此必須進行雙圖上時，上述兩種可能性中只有一種是對的，因此必須進行雙酶切反應，其結(jié)果見圖酶切反應，其結(jié)果見圖 根據(jù)上述的原理和步驟，前述的根據(jù)上述的原理和步驟，前述的5 Kb5 Kb片段酶片段酶I I與酶與酶IIII的定位的定位

8、結(jié)果可用兩種方法之一：結(jié)果可用兩種方法之一： i) i) 單酶切單酶切 分離分離DNADNA片段片段 第二種酶切第二種酶切 凝膠電泳凝膠電泳 ii)ii)單酶切單酶切 第二種酶切第二種酶切 凝膠電泳凝膠電泳 * *如果要同時將兩種限制酶定位在一條如果要同時將兩種限制酶定位在一條DNADNA上時，單酶完全酶切上時，單酶完全酶切作圖就沒必要了。作圖就沒必要了。 DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 2. 2. 末端標記末端標記- -部分酶切作圖法部分酶切作圖法（Smith-BrinstielSmith-Brinstiel法）法） DNADNA片段片段 末端標記末端標記 酶酶1 1切切 分離帶標記分離帶

9、標記DNADNA片段片段 酶酶2 2部分酶部分酶切切 電泳電泳 EtBrEtBr染色染色照相照相 放射自顯影放射自顯影 結(jié)果結(jié)果 單端標記方法單端標記方法: : 人工合成單端標記人工合成單端標記法法 限制酶切單端標記法限制酶切單端標記法DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制單端標記方法單端標記方法1 1 人工合成單端標記法人工合成單端標記法DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制單端標記方法單端標記方法2 2 限制酶切單端標記法限制酶切單端標記法DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 3. 3. 末端標記雙相作圖末端標記雙相作圖法法方法方法2 2仍存在兩個不足之處：仍存在兩個不足之處：酶酶1 1的選擇不能靠近的選

10、擇不能靠近DNADNA中中央；需先分離央；需先分離DNADNA片段，該片段，該法可克服上述缺點。法可克服上述缺點。 現(xiàn)假設有一片段長現(xiàn)假設有一片段長10 Kb10 Kb，其中其中RE1RE1有三個切點，有三個切點，RE2RE2有有一個切點，其圖譜可能是一個切點，其圖譜可能是: :DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制4. 4. Bal31Bal31順序酶解作圖法順序酶解作圖法 DNADNA片段片段 Bal31Bal31處理不同時間取樣終止反應處理不同時間取樣終止反應 限制酶切限制酶切 凝膠電泳凝膠電泳 染色觀察結(jié)果染色觀察結(jié)果5. 5. 切口移位作圖法切口移位作圖法( (可檢測出可檢測出100bp1

11、00bp片段片段) ) 雙鏈雙鏈DNA DNA 切口移位切口移位 限制酶切限制酶切 電泳電泳 放射自顯影放射自顯影DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制6. 6. 大尺度限制酶作圖大尺度限制酶作圖 1)1) 條件條件 i.i. 電泳方法電泳方法-脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳 ii.ii. 樣品制備樣品制備-原位原位DNADNA制備和酶解制備和酶解 iii.iii. 人工染色體構(gòu)建人工染色體構(gòu)建-pYAC-pYAC載體構(gòu)建載體構(gòu)建 iv.iv. 脊椎動物基因組中的脊椎動物基因組中的CpGCpG和植物基因組中的和植物基因組中的CpXpGCpXpG序序列存在列存在 2)2) 一般作圖程序一般作圖程序 原位

12、原位DNADNA樣品制備樣品制備 原位原位DNADNA限制酶切限制酶切 脈沖場凝膠脈沖場凝膠電泳電泳 染色染色 觀察觀察 3)3) 大尺度作圖用酶大尺度作圖用酶 i.i. 稀有識別序列內(nèi)切酶稀有識別序列內(nèi)切酶-I-I型內(nèi)含子內(nèi)切酶型內(nèi)含子內(nèi)切酶 ( (真菌細真菌細胞核和線粒體基因組胞核和線粒體基因組,T4,T4噬菌體噬菌體, ,衣藻葉綠體和線粒體衣藻葉綠體和線粒體) )；酵母酵母HOHO內(nèi)切酶；大腸桿菌內(nèi)切酶；大腸桿菌recArecA 雖然這些內(nèi)切酶識別的序列都很長：雖然這些內(nèi)切酶識別的序列都很長：10-19 10-19 bpbp，但高等動植物基因組中含有這類位點卻極少，因而，但高等動植物基因

13、組中含有這類位點卻極少，因而很少使用很少使用 DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 ii.ii. IIII型限制酶型限制酶 人基因組有人基因組有45,00045,000個個CpGCpG島島, ,一個長度約為一個長度約為1.5 kb1.5 kb富含富含GCGC的的DNADNA片段片段, ,其中只有其中只有25%25%的的CpGCpG島未被甲基化島未被甲基化, ,這些這些CpGCpG島常位于基因的島常位于基因的5-5-端端, ,未被甲基化的未被甲基化的CpGCpG島平均長約島平均長約270 kb270 kb 可用于大尺度限制酶作圖的限制酶具有如下特征：識別可用于大尺度限制酶作圖的限制酶具有如下特征：識

14、別8 8或或6 bp6 bp序列；富含或只含序列；富含或只含GCGC序列；含有序列；含有CpGCpG序列序列 i)i) AscAscI-GGI-GGCGCGCGCGCCCC和和NotNotI-GI-GCGCGGCGCCGCGC C ii) ii) FseFseI-GGCI-GGCCGCGGCCGCC和和SrFSrFI-GCCI-GCCCGCGGGCGGC iii) iii) SfiSfiI-GGCI-GGCCNCNNNNNGGCCNNNNGGCC iv) iv) CpoCpoI/I/CspCspI/I/RsrRsrII-II-CGCGGA(T)CGA(T)CCGCG v) v) BssBssH

15、I-GHI-GCGCGCGCGC,C,EagEagI-I-CGCGGCGCCGCG和和SacSacII-CII-CCGCGCGCGG G vi) vi) NaeNaeI-GCI-GCCGCGGC,GC,NarNarI-GGI-GGCGCGGC,GC,SmaSmaI-CCI-CCCGCGGGGG vii) vii) MluMluI-AI-ACGCGCGCGT, T, NruNruI-TI-TCGCGCGCGA, A, PvuPvuI-I-CGCGATATCGCG, , SplSplI-I-CGCGTATACGCGCHCH3 3CHCH3 3CHCH3 3CHCH3 3CHCH3 3CHCH3 3

16、DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制三三. . 限制酶圖譜的用途限制酶圖譜的用途 1.1. 基因工程中的應用基因工程中的應用 1)1) 克隆載體圖譜克隆載體圖譜, ,便于便于DNADNA重組重組; ; 2) 2) 克隆片段圖譜可用于次克隆克隆片段圖譜可用于次克隆, ,體外突變體外突變, ,基因定位基因定位, ,核酸定序核酸定序. . 2.2. 突變體檢測突變體檢測 遺傳學圖譜必須依賴各種突變體存在遺傳學圖譜必須依賴各種突變體存在, ,因此必然發(fā)生了因此必然發(fā)生了基因型和基因型和表型的變化表型的變化. . 限制酶圖譜限制酶圖譜不必依賴表型變化不必依賴表型變化, ,酶譜的變化一定是基因型發(fā)生酶譜的變化

17、一定是基因型發(fā)生了變化了變化, ,但不一定發(fā)生了表型變化但不一定發(fā)生了表型變化, ,即即表型的變化不一定會導致酶表型的變化不一定會導致酶譜變化譜變化. .1)1) 缺失突變體的檢測缺失突變體的檢測: :某某DNADNA片段消失片段消失, ,代之以一較小代之以一較小DNADNA片段片段. .2)2) 插入突變體的檢測插入突變體的檢測: :某某DNADNA片段消失片段消失, ,代之以一較大代之以一較大DNADNA片段片段. . DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制缺失和插入突變體的檢測（缺失和插入突變體的檢測（I I）I III II點突變的檢測（點突變的檢測（IIII）DNA限制酶切反應和限制酶譜繪

18、制 3 3）點突變的檢測）點突變的檢測: : 某某DNADNA片段消失片段消失, ,代之以兩較小的代之以兩較小的DNADNA片段片段. .前者的長度等于后兩者長度之和前者的長度等于后兩者長度之和( (位點增加位點增加) )；某兩；某兩DNADNA片段消片段消失失, ,代之以一較大代之以一較大DNADNA片段，前者的長度之和等于后者長度片段，前者的長度之和等于后者長度( (位位點消失點消失).). 3.3. 重組頻率的測定重組頻率的測定 同一染色體座位上的等位基因可能具有不同的表型同一染色體座位上的等位基因可能具有不同的表型, ,從而構(gòu)成從而構(gòu)成遺傳多型性遺傳多型性. .等位基因的限制酶譜也可能

19、具有多型性等位基因的限制酶譜也可能具有多型性, ,這就是限這就是限制酶片段長度多型性制酶片段長度多型性(Restriction fragment length (Restriction fragment length polymorphism, polymorphism, RFLPRFLP) )不同個體不同個體 總總DNADNA限制酶完全酶切限制酶完全酶切SouthernSouthern印跡印跡雜交雜交 結(jié)果分析結(jié)果分析DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 當不同個體交配時當不同個體交配時, ,除自由組合外除自由組合外, ,也可發(fā)生也可發(fā)生重組重組, ,如不同果蠅交配時如不同果蠅交配時, ,其后代

20、的表型和限制酶譜可為其后代的表型和限制酶譜可為: : 表表型型 紅紅: :白白=1:1, =1:1, 限制酶譜限制酶譜 30%30%個體已發(fā)生了重組個體已發(fā)生了重組. . 4. 4. 遺傳疾病的診斷遺傳疾病的診斷 分析正常人與遺傳病患者的某些分析正常人與遺傳病患者的某些DNADNA片段的限制酶譜片段的限制酶譜, ,便可發(fā)便可發(fā)現(xiàn)其差異現(xiàn)其差異, ,并總結(jié)出各種遺傳疾病的限制酶長度多態(tài)性圖。臨床并總結(jié)出各種遺傳疾病的限制酶長度多態(tài)性圖。臨床診斷時，將遺傳病可疑患者的限制酶譜與之比較診斷時，將遺傳病可疑患者的限制酶譜與之比較, ,便可判斷其是便可判斷其是否患有此病否患有此病. .DNA限制酶切反應

21、和限制酶譜繪制第五節(jié)第五節(jié)DNA DNA 的的 連連 接接 DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制一一. DNA. DNA的連接方法的連接方法 兩種不同的兩種不同的DNADNA分子可以經(jīng)過下述的方法之一進行連接分子可以經(jīng)過下述的方法之一進行連接, ,而方而方法的選用則是根據(jù)其兩者末端的法的選用則是根據(jù)其兩者末端的DNADNA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu). . 1. 1. 直接連結(jié)法直接連結(jié)法-該法適用于該法適用于: : 1) 1) 同種限制酶作用不同同種限制酶作用不同DNADNA片段產(chǎn)生的片段產(chǎn)生的相同粘性末端相同粘性末端 重組重組DNADNA可用同種酶再切開可用同種酶再切開, ,但識別簡并序列的限制酶除外但識別簡并序

22、列的限制酶除外( (如如AraAraI)I) 2) 2) 不同種限制酶作用不同不同種限制酶作用不同DNADNA片段產(chǎn)生的片段產(chǎn)生的相容性末端相容性末端 i.i.重組重組DNADNA分子不能再為這兩種酶所作用分子不能再為這兩種酶所作用, ,如如: :BamBamHI/HI/BglBglIIII ii. ii.重組重組DNADNA分子可為其中一種酶所作用分子可為其中一種酶所作用, ,但為另一但為另一種酶作用的可能性較小種酶作用的可能性較小, ,如如MboMboI/I/BamBamHIHI 3) PCR 3) PCR產(chǎn)物與特定載體的連接產(chǎn)物與特定載體的連接 4) 4) 限制酶和其他方式產(chǎn)生的限制酶和

23、其他方式產(chǎn)生的平整末端平整末端. .DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制2.2.人工接頭連接法人工接頭連接法1) 1) 人工接頭（人工接頭（linkerlinker）的結(jié)構(gòu)）的結(jié)構(gòu) i. i. 中軸對稱互補中軸對稱互補, ,可自行退火形成雙鏈可自行退火形成雙鏈. .如如: : 5-CCG5-CCGGAATTCGAATTCCGG- 3CGG- 3 3-GGC3-GGCCTTAAGCTTAAGGCC-5GCC-5 ii. ii. 至少有一特定的限制酶識別位點至少有一特定的限制酶識別位點 iii. iii. 某種限制酶的一套人工接頭可使插入片段與表達載體保某種限制酶的一套人工接頭可使插入片段與表達載體保

24、持同相持同相. .如如: : 八聚體八聚體 d(Gd(GGAATTCGAATTCC)C) 十聚體十聚體 d(CGd(CGGAATTCGAATTCCG)CG) 十二聚體十二聚體 d(CCGd(CCGGAATTCGAATTCCGG)CGG)2) 2) 用途用途 i. i. 平整末端的連接平整末端的連接( (各種結(jié)構(gòu)的各種結(jié)構(gòu)的DNADNA末端均可經(jīng)過修飾變成末端均可經(jīng)過修飾變成平整末端平整末端) ) 2 X 5-CCG2 X 5-CCGGAATTCGAATTCCGG-3CGG-3退火退火DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 ii. ii. 產(chǎn)生新的克隆位點產(chǎn)生新的克隆位點 iii. iii. 合成匹配

25、接頭合成匹配接頭3) 3) 連接方法連接方法 人工接頭磷酸化人工接頭磷酸化 退火形成雙鏈退火形成雙鏈 與目的與目的DNADNA相連相連 限制限制 酶切酶切 兩兩DNADNA分子相連分子相連4) 4) 適用范圍適用范圍 人工接頭連接法適合于那些只有一種人工接頭連接法適合于那些只有一種DNADNA片段需加人工接頭片段需加人工接頭就可以與另一就可以與另一DNADNA分子相連的分子相連的DNADNA分子分子. .利用人工接頭也可使任意利用人工接頭也可使任意兩個平端的兩個平端的DNADNA分子相連分子相連. .這種直接相連的辦法簡便這種直接相連的辦法簡便, ,快速快速, ,但最后但最后連接起來的連接起來

26、的DNADNA可能具有不同的結(jié)構(gòu)可能具有不同的結(jié)構(gòu). .為避免這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生為避免這些結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生, ,可可先使一種先使一種DNADNA先加上人工接頭后先加上人工接頭后, ,再與另一種再與另一種DNADNA分子相連分子相連. .DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制3. 3. 匹配接頭連接法匹配接頭連接法人工接頭雖然可連接兩個具不同末端的人工接頭雖然可連接兩個具不同末端的DNADNA分子分子, ,但這些末端在但這些末端在加入人工接頭前必須變?yōu)槠秸┒思尤肴斯そ宇^前必須變?yōu)槠秸┒? .然而然而, ,有時實驗不容許使用有時實驗不容許使用人工接頭或使用人工接頭不方便人工接頭或使用人工接頭不方便, ,此時此

27、時, ,便可使用匹配接頭便可使用匹配接頭, ,它可它可用于直接連接各種具不同末端的用于直接連接各種具不同末端的DNADNA分子分子: :i. i. 平端平端 + + 突起末端突起末端(5-(5-突起突起, 3-, 3-突起突起) )ii.ii.粘性末端粘性末端 (5-(5-突起突起 + 5-+ 5-突起突起: : EcoEcoRI+RI+HinHindIIIdIII 5- 5-突起突起 + 3-+ 3-突起突起: : EcoEcoRI+RI+PstPstI I 3- 3-突起突起 + 3-+ 3-突起突起: : PstPstI+I+SacSacI)I)1)1) 匹配接頭的結(jié)構(gòu)特點匹配接頭的結(jié)構(gòu)

28、特點 i.i. 由兩個低聚核苷酸組成由兩個低聚核苷酸組成 ii. ii. 部分區(qū)域可以互補部分區(qū)域可以互補 iii. iii. 退火后的雙鏈低聚核苷酸可以形成兩個不同的末端退火后的雙鏈低聚核苷酸可以形成兩個不同的末端2)2) 匹配接頭的種類匹配接頭的種類DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 i. i. 預制匹配接頭預制匹配接頭( (連接平端和粘性末端連接平端和粘性末端) ) 人工接頭人工接頭 + + 匹配接頭匹配接頭 預制匹配接頭預制匹配接頭 ii. ii. 轉(zhuǎn)換匹配接頭轉(zhuǎn)換匹配接頭( (連接連接5-5-突起和突起和3-3-突起末端突起末端) ) 二匹配接頭退火二匹配接頭退火 轉(zhuǎn)換匹配接頭轉(zhuǎn)換匹配

29、接頭 二人工接頭二人工接頭 連接酶連接酶 雙酶切雙酶切 轉(zhuǎn)換匹配接頭轉(zhuǎn)換匹配接頭 iii. iii. 單鏈匹配接頭單鏈匹配接頭( (連接連接5-5-突起和突起和3-3-突起末端突起末端) )4. 4. 同聚物加尾連接法同聚物加尾連接法 在兩個不同的在兩個不同的DNADNA分子末端各加上一個可互補的同聚物分子末端各加上一個可互補的同聚物, ,即即ATAT或或GC.GC.5. 5. 連接方法的選擇連接方法的選擇 方法選擇的依據(jù)方法選擇的依據(jù): : 1) 1) 兩兩DNADNA分子的末端結(jié)構(gòu)分子的末端結(jié)構(gòu) 2) DNA 2) DNA 分子的限制酶譜分子的限制酶譜 3) 3) 是否需要回收是否需要回收

30、DNADNA片段片段DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制連接方式的選擇連接方式的選擇載體末端載體末端 外源外源DNADNA末端末端 常規(guī)連接常規(guī)連接 脫磷酸化脫磷酸化 同聚物同聚物 平端連接平端連接 補齊補齊, ,人工接頭人工接頭 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 載體載體 加尾加尾 外切酶外切酶 5-5-突起突起 相容相容5-5-突起突起 第二選擇第二選擇 第一選擇第一選擇 不能不能 不能不能 不能不能 5-5-突起突起 非相容非相容5-5-突起突起 不能不能 結(jié)合使用接頭結(jié)合使用接頭 不能不能 不能不能 第一選擇第一選擇 3-3-突起突起 相容相容3-3-突起突起 唯一選擇唯一選擇 不能不能 不能不能 不能

31、不能 不能不能 3-3-突起突起 非相容非相容3-3-突起突起 不能不能 不能不能 第一選擇第一選擇 不能不能 第二選擇第二選擇 或平端或平端 3-3-突起突起 5-5-端突起端突起 不能不能 不能不能 第一選擇第一選擇 不能不能 第二選擇第二選擇 ( (補齊后補齊后) ) 平端平端 平端平端 不能不能 可能可能 可能可能 第一選擇第一選擇 可能可能 平端平端 3-3-或或5-5-突起突起 不能不能 不能不能 第一選擇第一選擇 不能不能 第二選第二選擇擇DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制二二. DNA. DNA的連接反應的連接反應 1.1. 連接反應理論連接反應理論 當兩種當兩種DNADNA分子

32、相連時分子相連時, ,它們可能產(chǎn)生不同的結(jié)果它們可能產(chǎn)生不同的結(jié)果, ,這些結(jié)果這些結(jié)果與以下因素有關與以下因素有關: : 1) 1) 連接反應系統(tǒng)中的總連接反應系統(tǒng)中的總DNADNA濃度濃度i i 2) 2) 一個一個DNADNA分子靠近同一分子另一端的有效濃度分子靠近同一分子另一端的有效濃度j, j, 該值該值與與DNADNA的長度成反比的長度成反比, ,即即DNADNA分子越大分子越大, ,該分子的兩末端越不該分子的兩末端越不易相互作用易相互作用( (即自身環(huán)化即自身環(huán)化) ) 3) 3) 兩種不同兩種不同DNADNA分子的克分子濃度之比值分子的克分子濃度之比值. . 2. 2. 連接反

33、應條件連接反應條件 1)1) 評估連接反應結(jié)果的方法評估連接反應結(jié)果的方法 i.i. 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 ii.ii.大腸桿菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化 2)2) 反應條件反應條件DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 i. i. 溫度溫度 ii. ATPii. ATP濃度濃度 iii. iii. 時間時間 iv. iv. 連接酶濃度連接酶濃度 v.v.克分子比率克分子比率DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 第六節(jié)第六節(jié) PCR PCR 技技 術(shù)術(shù)DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制一一DNA DNA 體外擴增技術(shù)體外擴增技術(shù) 1.1. PCRPCR反應體系反應體系 1) 1) 基本原理基本原理(PCRP

34、olymerase Chain Reaction (PCRPolymerase Chain Reaction 聚合聚合酶鏈式反應酶鏈式反應) ) 一個一個DNADNA經(jīng)經(jīng)n n次擴增后次擴增后, , 一個一個DNADNA分子可變?yōu)榉肿涌勺優(yōu)? 2n n個分個分子子DNADNA擴增需要對待擴增的擴增需要對待擴增的DNADNA序列有所了解，至少要對其序列有所了解，至少要對其兩側(cè)的核苷酸序列為已知，以便合成寡核苷酸引物兩側(cè)的核苷酸序列為已知，以便合成寡核苷酸引物 2) 2) 基本操作基本操作 待擴增的待擴增的DNADNA片段片段+dNTP+TrisHCl+dNTP+TrisHCl緩沖液緩沖液+ +兩

35、引物兩引物 9090變性變性30 5030 50退火退火30 30 加入加入Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 75 1 75 1 進入第二次循環(huán)進入第二次循環(huán) 25-3025-30次循環(huán)次循環(huán)DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制90變性解鏈與引物退火，50引物及延伸，75n次擴增第一次循環(huán)第二次循環(huán)353535535335533533533555355390變性解鏈與引物退火，505335533553355335引物及延伸，753353355533533555PCRPCR原理示意圖原理示意圖DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制2. PCR2. PCR產(chǎn)物的鑒定產(chǎn)物的鑒定 1) PCR1) PC

36、R產(chǎn)物的大小和限制酶譜分析產(chǎn)物的大小和限制酶譜分析 bp bp500100600500100RE2) 2) 寡聚核苷酸限制性內(nèi)切酶片段分析（寡聚核苷酸限制性內(nèi)切酶片段分析（OROR分析分析，Oligomer Restriction analysisOligomer Restriction analysis） OROR分析對于分析對于PCRPCR產(chǎn)物的限制酶位點上發(fā)生了點突變的檢測產(chǎn)物的限制酶位點上發(fā)生了點突變的檢測極其有用極其有用DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制GACTCCTG GCTGAGGAC CAT33GACTCCTG GCTGAGGAC CTA533555beta A beta S G

37、ACTCCTG GATCTGAGGAC C3355*GACTCCTG GAACTGAGGAC C3355*CTGAGGAC CT3355*GACTCCTG GAGACTCCTG GAACTGAGGAC C3355* GGAC CACTCCTG GAA3355*GCTGAGGAC CT3355*GACTCCTG GAHinfIDdeI變性/與標記寡核苷酸探針復性8 n.t3 n.tPCRPCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的OROR鑒定鑒定DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制3) 3) 分子雜交分子雜交 適合于檢測適合于檢測PCRPCR產(chǎn)物的非限制酶位點上堿基突變。它是利用產(chǎn)物的非限制酶位點上堿基突變。它是利用兩條引物

38、鏈間的特異性兩條引物鏈間的特異性DNADNA片段作探針片段作探針( (常為人工合成的一段低常為人工合成的一段低聚核苷酸，約聚核苷酸，約20 n.t.).20 n.t.).當這種探針的核苷酸序列與待測的當這種探針的核苷酸序列與待測的DNADNA核苷酸序列完全互補時才能雜交。如果利用多種等位基因特異核苷酸序列完全互補時才能雜交。如果利用多種等位基因特異性寡核苷酸探針（性寡核苷酸探針（allele-specific Oligonucleotide, ASOallele-specific Oligonucleotide, ASO）與與PCRPCR產(chǎn)物進行雜交，可檢測出產(chǎn)物進行雜交，可檢測出PCRPCR

39、產(chǎn)物的堿基突變。產(chǎn)物的堿基突變。 可直接利用斑點雜交方法用于基因型分析可直接利用斑點雜交方法用于基因型分析110bp -珠蛋白PC03 19A 19S 19C PC0419A 19S 19C AAASSSSCCCACXXAAASSSSCCCACXXPC03:ACACAACTGTGTTCACTAGCPC04:CAACTTCATCCACGTTCACC19CA:CTCCT AGGAGAAGTCTGC19ST:CTCCTG GGAGAAGTCTGC19A:CTCCTGAGGAGAAGTCTGCDNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 4) 4) 核苷酸序列分析核苷酸序列分析 DNADNA擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物 變性

40、變性 與末端標記的擴增引物或定序引與末端標記的擴增引物或定序引物退火物退火 雙脫氧核苷酸鏈終止反應，測定雙脫氧核苷酸鏈終止反應，測定DNADNA序列序列55335353535變性與引物退火dNTP,ddNTP,Klenow frag.A C G TPCR擴增產(chǎn)物DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制二二Taq DNATaq DNA聚合酶的特點聚合酶的特點 Taq DNATaq DNA聚合酶是從一種極度嗜熱水生棲熱菌聚合酶是從一種極度嗜熱水生棲熱菌YT-1YT-1中分中分離純化而得。該酶的分子量為離純化而得。該酶的分子量為63-68 kD63-68 kD 1. 1. 無磷酸單酯酶、磷酸二酯酶以及單鏈外

41、切酶活性，無無磷酸單酯酶、磷酸二酯酶以及單鏈外切酶活性，無內(nèi)切內(nèi)切酶活性酶活性，但具有依賴于聚合酶活性的，但具有依賴于聚合酶活性的5 35 3外切外切酶活性酶活性 2. 2. 最適反應溫度為最適反應溫度為8080 3. 3. 最適最適pH8.0pH8.0和最佳反緩沖液和最佳反緩沖液TrisHCl TrisHCl 4. 4. 最佳二價陽離子最佳二價陽離子MgMg2+2+ （10 mM10 mM） 5. 5. 具良好的熱穩(wěn)定性：在具良好的熱穩(wěn)定性：在9090下連續(xù)反應下連續(xù)反應3030分鐘仍有分鐘仍有70%70%的酶活的酶活DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制50 100 150 溫度摻入的 H-dN

42、TTP微克分子數(shù)3相對酶活的分率20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 95 90 70 反應時間（分）摻入的 H-dNTTP微克分子數(shù)320 40 60 80 25 50 75 Mg二價陽離子濃度（mM)Mn+摻入的 H-dNTTP微克分子數(shù)3100 200 6 7 8 9 10 pH1 2 3 1. 25 mM磷酸緩沖液2. 25 mMTris-HCl緩沖液3. 25 mM甘氨酸緩沖液Taq DNATaq DNA聚合酶的特性聚合酶的特性DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制當采用當采用Taq DNATaq DNA聚合酶進行聚合酶進行DNADNA體外擴增時，必須考慮

43、到以下五個參數(shù)：體外擴增時，必須考慮到以下五個參數(shù)： 1 1）熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性：在：在PCRPCR循環(huán)中循環(huán)中DNADNA的變性時間常為的變性時間常為30-6030-60，若循環(huán)，若循環(huán)3030次，其累次，其累計加熱變性時間為計加熱變性時間為15-3015-30。Taq DNATaq DNA聚合酶在聚合酶在9090下保溫下保溫3030仍具有仍具有70%70%酶活性，可大大減少操作步驟，酶活性，可大大減少操作步驟，易于實現(xiàn)自動化易于實現(xiàn)自動化*2 2）模板與引物的特異性模板與引物的特異性：當：當退火溫度和退火溫度和DNADNA鏈延伸鏈延伸時溫度時溫度偏低偏低時，引物與模時，引物與模板配對的板配對

44、的特異性大大降低特異性大大降低，從而導致一些不需要的，從而導致一些不需要的DNADNA片段被擴增。顯然，片段被擴增。顯然，其產(chǎn)物的專一性大大降低，使結(jié)果無法分析。由于其產(chǎn)物的專一性大大降低，使結(jié)果無法分析。由于Taq DNATaq DNA聚合酶最適反聚合酶最適反應溫度為應溫度為8080，退火溫度可提高到，退火溫度可提高到5555以上以上，由此大大減少了引物與模板，由此大大減少了引物與模板的非專一性結(jié)合，使的非專一性結(jié)合，使產(chǎn)物均一性大大增加產(chǎn)物均一性大大增加*3 3）合成產(chǎn)率合成產(chǎn)率：反應底物和產(chǎn)物在：反應底物和產(chǎn)物在DNADNA擴增中不斷發(fā)生變化，最終將會導致擴增中不斷發(fā)生變化，最終將會導致

45、聚合反應進入聚合反應進入平臺期平臺期，平臺期出現(xiàn)的時間與聚合酶的特性有關。研究表明，平臺期出現(xiàn)的時間與聚合酶的特性有關。研究表明，利用利用KlenowKlenow片段進行片段進行2020次擴增后進入平臺期，累積產(chǎn)物拷貝數(shù)為次擴增后進入平臺期，累積產(chǎn)物拷貝數(shù)為2 210105 5，當采用當采用Taq DNATaq DNA聚合酶時，擴增聚合酶時，擴增2525次后才進入平臺期，拷貝數(shù)可大次后才進入平臺期，拷貝數(shù)可大4 410106 6* * * *4 4）延伸長度延伸長度：有時為了獲取較長：有時為了獲取較長DNADNA片段的擴增，這就要求片段的擴增，這就要求DNADNA聚合酶具聚合酶具有較強的延伸能

46、力。當擴增片段大于有較強的延伸能力。當擴增片段大于250 bp250 bp時，時，KlenowKlenow片段和片段和T4T4聚合酶擴聚合酶擴增產(chǎn)率大大降低。利用增產(chǎn)率大大降低。利用T7 DNAT7 DNA聚合酶聚合酶，可使擴增片段達，可使擴增片段達2 Kb2 Kb。當利用。當利用Taq Taq DNADNA聚合酶聚合酶時，最長延伸長度為時，最長延伸長度為4.4 Kb4.4 Kb. .DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 經(jīng)改造的經(jīng)改造的Taq DNATaq DNA聚合酶可擴增出聚合酶可擴增出40 kb40 kb的的DNA DNA 片段片段. . 5 5）擴增產(chǎn)物的可靠性擴增產(chǎn)物的可靠性：評估：評

47、估DNADNA聚合酶的一個重要指標是它復制聚合酶的一個重要指標是它復制DNADNA的可靠的可靠性，即摻入錯誤堿基的頻率。這對于性，即摻入錯誤堿基的頻率。這對于PCRPCR技術(shù)的可靠性是至關重要的。技術(shù)的可靠性是至關重要的。KlenowKlenow片段的錯誤摻入率為片段的錯誤摻入率為1010-4-4，Taq DNATaq DNA聚合酶的錯誤摻入率為聚合酶的錯誤摻入率為5 51010- -3 3 ，而，而T4T4聚合酶的錯誤摻入率為聚合酶的錯誤摻入率為1010-7-7。 *注：注：1 1）退火溫度常與引物的長度和堿基組成有直接相關關系，）退火溫度常與引物的長度和堿基組成有直接相關關系，引物越長或引

48、物越長或GCGC含量較高，退火的溫度可以高些含量較高，退火的溫度可以高些，反之則低反之則低些。退火溫度越高，引物些。退火溫度越高，引物與模板（即擴增的與模板（即擴增的DNADNA）結(jié)合的特異性越高，這可大大減少非特異性）結(jié)合的特異性越高，這可大大減少非特異性DNADNA片段的擴增。片段的擴增。 引物的長度常為引物的長度常為20-2820-28聚體，其中有聚體，其中有50%50%以上的以上的GCGC含量，無自身互補序含量，無自身互補序列，特別是列，特別是33末端不應有內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)，引物加量為每末端不應有內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)，引物加量為每100l l20pmol.100l l20pmol. * * *2)

49、2)出現(xiàn)平臺期的原因可能有出現(xiàn)平臺期的原因可能有：后期循環(huán)酶濃度或聚合時間不足；：后期循環(huán)酶濃度或聚合時間不足；引物耗盡；引物耗盡；dNTPdNTP耗盡；產(chǎn)物濃度過高，以致耗盡；產(chǎn)物濃度過高，以致ds-DNAds-DNA解鏈后又迅速解鏈后又迅速退火，不能與引物結(jié)合。退火，不能與引物結(jié)合。 *3 3）鏈延伸長度與延伸時間有關鏈延伸長度與延伸時間有關，對于，對于Taq DNATaq DNA聚合酶，每分鐘可形成聚合酶，每分鐘可形成2000 n.t.2000 n.t.或更多。如果要擴增或更多。如果要擴增3-4 Kb3-4 Kb的的DNADNA，在，在7272下需將酶延伸時間下需將酶延伸時間增至增至3-

50、43-4分鐘。分鐘。DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制三三PCRPCR方法方法 1.1. 強化強化PCRPCR（Boosted PCRBoosted PCR） 將將PCRPCR分為兩個階段：分為兩個階段： 1 1）引物與模板之比為）引物與模板之比為10107 7，擴增，擴增2020個周期個周期 2 2）引物與模板之比為）引物與模板之比為10101212 10 101313，再擴增，再擴增1010個周期個周期 該法適合于待擴增該法適合于待擴增DNADNA濃度較低時。濃度較低時。 2.2.混合寡核苷酸引物混合寡核苷酸引物PCRPCR（mixed oligonucleotide mixed oligo

51、nucleotide primed amplification of cDNA,MOPACprimed amplification of cDNA,MOPAC） 根據(jù)各氨基酸最常用的密碼子合成一系列引物，對某一根據(jù)各氨基酸最常用的密碼子合成一系列引物，對某一特定特定cDNAcDNA進行擴增。進行擴增。 3. 3. 錨定錨定PCRPCR(Anchored PCR(Anchored PCR，A-PCR)A-PCR)5 3 5 3 3 5PCRTdTdGTP5 3 3 55 3 G.G 3 55 C.C 3 G.G 3 55 C.C 3 G.G 3 5DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制4. 4. 連結(jié)

52、連結(jié)PCRPCR(ligation mediated PCR)(ligation mediated PCR) 該法可用于核苷酸序列測定該法可用于核苷酸序列測定,DNA,DNA足跡分析技術(shù)和測定足跡分析技術(shù)和測定甲基化作用甲基化作用 DNaseI 變性、引物 鏈延伸 加接頭（引物） 外側(cè)引物內(nèi)側(cè)引物 連接引物 標記引物DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制5. 5. 不對稱不對稱PCR(Asymmetrical PCR)PCR(Asymmetrical PCR)采用不同引物濃度比率，如采用不同引物濃度比率，如5050：1 1，100100：1 1，可得大量拷貝的，可得大量拷貝的ssDNAssDNA用于

53、測序用于測序6. 6. GCGC串串PCR (GC clamp PCR)PCR (GC clamp PCR)應用應用變性劑梯度凝膠電泳變性劑梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)electrophoresis, DGGE)可檢測出可檢測出DNADNA片段中一對堿基的變化，片段中一對堿基的變化，在在DNADNA分子一端加上一分子一端加上一GCGC串（約串（約40 n.t.40 n.t.）利用它的高解鏈溫度特）利用它的高解鏈溫度特性，在梯度變性膠上可檢測出原性，在梯度變性膠上可檢測

54、出原DNADNA鏈中最高解鏈區(qū)內(nèi)的點突變鏈中最高解鏈區(qū)內(nèi)的點突變5 GC 20nt 1 2 3 4 1. 野生型 2-4.突變型DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 7.7.競爭引物競爭引物PCRPCR (competitive oligonucieotide primer (competitive oligonucieotide primer PCR,COP-PCR)PCR,COP-PCR) 有一個堿基變化的兩種引物在較寬松的復性條件下競爭有一個堿基變化的兩種引物在較寬松的復性條件下競爭DNADNA模板，其中只有完全互補的引物才能大量配對。該法可用模板，其中只有完全互補的引物才能大量配對。該法可

55、用于測定某一于測定某一DNADNA片段上是否帶有某一已知堿基置換。片段上是否帶有某一已知堿基置換。準確配對引物 錯配引物 共同引物 PCR oror模板 模板 or DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制模板 PCR 等位基因(無突變) 模板 等位基因(有突變) 無PCR產(chǎn)物8.8.等位基因?qū)Ｒ坏任换驅(qū)Ｒ籔CR(Allele specific PCR,ASPCR)PCR(Allele specific PCR,ASPCR) 該法可用于檢測點突變。如用于檢測鐮刀形貧血癥。該法可用于檢測點突變。如用于檢測鐮刀形貧血癥。9.9.反轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn)PCRPCR(inverserar inverted PCR)(in

56、verserar inverted PCR) 該法可用于擴增已知該法可用于擴增已知 序列兩側(cè)的未知序列序列兩側(cè)的未知序列R2 X LigaseY R1 Y X Z R2 R1 P1 Z R2P2DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制10.10.反向反向PCRPCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)(reverse transcription PCR, RT-PCR) 主要用于主要用于mRNAmRNA的的PCRPCR擴增擴增 mRNA引物15RT53AAA.A3TTT.T53AAA.ARNaseH53TTT.T53AAA.A53TTT.T53AAA.A53TTT.T

57、535353RT53TTT.TTdT + dGTPGG.GCC.C 限制酶識別序列 限制酶識別序列DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制 11.11.加端加端PCR(Add-on PCR)PCR(Add-on PCR) 在合成引物時加上研究者所需要的核苷酸序列，如某種限制在合成引物時加上研究者所需要的核苷酸序列，如某種限制酶的識別序列，某一基因的調(diào)控或其它必需序列酶的識別序列，某一基因的調(diào)控或其它必需序列 12.12.錯配錯配PCRPCR（mismatched PCR)mismatched PCR) 利用該法可在一已知利用該法可在一已知DNADNA序列中引起點突變，缺失突變和序列中引起點突變，缺失突

58、變和插入突變。插入突變。 P1 P3 P2 靶順序 P4 分別擴增 5 3 3 5 5 3 3 5除去引物變性/復性P1 P4 產(chǎn)生點突變DNAPCR延伸3553DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制13.13.重組重組PCRPCR(Recombinant PCR)(Recombinant PCR) 利用該法可將不同基因的利用該法可將不同基因的DNADNA片段連接在一起。片段連接在一起。與基因2啟動子同源基因1編碼區(qū)PCR53變性/復性啟動子與基因1編碼區(qū)同源PCR533553355335鏈延伸基因23553DNA限制酶切反應和限制酶譜繪制14. 14. 基因克隆基因克隆PCRPCR 利用該法可獲一完整的利用該法可獲一完整的cDNAcDNA克隆。克隆。SP6T7PCRIPCRIIPCRIII四四. . 定量定量PCRPCR技術(shù)技術(shù) 1.1. 基本原理基本原理 N=NN=N0 0(1+eff)(1+eff)n n N- N-最終拷貝數(shù)；最終拷貝數(shù)；N N0 0- -起