茶樹鳥氨酸轉氨酶基因CsδOAT的克隆與表達分析

1、園藝學報，（）： 2014411224652473 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140711；修回日期：20140925 基金項目：國家自然科學基金項目（31370014，31000315）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金項目（cars-23） 的茶樹鳥氨酸轉氨酶基因cs-oat克隆與表達分析 王偉東，疏再發(fā)，杜昱林，黎星輝，王玉花* （南京農(nóng)業(yè)大學茶葉科學研究所，南京 210095） 摘 要：根據(jù)已知鳥氨酸轉氨酶（-oat）的保守序列設計簡并引物，并利用rt

2、-pcr和race技術從迎霜茶樹中克隆獲得鳥氨酸轉氨酶基因，命名為cs-oat，其genbank登錄號為kj641844。該基因cdna全長為1 865 bp，編碼473個氨基酸，理論等電點為7.19，推測分子量為52.3 kd。序列比對分析結果表明，cs-oat主要功能域保守性較高，存在典型的plp結合位點；系統(tǒng)進化樹分析顯示，cs-oat的進化符合傳統(tǒng)的生物學分類，與其他雙子葉植物具有同一起源。qrt-pcr分析結果表明，cs-oat基因的表達存在明顯的組織特異性，在花中表達最高，其次是葉片，而在其他組織器官中表達較低。此外，cs-oat基因受高鹽、低溫、干旱、aba和氧化脅迫處理的誘導，

3、表明其參與了茶樹體內(nèi)各種非生物脅迫響應的過程。 關鍵詞：茶樹；鳥氨酸轉氨酶；cs-oat；克?。槐磉_分析 中圖分類號：s 571.1 文獻標志碼：a 文章編號：0513-353x（2014）12-2465-09 cloning and expression analysis of ornithine-aminotransferase gene cs-oat in camellia sinensis wang wei-dong，shu zai-fa，du yu-lin，li xing-hui，and wang yu-hua* （tea research institute，nanjing agr

4、icultural university，nanjing 210095，china） abstract：degenerate primers were designed according to the known conserved regions of ornithine- -aminotransferase gene（-oat），and the complete cdna sequence of -oat was firstly cloned from camellia sinensis using rt-pcr and race technologies. the cdna was t

5、ermed cs-oat（genbank accession kj641844）and its full-length was 1 865 bp encoding a protein of 473 amino acids. the molecular weight of cs-oat was 52.3 kd and theoretical isoelectric point was 7.19. the blast results showed that the functional domain of cs-oat is highly conserved with a typical plp

6、binding site. phylogenetic analysis of plant -oat reveals that the evolution of cs-oat corresponds with traditional biological classification. qrt-pcr analysis results showed that the expression of cs-oat has obvious tissue specificity，and it was higher in flower，followed by leaves，but lower in othe

7、r tissues. moreover，we found that the expression of cs-oat is induced by different abiotic stresses，including low- temperature，high salinity，aba，drought and oxidative stresses，implying that cs-oat is involved in * 通信作者 author for correspondence（e-mail：wangyuhua） 2466 園 藝 學 報 41卷 responding to abioti

8、c stress in plants. key words：tea plant；ornithine-aminotransferase；cs-oat；cloning；expression analysis 茶樹camellia sinensis（l.）o. kuntze容易遭受干旱、低溫和土壤污染等引起的非生物脅迫，導致茶葉產(chǎn)量和品質降低，最終影響茶葉生產(chǎn)的經(jīng)濟效益（王新超和楊亞軍，2003）。因此，發(fā)掘茶樹的抗性基因，培育抗性品種具有重大意義。 脯氨酸參與植物對多種逆境脅迫的響應，在提高植物抗逆性中發(fā)揮重要作用（焦蓉 等，2011b；謝虹 等，2011）。高等植物中脯氨酸的合成代謝有谷氨酸（g

9、lu）和鳥氨酸（orn）兩條途徑，1吡咯啉5羧酸合成酶（p5cs）是谷氨酸合成途徑的關鍵酶，而鳥氨酸轉氨酶（-oat）是鳥氨酸合成途徑的關鍵酶（全先慶 等，2007；趙瑞雪 等，2008）。許多研究表明，-oat對逆境脅迫下脯氨酸的積累起著重要作用，roosens等（2002）將擬南芥的-oat過表達至煙草中，顯著增加了煙草脯氨酸的含量，其抗旱性得到顯著提高；wu等（2003）將擬南芥的-oat遺傳轉化至水稻中，顯著提高了水稻的耐鹽能力；roosens等（1998）的研究表明，-oat的表達受到鹽脅迫的誘導。目前，-oat已從擬南芥（roosens et al.，1998）、甘蔗（張積森 等，

10、2009）、豌豆（strnsk et al.，2010）和煙草（焦蓉 等，2011a）等植物中克隆得到，但有關-oat功能的研究相對滯后，其參與植物逆境響應的作用機制尚不清楚。 本研究中從茶樹中克隆得到了cs-oat基因的cdna全長序列，利用生物信息學手段初步分析了該基因的結構和功能，并通過實時熒光定量pcr技術分析了該基因在各種非生物脅迫中的表達模式，以探究cs-oat與茶樹抗逆性的關系，為茶樹抗逆基因工程提供候選基因資源，為茶樹分子遺傳育種提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 植物材料與處理 基因克隆以體外培養(yǎng)的迎霜茶樹花粉管為試驗材料，花粉的收集和培養(yǎng)方法參考陳暄等（2011）所述。

11、脅迫處理試驗于2013年8月在南京農(nóng)業(yè)大學茶葉研究所進行，選取長勢一致的4年生迎霜茶樹苗為材料進行水培培養(yǎng)，培養(yǎng)液的配制參考wan等（2012）所述。將水培茶苗于光照培養(yǎng)箱中（晝夜溫度25 /22 ，光周期12 h/12 h，光照強度240 mol m-2 s-1，相對濕度75% 80%）預培養(yǎng)兩周后進行不同的脅迫處理，包括低溫（4 ）、nacl（600 mmol l-1）、aba（50 mol l-1）、peg 6000（20%）和h2o2（100 mmol l-1）。分別于0、1、2、4、8、12和24 h時取一芽兩葉各0.1 g，并將所取材料置于液氮中速凍，70 冰箱保存?zhèn)溆谩?分別取迎

12、霜茶苗的根、莖、葉、芽、花和果各0.1 g，并將所取材料置于液氮中速凍，70 冰箱保存，用于基因的組織特異性表達分析。 1.2 總rna提取和cdna合成 用rnaiso plus（takara，日本）提取培養(yǎng)后的茶樹花粉管和其他組織材料的總rna，并用dnase去除基因組dna污染。用one droptm od-1000 + spectrophotometer（one drop，usa）檢測rna濃度和質量，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna的完整性和穩(wěn)定性。使用primescripttm 1st strand cdna sycshesis kit（takara，大連）進行cdna第1鏈的合成。參照s

13、mart race cdna synthesis kit（clontech，美國）的操作步驟合成race擴增所用的cdna。 12期 王偉東等：茶樹鳥氨酸轉氨酶基因cs-oat的克隆與表達分析 2467 1.3 茶樹cs-oat的克隆 表1 引物序列 table 1 sequences of primers in this study 引物名稱 primer name 序列（53） sequence -oat f gtyaatcagggacaytgycayccwa -oat r agcatnacdtytttrtcdgcrag 3gsp1 atgaatactggtgccgaagg 3gsp2 g

14、tctcgtgttgtggctgctt 5gsp1 caacatctgggcgaact 5gsp2 atggaagcagccacaac cs-oat f aatctacaacttcatcgctcagcgccct cs-oat r ggtacccaacaaaattttattcacaat qcs-oat f gcggttaatcagggacat qcs-oat r acaccttcggcaccagta q-actin f gccatctttgattggaatgg q-actin r ggtgccacaaccttgatctt 利用dnaman軟件對genbank中已公布的葡萄、蓖麻、平邑甜茶、毛果楊

15、、煙草、白菜、甘藍型油菜、擬南芥和楊樹-oat酶的氨基酸序列進行同源分析，然后根據(jù)-oat基因的保守區(qū)段，利用primer premier 5.0軟件設計一對簡并引物-oat f和-oat r（表1），擴增一段長度為680 bp左右的中間片段。根據(jù)已獲得茶樹cs-oat基因的中間片段序列設計3、5-race引物3gsp1、3gsp2，5gsp1和5gsp2（表1），并結合通用引物分別擴增出該基因的3和5端序列。將所得的兩端序列與中間片段序列拼接得到基因全長，設計一對全長引物cs-oat f，cs-oat r（表1）高保真擴增出基因的全長。所用引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。 擴增產(chǎn)物經(jīng)

16、1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的條帶按照gel extraction kit（omega）使用說明進行回收，連接到pmda18-t vector（takara），由南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。 1.4 cs-oat生物信息學分析 利用ncbi進行核苷酸和氨基酸序列比對和保守結構域分析；用protparam預測蛋白質分子量和理論等電點；用smart（http：/smart. embl-heidelberg. de/）進行保守域分析；用dnaman 6.0進行多序列氨基酸同源性比較；用mega 6.0軟件中的鄰近相連法（nj，neighbor joining）構建系統(tǒng)進化樹；用wol

17、f psort（http：/wolfpsort. org/）進行亞細胞定位預測；用tmpred（http：/www. ch. embnet. org/software/tmpred_form. html）預測蛋白跨膜結構域；用netphos 2.0 serve（http：/www. cbs. dtu. dk/services/netphos/）預測蛋白質磷酸化位點；用swiss-model（http：/swissmodel. expasy. org/workspace/）預測蛋白質三級結構。 1.5 cs-oat熒光定量pcr分析 以茶樹-actin（孫美蓮 等，2010）作為內(nèi)參基因，參照s

18、ybr premix ex taqtm（takara，大連）的操作說明書對cs-oat基因的表達量進行熒光定量pcr分析，pcr體系為：sybr premix ex taq 10 l，上、下游引物各1 l，cdna 5 l，rnase free ddh2o 加至20 l。在eppendorf熒光定量pcr儀上進行反應。反應程序為：95 預變性60 s；95 15 s，60 15 s，72 45 s，40個循環(huán)。反應結束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線，采用2-ct法分析結果（livak & schmittgen，2001），每個樣品3次重復。使用primer premier 5.0設計cs-oa

19、t熒光定量所需的引物qcs-oat f、qcs-oat r和q-actin f、q-actin r（表1）。 用excel 2010和spss 19軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計學分析，用鄧肯氏新復極差法進行多重比較。 2 結果與分析 2.1 cs-oat基因克隆與序列分析 用簡并引物進行pcr擴增，獲得1條680 bp的中間片段（圖1，a1），該片段經(jīng)ncbi比對與其他已知植物的-oat序列有較高同源性，由此判斷為茶樹-oat基因cdna的部分序列。根據(jù)獲 2468 園 藝 學 報 41卷 得的中間片段序列設計race特異性引物進行巢式pcr擴增，5-race擴增獲得1條長度為761 bp的特異性片

20、段（圖1，b3、b4），3-race擴增獲得1條長度為1 201 bp的特異性片段（圖1，b1、b2）。序列拼接后設計全長引物，經(jīng)高保真pcr擴增獲得長度為1 865 bp的全長cdna序列（圖1，c1），包含1 422 bp的完整orf，編碼473個氨基酸，理論等電點為7.19，推測分子量為52.3 kd。經(jīng)blastp比對結果顯示，所得基因編碼的氨基酸與其他植物-oat的氨基酸序列具有很高的同源性，與獼猴桃ac-oat（actinidia chinensis，abr45720.1）同源性為89%，與可可tc-oat（theobroma cacao，xp_007025036.1）為85%，與

21、湖北海棠mh-oat（malus hupehensis，aeo51063.1）為82%，與煙草nt-oat（nicotiana tabacum，adm47437.1）為82%，與菊芋ht-oat（heliacshus tuberosus，ahj08571.1）為75%。表明新克隆的cdna序列為茶樹鳥氨酸轉氨酶基因，將該基因命名為cs-oat（camellia sinensis ornithine -aminotransferase），并將其登錄到genbank，登錄號為kj641844。 圖1 cs-oat的pcr擴增產(chǎn)物電泳結果 m：2 000 bp dna marker；a1：中間片段擴

22、增結果；b1、b2：3-race擴增結果；b3、b4：5-race擴增結果；c1：全長擴增結果。 fig. 1 electrophoresis results of pcr amplification of cs-oat m：2 000 bp dna marker；a1：product of segment；b1，b2：product of 3-race； b3，b4：product of 5-race；c1：product of full cdna. 2.2 cs-oat編碼蛋白的生物信息學分析 2.2.1 cs-oat的結構域預測 利用ncbi對cs-oat的結構域和結合位點分析（圖2）表

23、明，cs-oat屬于乙酰鳥氨酸氨基轉移酶家族，該家族是依賴磷酸吡哆醛（plp）的天冬氨酸氨基轉移酶超家族。催化轉氨作用的關鍵部位plp結合位點由8個氨基酸殘基（g138a139f173h174e228d261q264k290）構成，其中290位的賴氨酸（k）是催化中心，plp的結合引起蛋白構象變化而激活轉氨酶活性。抑制因子結合位點由11個氨基酸殘基（t137g138a139f173h174r176e228d261i263q264k290）構成。 圖2 cs-oat編碼氨基酸的保守區(qū)域分析結構圖 fig. 2 conserved domains analysis of cs-oat deduce

24、d amino acid 2.2.2 cs-oat的跨膜結構預測 通過tmpred對cs-oat編碼的氨基酸序列進行跨膜區(qū)預測顯示，在164 185和285 305形成兩個可能的跨膜螺旋，加權總分達1 119分，遠遠大于500（模型認為大于500分即存在有意義的跨膜螺旋），表明跨膜預測真實有效，因此推測該基因編碼的酶為跨膜蛋白。 12期 王偉東等：茶樹鳥氨酸轉氨酶基因cs-oat的克隆與表達分析 2469 2.2.3 cs-oat的磷酸化位點預測 用netphos 2.0 serve預測cs-oat蛋白的磷酸化位點（圖3），結果表明含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸共21個磷酸化位點，其中以絲氨酸位點

25、最多，有11個，蘇氨酸和酪氨酸位點分別有4個和6個。由此推測cs-oat蛋白的活性可能受到磷酸化作用的調(diào)控。 圖3 cs-oat蛋白磷酸化位點預測 fig. 3 phosphorylation site prediction of cs-oat protein 2.2.4 cs-oat的三級結構預測 用swiss-model對cs-oat蛋白的三級結構進行預測，得到cs-oat蛋白的三維結構。結果與strnsk等（2008）獲得的豌豆-oat蛋白三級結構模型圖相似，均含有-oat典型的plp輔助因子結構，進一步證實獲得的cs-oat基因編碼蛋白屬于依賴plp的鳥氨酸氨基轉移酶。 2.3 系統(tǒng)進

26、化樹分析 選擇17個與茶樹cs-oat編碼蛋白同源性較高的-oat蛋白序列，利用mega 6.0軟件構建nj系統(tǒng)進化樹。如圖4所示，以0.02為結點可以將植物-oat分為兩個類群：第類為雙子葉植 圖4 cs-oat與其他植物-oat蛋白的系統(tǒng)進化關系 fig. 4 phylogenetic relatedness among cs-oat and other plants -oat proteins 2470 園 藝 學 報 41卷 物的-oat進化關系，其中茶樹cs-oat與獼猴桃ac-oat親緣關系最近，可能為直系同源蛋白，其次為湖北海棠和葡萄，而與煙草和菊芋親緣關系較遠，表明茶樹cs-o

27、at與雙子葉植物中的木本植物親緣關系較近，而與草本植物的親緣關系較遠；第類主要為單子葉植物和裸子植物的-oat進化關系，其中單子葉植物聚為一簇，表明其由同一祖先進化而來。總之，由系統(tǒng)進化樹分析可以看出-oat的進化關系與植物形態(tài)學上分類的進化關系較一致，反映了cs-oat蛋白的進化規(guī)律和物種的親緣關系規(guī)律。 2.4 cs-oat的熒光定量表達分析 2.4.1 cs-oat的脅迫處理表達分析 在nacl脅迫處理期間，茶樹葉片中cs-oat基因的表達量從1 h開始逐漸增加，在12 h時達到最高，為對照的2.64倍，之后開始降低，呈現(xiàn)出先上升后降低的變化趨勢（圖5），表明高鹽脅迫可以顯著誘導茶樹葉片

28、中cs-oat基因的表達。 在aba誘導處理期間，茶樹葉片中cs-oat基因的表達量在1 8 h表現(xiàn)出緩慢地增加，在12 h時迅速增加至對照的3.1倍，之后迅速降低到1.5倍水平（圖5），表明aba可以顯著誘導茶樹葉片中cs-oat基因的表達，并表現(xiàn)出爆發(fā)性增加的特點。 圖5 cs-oat基因在不同脅迫處理下的表達量 fig. 5 relative expression of cs-oat under different stress treatments 12期 王偉東等：茶樹鳥氨酸轉氨酶基因cs-oat的克隆與表達分析 2471 在4 低溫脅迫處理期間，茶樹葉片中cs-oat基因的表達量出

29、現(xiàn)兩次高峰，其中2 h的表達量為對照的2.2倍，12 h的表達量為對照的1.9倍，呈現(xiàn)出先上升后降低再上升再降低的變化趨勢（圖5）。 在干旱脅迫處理期間，茶樹葉片中cs-oat基因的表達量從1 h開始迅速增加，并在2 12 h維持在較高水平，其表達量約為對照的2.2倍左右，之后其表達量開始降低，總體呈現(xiàn)出先上升后降低的變化趨勢（圖5）。 在h2o2脅迫處理期間，茶樹葉片中cs-oat基因的表達量出現(xiàn)兩次高峰，分別為4 h和24 h，其表達量分別為對照的2.3倍和2.0倍，整體呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的變化趨勢（圖5），表明h2o2可以顯著誘導茶樹葉片中cs-oat基因的表達。 總之，熒光定量p

30、cr的分析結果表明茶樹cs-oat基因是一個受高鹽、aba、低溫、干旱和氧化脅迫誘導表達的基因，該基因可能參與了多種逆境脅迫下茶樹葉片的滲透調(diào)節(jié)過程。 2.4.2 cs-oat的組織特異性表達分析 以茶樹根、莖、葉、芽、花和果實的cdna為模板進行熒光定量pcr分析，結果表明cs-oat在花中的表達量最高，其次為葉片，而在其它組織中的表達量相當，且相對較低（圖6）。 圖6 cs-oat基因在茶樹不同組織中的表達量 fig. 6 relative expression of cs-oat in different tissues of tea plant 3 討論 植物為應對逆境脅迫而積累可溶性

31、滲透物質，如脯氨酸、甜菜堿和糖醇等，作為小分子的滲透保護物質，其中脯氨酸是分布最為廣泛的滲透調(diào)節(jié)劑（mccue & hanson，1990）。-oat作為脯氨酸鳥氨酸合成途徑中的關鍵酶，與植物逆境脅迫響應密切相關（slama et al.，2006），但在茶樹上還沒有關于-oat的研究報道。本研究中通過race技術克隆獲得了茶樹的-oat基因，與其它植物的-oat具有較高的同源性，其編碼的氨基酸序列含有-oat典型的plp結合位點和抑制因子結合位點，屬于乙酰鳥氨酸氨基轉移酶家族，命名為cs-oat。對cs-oat蛋白跨膜區(qū)預測顯示該蛋白可能為跨膜蛋白，磷酸化位點預測結果顯示cs-oat蛋白含有

32、多個磷酸化位點，可能與cs-oat蛋白的活性調(diào)控有關。相關研究表明，磷酸化和去磷酸化是aba信號通路中關鍵性的過程，低溫、干旱和高鹽等逆境脅迫能夠促進植物體內(nèi)aba含量的增加，進而促進下游功能蛋白的磷酸化，從而使蛋白活化并參與植物逆境脅迫的響應（yamaguchi-shinozaki & shinozaki，2006），因此推測cs-oat蛋白的磷酸化位點可能與其逆境脅迫下蛋白活性有關。 已有的研究表明，-oat基因參與了植物對干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫的響應（armengaud et al.，2004）。焦蓉等（2011b）的研究表明煙草-oat基因受干旱、高鹽、低溫和aba脅迫誘導 24

33、72 園 藝 學 報 41卷 表達；吳楊等（2009）的研究表明斑茅-oat基因受干旱脅迫誘導表達。本研究的qrt-pcr結果亦表明茶樹-oat基因參與了茶樹葉片對各種非生物脅迫（如高鹽、干旱、低溫、aba和氧化脅迫）的響應。其中，低溫和氧化脅迫均出現(xiàn)了兩次高峰，中間有略微降低，這可能與脅迫下脯氨酸積累的途徑有關。目前關于植物響應脅迫時脯氨酸積累過程中兩條合成途徑誰占主導地位的爭議還比較大。delauney等（1993）和sanchez等（2001）的研究表明，脅迫下脯氨酸的合成途徑與植物體內(nèi)的氮素水平密切相關。此外，趙福庚和劉友良（1999）的研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫前8 h脯氨酸的積累主要受谷氨酸

34、途徑的調(diào)控，隨后鳥氨酸途徑占主導地位。因此，對于低溫脅迫下cs-oat在茶樹葉片脯氨酸積累過程中的地位尚需做進一步的研究。 本研究中，通過qrt-pcr對cs-oat基因在茶樹不同組織中表達差異分析表明，茶樹cs-oat基因在不同組織中的表達量存在明顯差異，在花中表達量最高，其次是葉片，而在其他組織中的表達量較低，這與張積森等（2009）報道的甘蔗-oat基因在幼苗各組織中表達量相似，以及armengaud等（2004）報道的苜蓿-oat基因在根和頂芽中表達量最大，而在葉片和生殖器官中表達量較低的結果有所不同，表明不同植物相同組織中-oat基因的表達存在差異。此外，鑒于茶樹cs-oat基因在花

35、器官中相對較高的表達，以及前期研究所表明的脯氨酸參與了低溫抑制茶樹花粉萌發(fā)和花粉管生長的生理過程（wang et al.，2012），推測cs-oat基因在茶樹花粉管低溫脅迫響應中扮演重要角色，這有待進一步研究。 references armengaud p，thiery l，buhot n，grenier-de m g，savour a. 2004. transcriptional regulation of proline biosynthesis in medicago truncatula reveals developmental and environmental specific

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