最新第二章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識(shí)PPT文檔

1、一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)類(lèi)型一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)類(lèi)型貼壁型貼壁型細(xì)胞細(xì)胞: :附著在某一固相支持物表面才附著在某一固相支持物表面才 能生長(zhǎng)的細(xì)胞能生長(zhǎng)的細(xì)胞。 懸浮型懸浮型細(xì)胞細(xì)胞: :不必附著于固相支持物表面，而不必附著于固相支持物表面，而 在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。 絕大多數(shù)絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型屬粘附型細(xì)胞，細(xì)胞， 只有少數(shù)細(xì)胞類(lèi)型，如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)只有少數(shù)細(xì)胞類(lèi)型，如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng) 兼性貼壁細(xì)胞兼性貼壁細(xì)胞貼壁貼壁(粘附粘附)型細(xì)胞型細(xì)胞 粘附粘附: :是大多數(shù)有機(jī)體是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞細(xì)胞在體內(nèi)在體內(nèi) 生

2、存生存和和生長(zhǎng)發(fā)育生長(zhǎng)發(fā)育的的基本存在方式基本存在方式含義含義 兩兩方面方面結(jié)果結(jié)果 基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織， 有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須 粘附粘附于一于一固相表面固相表面 才能才能生存生存和和生長(zhǎng)生長(zhǎng)。培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)時(shí)：細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后：細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后, ,同樣需要粘附于同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而屬于粘附型細(xì)胞屬于粘附型細(xì)胞。粘附粘附(錨定或錨著錨定或錨著)依賴(lài)型依賴(lài)型(性性)細(xì)胞：細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞唯有粘附于固相

3、表面才能生存的細(xì)胞 類(lèi)型類(lèi)型細(xì)胞在體內(nèi)、外細(xì)胞在體內(nèi)、外的的粘附粘附方式方式存在差異存在差異 體內(nèi)體內(nèi)：粘附粘附是是全方位全方位 ，外形，外形具有具有復(fù)雜的立體特征復(fù)雜的立體特征 體外體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一個(gè)附著平面，外形一般一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同與體內(nèi)時(shí)明顯不同 按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為幾大類(lèi)型幾大類(lèi)型 1、成纖維細(xì)胞型 n胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類(lèi)似

4、時(shí)皆可稱(chēng)之為成纖維細(xì)胞。 n小鼠成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞 n皮膚成纖維細(xì)胞（ 100 倍） n體外培養(yǎng)的年輕和老的人成纖維細(xì)胞的顯微形態(tài) n左邊是只分裂了幾代的年輕成纖維細(xì)胞，呈現(xiàn)薄層、細(xì)長(zhǎng)的形態(tài)；右邊是分離了50次的老的成纖維細(xì)胞，開(kāi)始衰退，并很快死亡。2、上皮型細(xì)胞n細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。 3、游走細(xì)胞型n常具有胞質(zhì)突起（偽足），呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有

5、時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。 n單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞4、多形細(xì)胞型n細(xì)胞一般分胞體和胞突兩部分，胞體為細(xì)長(zhǎng)型，似絲狀偽足。n有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類(lèi)。 n（a）成纖維細(xì)胞型；（b）上皮細(xì)胞型；（c）游走細(xì)胞型；（d）多形性細(xì)胞型細(xì)胞形態(tài)的影響因素n細(xì)胞種類(lèi)n血清成分n培養(yǎng)液中的添加成分n酸堿度n氣相環(huán)境n溫度條件懸浮型n見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類(lèi)型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類(lèi)細(xì)胞容易大量繁殖。o培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)或以機(jī)械方培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)法使保持懸浮狀態(tài)下

6、生長(zhǎng)o 來(lái)自血，脾或骨髓來(lái)自血，脾或骨髓o 在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)o 生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便( (不需消化不需消化) )，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)o 觀察不方便觀察不方便兼性貼壁細(xì)胞兼性貼壁細(xì)胞既能貼壁生長(zhǎng)又能懸浮生長(zhǎng)既能貼壁生長(zhǎng)又能懸浮生長(zhǎng) cho細(xì)胞細(xì)胞 小鼠小鼠l929細(xì)胞細(xì)胞 貼附時(shí)：上皮或成纖維細(xì)胞形態(tài)貼附時(shí)：上皮或成纖維細(xì)胞形態(tài)懸浮時(shí)：圓形懸浮時(shí)：圓形 二、體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)二、體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)總的：總的：與體內(nèi)仍有相似與體內(nèi)仍有相似- 體外

7、培養(yǎng)的細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞仍存在細(xì)胞和細(xì)胞、仍存在細(xì)胞和細(xì)胞、 細(xì)胞和基質(zhì)的相互關(guān)系細(xì)胞和基質(zhì)的相互關(guān)系但有不同但有不同 相對(duì)相對(duì)孤立孤立、相對(duì)單一、相對(duì)單一 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài) 分化減弱或不顯分化減弱或不顯體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn) 體外培養(yǎng)體外培養(yǎng) 單個(gè)細(xì)胞也能生存和增殖單個(gè)細(xì)胞也能生存和增殖 但但單個(gè)細(xì)胞不是細(xì)胞永久存在單個(gè)細(xì)胞不是細(xì)胞永久存在的形式的形式, 培養(yǎng)的培養(yǎng)的細(xì)胞之間細(xì)胞之間仍有在仍有在形態(tài)形態(tài)和和機(jī)能上機(jī)能上的的 相互依存關(guān)系相互依存關(guān)系 1.培養(yǎng)的培養(yǎng)的細(xì)胞之間細(xì)胞之間 仍有在形態(tài)和機(jī)能上的仍有在形態(tài)和機(jī)能上的相互

8、依存關(guān)系相互依存關(guān)系。 在在結(jié)構(gòu)上結(jié)構(gòu)上，如：上皮細(xì)胞仍見(jiàn)有橋粒，如：上皮細(xì)胞仍見(jiàn)有橋粒 在在生理活動(dòng)上生理活動(dòng)上，單個(gè)細(xì)胞雖能生長(zhǎng)繁殖，單個(gè)細(xì)胞雖能生長(zhǎng)繁殖, 但但不如群體細(xì)胞不如群體細(xì)胞能力強(qiáng)能力強(qiáng)， 當(dāng)相鄰細(xì)胞接觸，便導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)停止當(dāng)相鄰細(xì)胞接觸，便導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)停止 細(xì)胞相互溝通生物信細(xì)胞相互溝通生物信息息的結(jié)果的結(jié)果 2.培養(yǎng)的細(xì)胞和培養(yǎng)的細(xì)胞和基質(zhì)之間基質(zhì)之間 對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)仍有依存性對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)仍有依存性 相互依存關(guān)系相互依存關(guān)系 但有不同但有不同 人工所模擬的條件人工所模擬的條件與與體內(nèi)體內(nèi)實(shí)際情況實(shí)際情況 仍仍不完全不完全 相同相同 當(dāng)細(xì)胞被置于當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)后后 久了久

9、了,必然必然發(fā)生變化發(fā)生變化與體內(nèi)主要不同與體內(nèi)主要不同 相對(duì)相對(duì)孤立孤立、相對(duì)單一、相對(duì)單一 缺乏體內(nèi)的缺乏體內(nèi)的一些一些影響影響 主要表現(xiàn)主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形 如：肌肉細(xì)胞如：肌肉細(xì)胞纖維化纖維化 分化減弱或不顯分化減弱或不顯 出現(xiàn)類(lèi)似出現(xiàn)類(lèi)似“返祖返祖”現(xiàn)象：細(xì)現(xiàn)象：細(xì)胞趨向單一化胞趨向單一化 或獲得不死性或獲得不死性 或變成具有惡性性狀的細(xì)胞群或變成具有惡性性狀的細(xì)胞群 因此因此要正確認(rèn)識(shí)要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞體外培養(yǎng)細(xì)胞 是一種特定條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體是一種特定條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的主要的生物學(xué)特點(diǎn)n培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的變化：培養(yǎng)細(xì)

10、胞分化狀態(tài)的變化： 1 1、去分化（脫分化）、去分化（脫分化） 2 2、不適應(yīng)、不適應(yīng)n生長(zhǎng)特點(diǎn)：生長(zhǎng)特點(diǎn)：1、貼附生長(zhǎng)、貼附生長(zhǎng)2、接觸抑制、接觸抑制3、密度依賴(lài)性、密度依賴(lài)性體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)體外培養(yǎng)物的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn) 體外培養(yǎng)生長(zhǎng)生物學(xué)特征具有體外培養(yǎng)生長(zhǎng)生物學(xué)特征具有兩重性?xún)芍匦?基本生物學(xué)特征基本生物學(xué)特征 仍仍與體內(nèi)的細(xì)胞相似與體內(nèi)的細(xì)胞相似 培養(yǎng)物培養(yǎng)物在體外在體外條件下生長(zhǎng)，條件下生長(zhǎng)， 許多生長(zhǎng)生物學(xué)行為許多生長(zhǎng)生物學(xué)行為發(fā)生改變發(fā)生改變 培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的變化培養(yǎng)細(xì)胞分化狀態(tài)的變化 體內(nèi)體內(nèi)細(xì)胞細(xì)胞-三方面三方面的影響與調(diào)節(jié)的影響與調(diào)節(jié): 體外環(huán)境體外環(huán)境的影響的影

11、響 體內(nèi)神經(jīng)體內(nèi)神經(jīng)體液因素體液因素 的調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié) 細(xì)胞與局部微環(huán)境細(xì)胞與局部微環(huán)境的相互作用的相互作用 控制控制- 維持著細(xì)胞的維持著細(xì)胞的分化特征分化特征。體外體外培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)時(shí)， 失去了失去了- 分化特征分化特征逐漸逐漸減弱減弱 去分化去分化(脫分化):各種分化細(xì)胞，逐漸各種分化細(xì)胞，逐漸失去各自的形態(tài)與失去各自的形態(tài)與功能功能“個(gè)性個(gè)性”，表現(xiàn)出某種，表現(xiàn)出某種趨同性趨同性 如如:培養(yǎng)的培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞 在在適當(dāng)刺激適當(dāng)刺激下，下，可可分化分化為為 其它結(jié)締組織細(xì)胞其它結(jié)締組織細(xì)胞和和肌組織細(xì)肌組織細(xì)胞胞，表現(xiàn)出，表現(xiàn)出類(lèi)似未分化類(lèi)似未分化的間充質(zhì)細(xì)胞的的間充質(zhì)細(xì)胞的特性，特

12、性，返祖返祖 。有有2點(diǎn)點(diǎn)1.但但,去分化去分化并不并不意味著意味著完全返回完全返回胚胎時(shí)期胚胎時(shí)期的原始細(xì)胞狀態(tài)的原始細(xì)胞狀態(tài)如如:高度分化高度分化的的神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞和和心肌細(xì)心肌細(xì)已經(jīng)喪已經(jīng)喪失的失的增生活性不可能恢復(fù)增生活性不可能恢復(fù) 但已經(jīng)具備但已經(jīng)具備的的生物電活動(dòng)特性不會(huì)完全失去生物電活動(dòng)特性不會(huì)完全失去 2. 可可重新表現(xiàn)重新表現(xiàn)出出分化特點(diǎn)分化特點(diǎn) 如：如：把把表皮細(xì)胞表皮細(xì)胞放在放在氣液界面上氣液界面上培養(yǎng)，可培養(yǎng)，可分分化化成含大量角蛋白絲的成含大量角蛋白絲的角質(zhì)細(xì)胞角質(zhì)細(xì)胞 、內(nèi)皮、內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞，但，這種但，這種能力能力會(huì)會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間延隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)長(zhǎng) 逐漸喪失逐

13、漸喪失總之，體外培養(yǎng)總之，體外培養(yǎng),使細(xì)胞使細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)與與功能上功能上的的“可塑性可塑性”增大增大 防止去分化防止去分化n提高細(xì)胞接種密度n提高ca2+濃度n誘導(dǎo)分化的激素貼附貼附(粘附粘附)和附著和附著 粘附粘附于固相表面是錨定依賴(lài)性細(xì)胞于固相表面是錨定依賴(lài)性細(xì)胞生命活動(dòng)的基本生命活動(dòng)的基本要求要求，細(xì)胞被接種到培養(yǎng)器皿內(nèi)以后，細(xì)胞被接種到培養(yǎng)器皿內(nèi)以后首先要發(fā)生首先要發(fā)生粘附粘附(adherence)，是細(xì)胞培養(yǎng)以后能否成功的第是細(xì)胞培養(yǎng)以后能否成功的第一步一步.細(xì)胞懸液后耽擱得越久，越容易發(fā)生退化提細(xì)胞懸液后耽擱得越久，越容易發(fā)生退化提供什么樣的供什么樣的生長(zhǎng)表面生長(zhǎng)表面是是細(xì)胞能否成

14、功粘附的主要細(xì)胞能否成功粘附的主要因素因素。 不同細(xì)胞不同細(xì)胞的的粘附能力不同粘附能力不同 如如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等等粘附能力強(qiáng)粘附能力強(qiáng)能在數(shù)分鐘至能在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面 如如神經(jīng)元細(xì)胞、羊水細(xì)胞，粘附能力弱神經(jīng)元細(xì)胞、羊水細(xì)胞，粘附能力弱需要數(shù)小時(shí)乃需要數(shù)小時(shí)乃至更長(zhǎng)的時(shí)間才能粘附到固相表面至更長(zhǎng)的時(shí)間才能粘附到固相表面 粘附能力強(qiáng)的細(xì)胞粘附能力強(qiáng)的細(xì)胞- 粘附能力弱的細(xì)胞粘附能力弱的細(xì)胞- 可可利用利用此特點(diǎn)（粘附：快、牢；慢、弱）此特點(diǎn)（粘附：快、牢；慢、弱） 分離分離、純化細(xì)胞純化細(xì)胞 細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞形態(tài)因因是否貼附于底物是否

15、貼附于底物而而不同不同懸浮懸浮的細(xì)胞的細(xì)胞:基本基本圓形圓形粘附粘附和貼壁的細(xì)胞和貼壁的細(xì)胞:扁平圓形扁平圓形 相差顯微鏡相差顯微鏡 “亮圈亮圈” 很快很快過(guò)渡過(guò)渡-貼附過(guò)程貼附過(guò)程 ：4步步吸附吸附-接觸接觸-貼壁貼壁-擴(kuò)展擴(kuò)展 影響因素影響因素 各種細(xì)胞不同各種細(xì)胞不同 如接種如接種30后后第二瓶第二瓶30 (附著最強(qiáng)附著最強(qiáng))巨噬細(xì)胞一成纖維細(xì)胞巨噬細(xì)胞一成纖維細(xì)胞 上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞血細(xì)胞血細(xì)胞(最弱最弱) 生物因素生物因素 血清、培養(yǎng)液中的促附著因子血清、培養(yǎng)液中的促附著因子 機(jī)械機(jī)械，物理等物理等其他因素因素其他因素因素 離心：促進(jìn)附著離心：促進(jìn)附著 流動(dòng)：培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著流

16、動(dòng)：培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著 低溫：可抑制附著低溫：可抑制附著 措施措施（因素）（因素）1.包被包被對(duì)對(duì)分化程度高、生長(zhǎng)能力差分化程度高、生長(zhǎng)能力差的細(xì)胞的細(xì)胞 可在可在培養(yǎng)瓶皿表面包被培養(yǎng)瓶皿表面包被有利于細(xì)胞粘附和有利于細(xì)胞粘附和 生長(zhǎng)的生長(zhǎng)的生物活性物質(zhì)生物活性物質(zhì) 如如:- 通過(guò)其所帶電通過(guò)其所帶電荷先吸附荷先吸附-, 培養(yǎng)的細(xì)胞再與其結(jié)合。培養(yǎng)的細(xì)胞再與其結(jié)合。 血清內(nèi)血清內(nèi)含有多種能夠含有多種能夠 促進(jìn)細(xì)胞粘附促進(jìn)細(xì)胞粘附的的成分成分 細(xì)胞細(xì)胞本身也可能本身也可能產(chǎn)生產(chǎn)生一些一些粘附分子粘附分子 2.減少接種減少接種時(shí)細(xì)胞懸液的時(shí)細(xì)胞懸液的量量待細(xì)胞粘附和貼壁之后，再補(bǔ)充足夠的培養(yǎng)

17、液待細(xì)胞粘附和貼壁之后，再補(bǔ)充足夠的培養(yǎng)液3.減少減少培養(yǎng)液中培養(yǎng)液中血清的含量血清的含量 使培養(yǎng)液使培養(yǎng)液黏度降低黏度降低4.培養(yǎng)液中培養(yǎng)液中離子成分及其濃度離子成分及其濃度 如，培養(yǎng)液中的如，培養(yǎng)液中的ca含量過(guò)低時(shí)不利于含量過(guò)低時(shí)不利于 細(xì)胞的粘附、貼壁和細(xì)胞的粘附、貼壁和鋪展鋪展5.培養(yǎng)液的溫度培養(yǎng)液的溫度 低溫會(huì)減低細(xì)胞的活動(dòng)，妨礙黏附和貼壁低溫會(huì)減低細(xì)胞的活動(dòng)，妨礙黏附和貼壁 附著的條件附著的條件 底物底物 細(xì)胞能在很多固體表面附著最終鋪展的程度，取決于細(xì)胞能在很多固體表面附著最終鋪展的程度，取決于底物的性質(zhì)底物的性質(zhì)影響因素影響因素： 活性物質(zhì)活性物質(zhì)(貼附貼附、伸展因子伸展因子

18、):血清、培養(yǎng)液中或細(xì)胞血清、培養(yǎng)液中或細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)被底物吸附后可利于細(xì)胞的鋪展分泌的生物活性物質(zhì)被底物吸附后可利于細(xì)胞的鋪展 細(xì)胞借助這些分子細(xì)胞借助這些分子,可附著于各種可附著于各種”非特異性非特異性”的底的底物上物上 如如fn，膠原，聚賴(lài)氨酸，膠原，聚賴(lài)氨酸 機(jī)械機(jī)械，物理因素物理因素 接觸抑制接觸抑制和密度依賴(lài)性生長(zhǎng)仰制密度依賴(lài)性生長(zhǎng)仰制 運(yùn)動(dòng)的接觸抑制運(yùn)動(dòng)的接觸抑制密度依賴(lài)性生長(zhǎng)仰制密度依賴(lài)性生長(zhǎng)仰制增殖的密度抑制增殖的密度抑制實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方 法方 法 ： 3 t 3 細(xì) 胞 ， 接 種細(xì) 胞 ， 接 種 1 05于于 6 c m 培 養(yǎng) 皿 ，培 養(yǎng) 皿 ， 5d細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞

19、計(jì)數(shù) 于 加 入于 加 入 1 0 、 2 0 、 3 0 牛 血 清 的牛 血 清 的 培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中，結(jié)果結(jié)果： 結(jié)果結(jié)果：10血清：血清： 20hr后后鋪滿(mǎn)鋪滿(mǎn) 以后至以后至5d 細(xì)胞數(shù)不再增加細(xì)胞數(shù)不再增加(細(xì)細(xì)胞胞 數(shù)約數(shù)約1066cm皿皿) 30%血清：血清： 以后經(jīng)常換液至以后經(jīng)常換液至5d，細(xì)胞，細(xì)胞密度繼續(xù)增加密度繼續(xù)增加 (可達(dá)可達(dá)6xl066cm皿皿) 說(shuō)明說(shuō)明: 密度抑制密度抑制-鋪滿(mǎn)后不再增殖鋪滿(mǎn)后不再增殖(分裂停分裂停止止)血清血清可可降低密度抑制降低密度抑制 只加入于只加入于3t3停止生停止生 長(zhǎng)的培養(yǎng)液長(zhǎng)的培養(yǎng)液中中細(xì)胞不生長(zhǎng)細(xì)胞不生長(zhǎng) 當(dāng)再加入當(dāng)再加入血清

20、血清 細(xì)胞細(xì)胞又又生長(zhǎng)生長(zhǎng)說(shuō)明說(shuō)明血清血清可可消除密度抑制消除密度抑制(2)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的密度抑制降低轉(zhuǎn)化細(xì)胞的密度抑制降低 用用此培養(yǎng)液此培養(yǎng)液 3t33t3細(xì)胞細(xì)胞不再分裂增殖不再分裂增殖 當(dāng)再加入當(dāng)再加入1010血清，血清，3t33t3細(xì)胞可再增殖細(xì)胞可再增殖 表示表示血清可消除密度抑制血清可消除密度抑制 但當(dāng)用但當(dāng)用此培養(yǎng)液此培養(yǎng)液，于于轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化的3t3細(xì)胞細(xì)胞 (sv3t3) 卻卻生長(zhǎng)良好生長(zhǎng)良好表示表示轉(zhuǎn)化細(xì)胞密度抑制降低轉(zhuǎn)化細(xì)胞密度抑制降低( (血清血清需要降低需要降低) ) 說(shuō)明：說(shuō)明：轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞的的密度抑制降低密度抑制降低. 可可生長(zhǎng)生長(zhǎng)至至較高較高的密度的密度總的說(shuō)明：

21、總的說(shuō)明： 細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)有有密度抑制密度抑制血清血清可可降低密度抑制降低密度抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞可可降低密度抑制降低密度抑制 四、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程四、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程n（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期（life span of culture cells） n培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。 1原代培養(yǎng)（primary culture）期： n也稱(chēng)初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。 n此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。 n細(xì)胞群是異質(zhì)的（細(xì)胞群是異質(zhì)的（hete

22、rogeneous），也），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。細(xì)胞克隆形成率很低，即細(xì)胞獨(dú)立存性強(qiáng)。細(xì)胞克隆形成率很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；生存性差。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。2傳代期n在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱(chēng)二倍體細(xì)胞系。n為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞

23、均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代1050次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。3衰退期：n此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。n在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（spontaneous transformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（immortality）或惡性性（malignancy）。細(xì)胞永生性也稱(chēng)不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力

24、，這樣的細(xì)胞群體稱(chēng)無(wú)限細(xì)胞系（infinite cell line），也稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系（continuous cell line）。 無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期n所有體外培養(yǎng)細(xì)胞，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系，當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān)。在細(xì)胞一代中，一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段： 1潛伏期（latent phase）：n細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱(chēng)貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類(lèi)、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān) n貼附是貼附類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖條件之一。細(xì)胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過(guò)前述延展過(guò)程變成極性細(xì)胞，還要經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí)，可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖，少見(jiàn)分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類(lèi)和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。 n初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約2496小時(shí)