抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性測定方法

1、抗氧化酶（sod、pod、cat）活性測定方法一、 超氧化物歧化酶（sod）活性測定（氮藍(lán)四唑光化還原法）1、試劑的配制（1）0.05mol/l磷酸緩沖液(pbs，ph7.8)：a母液：0.2mol/l磷酸氫二鈉溶液: 取na2hpo412h2o（分子量358.14）71.7g；b母液：0.2mol/l磷酸二氫鈉溶液：取nah2po42h2o（分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。0.05mol/l pbs（ph7.8）的配制：分別取a母液(na2hpo4) 228.75ml，b母液(nah2po4) 21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。參考文獻(xiàn)：李合生主編：

2、植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù).高等教育出版社，2000：267268。（2）14.5mm甲硫氨酸溶液：取2.1637g met用磷酸緩沖液（ph7.8）定容至1000ml。（3）30m edta-na2溶液：取0.001gedta-na2用磷酸緩沖液定容至100ml。（4）60m核黃素溶液：取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mm 氮藍(lán)四唑(nbt)溶液：取0.1840g nbt用pbs定容至100ml，避光保存。酶液制備：取0.2g（可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷的研缽中，加入1.6ml 50mmol/l預(yù)冷的磷酸緩沖液（ph7.8）

3、在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4、12000g下離心20min，上清液即為酶液。2、酶活性測定（1）反應(yīng)混合液配制(以60個樣為準(zhǔn))：分別取met溶液162ml，edta-na2溶液0.6ml，磷酸緩沖液5.4ml，nbt溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后搖勻；（2）分別取3ml反應(yīng)混合液和30l酶液于試管中（3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照下反應(yīng)20min；同時做兩支對照管，其中1支試管取3ml反應(yīng)混合液加入30l pbs（不加酶液）照光后測定作為最大光還原管，另1支只加緩沖液置于暗中測定時用于調(diào)零。（4）以不照光的對照管（只有緩沖液并置于暗處）調(diào)零后，避光測od560

4、(出現(xiàn)顏色即可測定)。（5）酶活性計(jì)算：sod活性單位以抑制nbt光化還原50所需酶量（測的樣品值要在最大管的一半左右才合適，否則要調(diào)整酶量）為1個酶活單位（u）。sod總活性 ( ack-ae )v/（1/2ackwvt）sod比活力sod總活性/蛋白質(zhì)含量sod總活性以鮮重酶單位每克表示（u/g fw）；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；ack為照光對照管的吸光度；ae為樣品管的吸光度；v為樣品液總體積（ml,1.6ml，加入pbs的體積)；vt為測定時的酶液用量（ml，30ul）；w為樣品鮮重（g，測定時應(yīng)換算為葉綠體的質(zhì)量mg）；蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。二、pod、cat酶活性的測定

5、粗酶液制備同sod。1、 過氧化物酶（pod）活性測定（愈創(chuàng)木酚法）（1）試劑配制：0.2mol/l磷酸緩沖液(ph6.0)：分別取a母液(na2hpo4 ) 123ml和b母液(nah2po4 ) 877ml混勻即為1000ml pbs(0.2m，ph6.0)；（2）反應(yīng)混合液配制（以60個樣為準(zhǔn)）：取200ml pbs(0.2m，ph6.0)，加入0.076ml液體（原液）愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚）加熱攪拌溶解，冷卻后加入0.112ml 30的h2o2，混勻后保存于冰箱中備用。（3）樣品測定：取3ml反應(yīng)液并加入30l酶液，以pbs為對照調(diào)零，而后測定od470值（測定40秒）。（邊加樣邊測

6、定，測定前等待5秒，動作要快，如果慢的話，要保證每個樣品從加好樣到開始記時的時間相差不大）（4）酶活性計(jì)算：以每min od值變化（升高）0.01為1個酶活性單位（u）。pod=（a470vt）/（wvs0.01t） (u/g min)a470：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；w為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時間(min)；vt為提取酶液總體積（ml，(1.6ml）；vs為測定時取用酶液體積（ml，30ul）。2、 過氧化氫酶（cat）活性測定（1）試劑配制：0.15mol/l磷酸緩沖液（ph7.0）：取a母液(na2hpo4) 457.5 ml 和b母液(nah2po4) 292.5 ml混合后用蒸餾

7、水定容至1000ml。（2）反應(yīng)液配制：取200ml pbs（0.15m，ph7.0），加入0.3092ml 30%的h2o2（原液）搖勻即可。（3）樣品測定：取3ml反應(yīng)液加入0.1ml（可視情況調(diào)整）酶液，以pbs為對照調(diào)零，測定od240（紫外）（測定40s）。（4）酶活性計(jì)算：以每min od值減少0.01為1個酶活性單位（u）。cat=a240vt /（wvs0.01t） (u/g min)a240：為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；w為樣品鮮重(g)；t為反應(yīng)時間(min)；vt為提取酶液總體積（ml， 1.6ml）；vs為測定時取用酶液體積（ml, 0.1ml）。四、超氧陰離子自由基（o

8、2.-）產(chǎn)生速率的測定（羥胺氧化法）1、試劑的配制（1）1mm鹽酸羥胺溶液：稱取0.02085g鹽酸羥胺用蒸餾水定容至300ml；（2）17mm對氨基苯磺酸溶液：稱取1.1776g對氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加熱溶解后定容至400ml；（3）7mm-萘胺溶液：稱取0.4008g-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。2、o2.-含量的測定（1）樣品液提取方法同sod測定；（2）取0.5ml提取液（酶液）（可視情況調(diào)整用量）中加入0.5ml pbs（0.05m，ph7.8），1ml 1mm鹽酸羥胺溶液后搖勻。（3）在25下保溫1小時；（4）依次

9、先加入1ml 17mm對氨基苯磺酸，再加入1ml 7mm -萘胺，混合后快速搖勻；（5）在25下保溫20min后在3000g下離心3min后馬上進(jìn)行測定（或置于冰箱待測）；（6）以對照管調(diào)零（用水調(diào)零），取粉紅色水相液測定od530值（測定）；（7）o2.-含量的計(jì)算：由測得的od530，查no2-標(biāo)準(zhǔn)曲線得到no2-；根據(jù)羥胺與o2.-的反應(yīng)式：nh2oh2o2.-h+ no2-h2o2 h2o 計(jì)算o2.-，即no2-2=o2.-；再根據(jù)樣品與羥胺反應(yīng)的時間和樣品中的蛋白質(zhì)含量，求得o2.-產(chǎn)生速率（以nmol min-1mg-1蛋白表示，也可以nmol min-1g-1鮮重表示）。o2.

10、-產(chǎn)生速率=（cv）/（tw） （nmol min-1g-1鮮重）c為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度(umol/l)；v為測定時所取提取液用量(葉綠體稀釋后的體積)；t為反應(yīng)時間(60min)；w為樣品鮮重(葉綠體實(shí)際質(zhì)量g)參考文獻(xiàn)：王愛國，羅廣華植物生理學(xué)通訊，1990，（6）：5557五、丙二醛含量的測定1、試劑配制：10%tca：100g 三氯乙酸 1l0.67%tba：3.35g硫代巴比妥酸 500ml 10%tca （避光）2、測定步驟:0.2 樣品+1.6ml 10%tca 研磨12000g 離心 10min 上清1.5ml +1.5 0.67% tba 沸水煮30min 冷卻，離心上清o

11、d450，od532，od6003、計(jì)算組織中mda含量：mda濃度c (umol/l)=6.45(od532-od600)-0.56od450mda含量(umol/g fw)=cv/w式中v為提取液體積(1.6ml)，w為樣品鮮重(0.2g)。六、植物細(xì)胞質(zhì)膜透性的測定（電導(dǎo)儀法）（1）取新鮮葉片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自來水沖洗表面污漬，再用去離子水沖洗幾遍后用吸水紙吸干水分；（2）樣品剪碎（也可打孔取樣）放入試管（或15ml大離心管）中，加10ml去離子水，在室溫下放置3h使葉片充分吸水后測定溶液電導(dǎo)率(r1)；（3）再放入恒溫水浴鍋中在100沸水浴中煮20min以殺死葉片組織，用

12、冷水冷卻到室溫后測定溶液電導(dǎo)率(r2)；（4）用公式計(jì)算質(zhì)膜相對透性（用相對電導(dǎo)率表示）：相對電導(dǎo)率（%）=r1/r2100%還可以計(jì)算植株傷害程度： 傷害率=（處理電導(dǎo)率對照電導(dǎo)率）/（煮沸電導(dǎo)率對照電導(dǎo)率）100%七、可溶性蛋白含量的測定（考馬斯亮藍(lán)染色法）1、試劑的配制（1）考馬斯亮藍(lán)溶液配制：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)，溶于50 ml 90乙醇中，加入100 ml 85（w/v）的磷酸，再用蒸餾水定容到1。在過夜后過濾并貯于棕色瓶中，常溫下可在暗中保存一個月。（2）100g/ml牛血清蛋白（bsa）標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取25mg bsa加水溶解后定容至100 ml，再從中吸取40ml用蒸餾水定容至100 ml（也可取10mg bsa定容至100ml即為100g/ml標(biāo)準(zhǔn)bsa溶液）。2、樣品可溶性蛋白含量的測定（1）樣品可溶性蛋白含量測定：取20l提取液（酶液）加入80l，0.05