0513012806748doc三峽大學(xué)

1、高等醫(yī)學(xué)院校實(shí)驗(yàn)教材醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)供臨床醫(yī)學(xué)、影像、護(hù)理、中醫(yī)等專業(yè)使用 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教研室二00五年六月高等醫(yī)學(xué)院校實(shí)驗(yàn)教材醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)主 編 韓 莉副主編 張昌菊 宋利瓊編 者 （以姓氏筆畫(huà)為序）王 磊 朱 平 劉 嘉 劉 英 宋利瓊 吳紅艷 楊建林 周永芹 張 穎 張昌菊 韓 莉三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物病原部2005年6月29日前 言本教材由醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和醫(yī)學(xué)免疫學(xué)兩部分組成，通過(guò)實(shí)習(xí)課教學(xué)使學(xué)生了解和掌握醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)技能操作和基本研究方法，同時(shí)也能獲取相應(yīng)的感性知識(shí)。為培養(yǎng)學(xué)生的思維能力和獨(dú)立操作能力，在進(jìn)行設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)課教學(xué)時(shí)

2、，學(xué)生也能利用本實(shí)習(xí)指導(dǎo)作為工具，順利地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，以節(jié)省學(xué)生獲取知識(shí)的時(shí)間。為此目的，對(duì)每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的目的及實(shí)際意義都有所交代，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察與分析，也予以必要的輔導(dǎo)。限于教學(xué)時(shí)數(shù)和條件，有些內(nèi)容將以示教、電視或電影教學(xué)方式教學(xué)，這部分尤其需要加強(qiáng)復(fù)習(xí)，以彌補(bǔ)未能親自操作之不足。有關(guān)實(shí)驗(yàn)課的改革設(shè)想，仍須不斷地接受實(shí)踐考驗(yàn)，發(fā)揚(yáng)成績(jī)克服缺點(diǎn)，以不斷地充實(shí)和提高。為上好實(shí)驗(yàn)課，要求同學(xué)課前做好預(yù)習(xí)，明確實(shí)驗(yàn)任務(wù)、目的、原理、方法及操作中的注意事項(xiàng)等，避免和減少發(fā)生錯(cuò)誤，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須持嚴(yán)肅認(rèn)真的態(tài)度，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須進(jìn)行仔細(xì)地觀察和認(rèn)真地記錄，然后進(jìn)行科學(xué)分析，得出恰當(dāng)結(jié)論，獨(dú)立認(rèn)真完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告

3、，書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告要字跡清楚，語(yǔ)言簡(jiǎn)練，表格清晰，畫(huà)圖應(yīng)力求反映實(shí)際標(biāo)本的原狀。 編者 2005年6月29日內(nèi) 容 簡(jiǎn) 介第一篇 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是醫(yī)學(xué)微生物學(xué)課程的重要組成部分，我們將醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容分為六個(gè)單元，改變以往單一的實(shí)驗(yàn)方式，在綜合性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開(kāi)設(shè)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，學(xué)生能比較系統(tǒng)地了解常用微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的原理、方法、結(jié)果分析、注意事項(xiàng)及用途，可以幫助學(xué)生理解和鞏固所學(xué)的理論知識(shí)，培養(yǎng)學(xué)生的操作技能以及觀察問(wèn)題，分析、解決問(wèn)題的能力、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，同時(shí)實(shí)驗(yàn)與病案討論結(jié)合，學(xué)生能將理論知識(shí)與臨床實(shí)踐有機(jī)聯(lián)系，為學(xué)習(xí)其它基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)及預(yù)防醫(yī)學(xué)奠定基礎(chǔ)，從而提高學(xué)生的綜合

4、素質(zhì)。第二篇 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)踐教學(xué)是課程建設(shè)的重要環(huán)節(jié)，培養(yǎng)和提高學(xué)生的綜合素質(zhì)與創(chuàng)新能力重要途徑。在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中我們大力改革實(shí)驗(yàn)教學(xué)的形式和內(nèi)容，將免疫學(xué)的16學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為兩大部分，第一部分為綜合性實(shí)驗(yàn)，包括了解天然免疫的組成與生物學(xué)功能的檢測(cè)；常見(jiàn)體液免疫檢測(cè)指標(biāo)的設(shè)計(jì)，使學(xué)生能較熟練應(yīng)用基本的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，能針對(duì)不同的臨床病例開(kāi)展相關(guān)免疫學(xué)項(xiàng)目的基本檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行合理的臨床解釋和分析。為了學(xué)生既能適應(yīng)一般臨床與科研工作，又具有一定的創(chuàng)新工作能力。第二部分我們開(kāi)設(shè)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)：市場(chǎng)有某一生物制劑有免疫增強(qiáng)作用，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案證實(shí)。在這部分內(nèi)容要求同學(xué)們初步掌握從不同角度證實(shí)某

5、產(chǎn)品有免疫增強(qiáng)作用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，掌握與了解常見(jiàn)細(xì)胞免疫的檢測(cè)技術(shù)和應(yīng)用（elisa檢測(cè)細(xì)胞因子）、免疫標(biāo)記技術(shù)的種類、原理、特點(diǎn)、應(yīng)用、淋巴細(xì)胞分離記數(shù)技術(shù)、淋巴細(xì)胞增殖等實(shí)驗(yàn)。目 錄第一篇 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則 2實(shí)驗(yàn)一 常見(jiàn)細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查方法（綜合性實(shí)驗(yàn)）3實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的分離培養(yǎng)法與消毒滅菌（綜合性實(shí)驗(yàn)） 11實(shí)驗(yàn)三 化膿性球菌的分離鑒定（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)） 27實(shí)驗(yàn)四 腸道桿菌的分離鑒定（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)） 32實(shí)驗(yàn)五 厭氧菌、分支桿菌的檢查法（綜合性實(shí)驗(yàn)） 41實(shí)驗(yàn)六 各種微生物形態(tài)、病毒學(xué)檢查法（綜合性實(shí)驗(yàn)） 46微生物學(xué)各論自學(xué)提綱 56第二篇 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)一 天然免疫功能的檢測(cè)（綜合性實(shí)驗(yàn)

6、） 60實(shí)驗(yàn)二 常見(jiàn)抗原抗體反應(yīng)（綜合性實(shí)驗(yàn)） 67實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞免疫檢測(cè)i：細(xì)胞因子的檢測(cè)（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）86實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞免疫檢測(cè)：淋巴細(xì)胞分離、計(jì)數(shù)及活性檢測(cè)（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）94實(shí)驗(yàn)五 細(xì)胞免疫檢測(cè)iii：淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）103綜合復(fù)習(xí) 107附錄 113實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞免疫檢測(cè)i：細(xì)胞因子的檢測(cè)（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）【實(shí)驗(yàn)任務(wù)】市場(chǎng)上有一廣告產(chǎn)品，據(jù)說(shuō)有免疫增強(qiáng)作用，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)方案證實(shí)之（從細(xì)胞因子的角度考慮）?！灸康囊蟆恳?、初步掌握從細(xì)胞因子的角度證實(shí)某產(chǎn)品有免疫增強(qiáng)作用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。二、了解五種標(biāo)記技術(shù)的原理、特點(diǎn)和應(yīng)用。三、掌握elisa的實(shí)驗(yàn)原理、操作方法及其臨床實(shí)用意義?！緦?shí)驗(yàn)條件

7、】一、昆明小鼠若干只、ep管、試管若干只、眼科鑷若干把、試管離心機(jī)兩臺(tái)、生理鹽水50ml。二、聚乙烯塑料反應(yīng)板（ph9.6時(shí)可吸附蛋白ag或b）。三、抗原（il-2），凍干酶聯(lián)抗體。四、鄰苯二胺（opd），包被液（0.05m碳酸鈉碳酸氫鈉溶液，ph9.6）。五、稀釋液：10%免疫血清pbs吐溫20，防止非特異性吸附。六、洗滌液：0.02mtristween20，ph7.4防止非特異性吸附。七、底物溶液：0.02m磷酸氫二鈉25.7毫升，0.1m檸檬酸24.3毫升，蒸水50毫升。臨用前新鮮配制，在上述緩沖液中溶解40毫克鄰苯二胺，然后加入30%雙氧水0.15毫升，底物對(duì)光敏感，需要避光并立即使用

8、。八、終止液：2m硫酸。九、濕盒，37oc洹溫箱，酶標(biāo)儀。【作業(yè)】請(qǐng)將你們小組的設(shè)計(jì)方案與技術(shù)路線在討論完善后記錄在實(shí)驗(yàn)報(bào)告本，并將可行的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在實(shí)驗(yàn)課中實(shí)施?！緟⒖假Y料】一、小鼠眼球取血：抓住小鼠的尾巴使小鼠懸于空中，旋轉(zhuǎn)十幾圈（使小鼠處于暈旋狀態(tài)），再突然用左手拇指和食指抓緊小白鼠頸部及兩耳，將鼠體收入手掌中，再用左手無(wú)名指和手掌夾住小白鼠尾根，以無(wú)名指和小指夾住其左腿，使小鼠的頭部向下，這時(shí)小鼠的眼球處于突出狀態(tài)，快速用小鑷子夾著小鼠的眼球用力一拉，再用小試管放在血滴下的位置即可。一般情況下，一只小鼠可取血l。二、常見(jiàn)的免疫標(biāo)記技術(shù)包括 免疫熒光技術(shù) 免疫酶技術(shù) 放射免疫技術(shù) 化學(xué)發(fā)光

9、免疫技術(shù) 金免疫技術(shù)。用熒光素、同位素或酶標(biāo)記抗體或抗原，用于抗原或抗體檢測(cè)是目前廣泛應(yīng)用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標(biāo)記物與抗原或抗體化學(xué)連接之后不改變后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位檢測(cè)。1免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence techni）是用化學(xué)方法使熒光素標(biāo)記的抗體（或抗原）與組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合，進(jìn)行定性定位檢查抗原或抗體的方法。 （1）直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細(xì)胞懸液，細(xì)胞涂片或組織切片上進(jìn)行染色，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的熒光抗體，將待檢標(biāo)本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應(yīng)抗原存在，此法可用于病毒感

10、染細(xì)胞、帶某種特異抗原的細(xì)胞（如t細(xì)胞和b細(xì)胞）或病原菌的檢查，也可用于組織中沉著的免疫復(fù)合物的檢查。本法的缺點(diǎn)是檢查多種抗原，就需分別制備相應(yīng)的多種標(biāo)記抗體。（2）間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復(fù)雜操作。將組織或細(xì)胞上的抗原直接與相應(yīng)抗體（不標(biāo)記熒光）結(jié)合，此為第一抗體，再把能與第一抗體特異結(jié)合的熒光標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒光標(biāo)記的第二抗體，觀察結(jié)果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用于檢查抗原的第一抗體是人或動(dòng)物的只需制備一種抗人或動(dòng)物的免疫球蛋白熒光抗體。免疫熒光技術(shù)在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細(xì)菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出igm

11、抗體，可做為近期接觸抗原的標(biāo)志，所以使用熒光標(biāo)記抗igm可診斷近期感染。除微生物學(xué)方面的應(yīng)用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細(xì)胞的亞類。使用流式細(xì)胞儀(fluorescene-activated cell sorting,facs)，能自動(dòng)檢測(cè)細(xì)胞的大小、熒光強(qiáng)度。針對(duì)細(xì)胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素（fitc）發(fā)黃綠熒光，用羅丹明（tmritc）發(fā)紅色熒光。由于熒光顏色不同標(biāo)記兩種不同的抗體，對(duì)同一細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記染色。對(duì)淋巴細(xì)胞亞類鑒定起著巨大推動(dòng)作用。應(yīng)用間接熒光法也用于自身免疫病的抗核抗體檢查。 2放射免疫分析法 放射免疫分析法（radioimmunoassa

12、y ria）應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的原理，應(yīng)作放射性同素標(biāo)記抗原（或抗體）與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，通過(guò)測(cè)定抗原抗體結(jié)合物的放射活性判斷結(jié)果，本方法可進(jìn)行超微量分析，敏感性高，可用于測(cè)定抗原、抗體、抗原抗體復(fù)合物。本法常用的同位素有125和131。放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：（1）液相法：將待檢標(biāo)本（例如含胰島素抗原）與定時(shí)的同位素標(biāo)記的胰島素（抗原）和定時(shí)的抗胰島素抗體混合，經(jīng)一定作用時(shí)間后，分離收集抗原抗體復(fù)合物及游離的抗原，測(cè)定這兩部分的放射活性，計(jì)算結(jié)合率。在反應(yīng)系統(tǒng)中，待檢標(biāo)本的胰島素抗原與同位素標(biāo)記的胰島素競(jìng)爭(zhēng)奪戰(zhàn)性與胰島素抗體結(jié)合。非標(biāo)記的抗原越多，標(biāo)記抗原與抗體形成的復(fù)合物

13、越少。非標(biāo)記抗原含量與標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物的量呈一定的函數(shù)關(guān)系。預(yù)先用標(biāo)準(zhǔn)的非標(biāo)記抗原作成標(biāo)準(zhǔn)曲線后，即可查出待檢標(biāo)本中胰島素的含量。（2）固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然后加待檢標(biāo)本，最后加標(biāo)記抗體。測(cè)定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰（cnbr）海豹化的紙片或聚苯乙烯小管。放射免疫分析法應(yīng)用范圍廣泛，包括多種激素（胰島素、生長(zhǎng)激素、甲狀腺素等）維生素、藥物、ige等。3酶聯(lián)免疫分析法 酶聯(lián)免疫分析法（enzyme immunoassay,eia）是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的免疫檢測(cè)方法。本法將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對(duì)底物高效催化作用結(jié)合起來(lái)，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷試

14、驗(yàn)結(jié)果，可經(jīng)酶標(biāo)測(cè)定儀作定量分析，敏感度可達(dá)ng水平。常用于標(biāo)記的酶有辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase)、堿性磷酶（alkaline phosphatase）等。它們與抗體結(jié)合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標(biāo)抗體可保存較長(zhǎng)時(shí)間。目前常用的方法有酶標(biāo)免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附法。前者測(cè)定細(xì)胞表面抗原或組織內(nèi)的抗原；后者主要測(cè)定可溶性抗原或抗體。本法既沒(méi)有放射性污染又不需昂貴的測(cè)試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。4化學(xué)發(fā)光免疫分析法 放射免疫分析法有很高的靈敏度，但存在著放射性防護(hù)和同位素污染等問(wèn)題。近年來(lái)，許多非放射性同位素標(biāo)記的免疫分析方法相繼出現(xiàn)

15、。其中，在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)及抗原-抗體特異性識(shí)別基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一種新的非放射免疫分析技術(shù)-化學(xué)發(fā)光免疫分析法，由于這種方法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，精密度好，線性范圍寬，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，試劑價(jià)格低廉，方法穩(wěn)定、快速等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種重要的非同位素標(biāo)記免疫分析方法，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測(cè)。化學(xué)發(fā)光免疫分析包括三大類型：即標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的化學(xué)發(fā)光免疫分析；標(biāo)記熒光物質(zhì)的熒光化學(xué)發(fā)光免疫分析和標(biāo)記酶的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析。 5金免疫技術(shù) 金免疫技術(shù)的特點(diǎn)是以膠體金作為標(biāo)記物。這一技術(shù)在70年代初期由faulk和taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。迄今為止，

16、金標(biāo)記仍主要用于免疫組織化學(xué)中。1981年danscher建立了銀顯影液增強(qiáng)，光鏡下金顆?？梢?jiàn)性的方法；1983年moeremans等在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳中應(yīng)用了免疫金銀染色法；1986年fritz等在免疫金銀法基礎(chǔ)上成功進(jìn)行了彩色免疫金銀染色。下面重點(diǎn)介紹酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（一）原理：近二十幾年來(lái)，免疫學(xué)分析方法發(fā)展很快，特別是在使用標(biāo)記了的抗原和抗體的分析技術(shù)以后，使原來(lái)許多經(jīng)典的分析方法在敏感性和特異性方面都不能相比。繼50年代的免疫熒光（ifa）和60年代的放射免疫(ria)分析技術(shù)之后，在70年代初期又建立了用酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體的分析技術(shù)。由于酶的高效生物催化作用，一

17、個(gè)酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生了放大作用，使得原來(lái)極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來(lái)，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（enzymelinked immunosorbent assay，elisa），本法自70年代初期由van weemen、schuars.engvall及perlmarn等相繼分別報(bào)道后，現(xiàn)已引起廣泛重視。elisa法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲(chóng)病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為elisa法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定

18、及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本，因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來(lái)測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此elisa法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：1免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。2研究抗酶抗體的合成。3顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。4定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份。elisa的基本原理有三條：1抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；2抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物

19、仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；3酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此，可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。由于elisa法一方面是建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。而另一方面又由于酶標(biāo)記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物，它可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，正因?yàn)榇朔N放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，elisa法是一種既敏感又特異的方法。常用的elisa有以下兩個(gè)方面。(一)測(cè)定抗原的，主要有四種方法。1、競(jìng)爭(zhēng)法（competition method

20、）:方法的基本原理可見(jiàn)圖1：圖1：竟?fàn)幏y(cè)抗原示意圖本法首先將特異性抗體吸附于固相載體表面，我們把抗原和抗體吸附到固相載體表面的這個(gè)過(guò)程，稱為包被（coated），也可叫做致敏。經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為我們所要測(cè)定的未知抗原的量。這種方法所測(cè)定的抗原只要有一個(gè)結(jié)合部位即可，因此，對(duì)小分子抗原如激素和藥物之類的測(cè)定常用此法。該法的優(yōu)點(diǎn)是快，因?yàn)橹挥幸粋€(gè)保溫洗滌過(guò)程。但需用較多量的酶標(biāo)記抗原為其缺點(diǎn)。2、雙抗體夾心法方法的基本原理可用圖2來(lái)表示：圖2：.雙抗體夾心法測(cè)抗原示意圖本法首先也是用特

21、異性抗體包被于固相載體，經(jīng)洗滌后加入含有抗原之待測(cè)樣品，如待檢樣品中有相應(yīng)抗原存在，即可與包被于固相載體上的特異性抗體結(jié)合，經(jīng)保溫孵育洗滌后，即可加入酶標(biāo)記特異性抗體，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色進(jìn)行測(cè)定，底物降解的量即為欲測(cè)抗原的量。這種方法欲測(cè)的抗原必須有兩個(gè)可以與抗體結(jié)合的部位，因?yàn)槠湟欢艘挥诠滔噍d體上的抗體作用，而另一端則要與酶標(biāo)記特異性抗體作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之類的抗原測(cè)定。我們用在霍亂腸毒素的測(cè)定、hbsag及hbs的測(cè)定。3、改良雙抗體夾心法：本法是雙抗體夾心法的一種改良形式，也是用于測(cè)定抗原的，其原理可用圖3來(lái)表示。本法首先是將特異性抗體a包被于固相

22、載體，經(jīng)洗滌加入含有欲測(cè)抗原之待檢樣品。經(jīng)孵育洗滌后再加一次未標(biāo)記的特異性抗體b，而這次加入的抗體b于第一次包被于固相載體上的特異性抗體a對(duì)被測(cè)抗原來(lái)說(shuō)都是特異性的，但不是用同種動(dòng)物免疫制備的，否則可出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。經(jīng)孵育洗滌后，再加酶標(biāo)記抗b抗體，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色進(jìn)行測(cè)定。這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此，放大的倍數(shù)更高，故比雙抗體夾心法更加靈敏。同時(shí)避免標(biāo)記特異性抗體，而另一優(yōu)點(diǎn)是只要標(biāo)記一種抗抗體，即可達(dá)到多種應(yīng)用。圖3：改良雙抗體夾心法測(cè)抗原示意圖用于測(cè)定抗原的尚有第4種叫做抑制性測(cè)定法（見(jiàn)圖4），它是先用抗原包被固相載體，然后分為二組，一組加入用參考抗體

23、和被檢標(biāo)本混合孵育后的混合溶液，假如標(biāo)本中不含抗原，則參考抗體未被結(jié)合。因此它可以和包被于固相載體上的抗原結(jié)合。如標(biāo)本中含有抗原，則抗原先與參考抗體結(jié)合，故參考抗體不再與包被于固相載體上的抗原結(jié)合。對(duì)加入酶結(jié)合物（抗球蛋白）和底物僅顯示剩余結(jié)合的抗體量。再與另一組不加待檢標(biāo)本的參考系統(tǒng)比較，被檢標(biāo)本對(duì)底物顯色的抑制程度與標(biāo)本中所含抗原量成比例，二者之差，即為欲測(cè)抗原的量。圖4：抑制性測(cè)定法的原理被檢標(biāo)本對(duì)底物顯色的抑制程度與標(biāo)本中所含抗原的量成比例，二者之差即為欲測(cè)抗原的量。(2)測(cè)定抗體方面：所用的方法稱為間接法，也是目前最常用的方法，其原理可用圖5來(lái)表示。圖5：間接法測(cè)抗體示意圖間接法首先

24、用抗原包被于固相載體，這些包被的抗原必須是可溶性的，或者至少是極微小的顆粒，經(jīng)洗滌，加入含有被測(cè)抗體之標(biāo)本，再經(jīng)孵育洗滌后，加入酶標(biāo)記抗抗體，(對(duì)人的標(biāo)本來(lái)說(shuō)即加酶標(biāo)抗人球蛋白igg、igm)，再經(jīng)孵育洗滌后，加底物顯色,底物降解的量，即為欲測(cè)抗體的量，其結(jié)果可用目測(cè)或用分光光度計(jì)定量測(cè)定，本法用不同種抗原包被固相載體后，只要用一種酶標(biāo)記抗人球蛋白，即可作多種人的傳染病、寄生蟲(chóng)病以及其他疾病的血清學(xué)診斷。如用酶標(biāo)記抗人igm，則可用于早期診斷。 (二)材料：聚乙烯塑料反應(yīng)板（ph9.6時(shí)可吸附蛋白ag），抗原il-2，待測(cè)血清，凍干酶聯(lián)抗體，濕盒，37oc洹溫箱，酶標(biāo)儀等。（三）方法與結(jié)果（雙

25、抗體夾心法為例）1抗體包被取潔凈的聚苯乙烯微量反應(yīng)板，于每孔內(nèi)加抗il-2抗體0.1毫升（用包被緩沖液稀釋，蛋白含量10微克/毫升），置371小時(shí)，棄抗體液，用洗滌液3次每次3分鐘。2加待測(cè)血清于每孔內(nèi)分別加不同稀釋度（如1：5，1：10，1：201：80）的待測(cè)血清，pbs空白對(duì)照，陰性對(duì)照血清，陽(yáng)性對(duì)照血清各0.1毫升。置3730分鐘，洗滌3次。3加酶聯(lián)抗體于每孔加酶聯(lián)抗體各0.1毫升，置3720分鐘，洗滌3次。4加臨時(shí)配制的底物溶液各0.1毫升，置暗處15分鐘。加2m硫酸1滴終止反應(yīng)。5. 結(jié)果判斷：（肉眼判斷）若顏色于陰性對(duì)照相同則為陰性，若較陰性對(duì)照深則為陽(yáng)性，根據(jù)顏色深淺以（+）表

26、示。6用酶標(biāo)儀檢測(cè)：待測(cè)值除以陰性值的比值大于2.1為陽(yáng)性，否則陰性?！舅伎碱}】一、有哪些實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能？二、常見(jiàn)的免疫標(biāo)記技術(shù)包括哪些？ 三、試述elisa常用的三種方法都是什么，何種檢測(cè)抗原、何種檢測(cè)抗體?！靖健?細(xì)胞因子活性檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞因子對(duì)闡明機(jī)體免疫應(yīng)答及其調(diào)節(jié)機(jī)制、免疫相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和知道臨床治療均具有重要意義。細(xì)胞因子的檢測(cè)主要分為免疫學(xué)、生物學(xué)和分子生物學(xué)三種檢測(cè)方法。免疫學(xué)方法主要采用雙位點(diǎn)elisa法定量檢測(cè)細(xì)胞因子，分子生物學(xué)方法主要檢測(cè)細(xì)胞因子mrna表達(dá)水平。本部分只介紹生物學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞因子活性，其原理是根據(jù)細(xì)胞因子對(duì)特定的依賴性細(xì)胞株（即

27、靶細(xì)胞）的促增殖作用，以增殖細(xì)胞中的dna合成或酶活性為指標(biāo)，間接推算出細(xì)胞因子的生物學(xué)活性單位。一、il-1生物學(xué)活性檢測(cè)（小鼠胸腺細(xì)胞增殖法）白細(xì)胞介素-1（il-1）主要是由活化的單核-巨噬細(xì)胞合成和分泌的一種細(xì)胞因子，具有活化淋巴細(xì)胞、協(xié)同刺激胸腺細(xì)胞增殖、參與抗體產(chǎn)生和促炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)功能。il-1有il-1和il-1構(gòu)成，結(jié)合同種受體，表現(xiàn)相同的生物學(xué)活性。用于檢測(cè)il-1生物活性的方法有多種，如小鼠胸腺細(xì)胞增殖法、d10g4.1細(xì)胞增殖法、el-4細(xì)胞測(cè)定法等。（一）原理：il-1與小鼠胸腺細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，il-1可刺激小鼠胸腺細(xì)胞增殖。進(jìn)一步通過(guò)3h-tdr摻入法或染料攝

28、入法判定小鼠胸腺細(xì)胞增殖量，推定il-1的生物學(xué)活性。通過(guò)檢測(cè)il-1的生物學(xué)活性，可了解單核-巨噬細(xì)胞等的功能。（二）材料：110%fcs-rpmi-1640培養(yǎng)液。2lps 用10% fcs-rpmi-1640配制10ug/ml。3刀豆蛋白a（cona） 用10% fcs-rpmi-1640配制2.5ug/ml。43h-tdr5c57bl小鼠，610周齡，雌雄均可。（三）方法：1小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生il-1的誘導(dǎo)（1）常規(guī)收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，10%fcs-imdm培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞2106/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，0.5ml/well。 （2） 每孔加20ug/ml lps0.15ml，37，

29、5%co2孵育3648小時(shí)。（3）此時(shí)培養(yǎng)上清內(nèi)含巨噬細(xì)胞分泌的高水平il-1，收集培養(yǎng)上清，12000r/min離心15分鐘，將上清移入新的1.5ml試管中，-20凍存。2il-1的生物學(xué)活性測(cè)定 胸腺細(xì)胞的制備：頸椎脫位處死小鼠，無(wú)菌取胸腺至于平皿中，加入5ml10%fcs-imdm培養(yǎng)液，200目不銹鋼網(wǎng)制成單個(gè)細(xì)胞懸液；1500r/min離心10分鐘，再用5%hanks液洗滌細(xì)胞2次后，重懸于10%fcs-imdm培養(yǎng)液中，調(diào)細(xì)胞濃度為1.0107/ml。 加樣：取胸腺細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0.1ml/well。再加入il-1待測(cè)樣品或il-1標(biāo)準(zhǔn)品，50ul/well，實(shí)驗(yàn)孔再加

30、入50ul cona（終濃度0.625ug/ml），同時(shí)設(shè)培養(yǎng)液對(duì)照孔（0.1ml細(xì)胞+0.1ml培養(yǎng)液）、cona對(duì)照（0.1ml細(xì)胞+50ul培養(yǎng)液+50ul cona），均設(shè)3復(fù)孔。37，5% co2孵育3660小時(shí)。 3h摻入：每孔加1.851010ubq/20ul（0.5uci/20ul）3h-tdr，繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)。 測(cè)定：多孔細(xì)胞收集器收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上，用液體閃爍儀測(cè)定3h-tdr摻入量（cpm）以凈cpm值（實(shí)驗(yàn)孔- cona對(duì)照孔cpm值）為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的不同稀釋濃度il-1標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)圖紙上繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)樣品中的il-1含量。（四

31、）關(guān)鍵點(diǎn) （1）吸取lps刺激的小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清時(shí)，必須離心，以除去細(xì)胞及細(xì)胞破碎成分。 （2）cona應(yīng)選擇淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的亞劑量，即選擇能夠激活胸腺細(xì)胞，又不引起明顯增殖的量，如果cona過(guò)量，則不能有效反應(yīng)il-1的刺激活性。二、il-2生物學(xué)活性檢測(cè)（mtt）（一）原理白細(xì)胞介素-2（il-2）是由活化的輔助性t細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞增殖因子，具有促t細(xì)胞增殖和維持t細(xì)胞體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)的作用。ctll-2為il-2依賴細(xì)胞株可用作il-2生物學(xué)活性定量檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用mtt分析法，通過(guò)測(cè)定ctll-2細(xì)胞的增殖量，確定il-2生物學(xué)活性單位。檢測(cè)il-2的生物學(xué)活性，可以間接了解輔助性

32、t細(xì)胞的功能。（二）材料 （1）1）10%fcs-rpmi-1640培養(yǎng)液，含2mmol/l谷氨酰胺、25mmol/lhepes、10u/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素。 （2）mtt（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用pbsa緩沖液配制成1mg/ml濃度工作液，4避光保存。 （3）il-2標(biāo)準(zhǔn)品。 （4）pha（200ug/ml）。（三） 方法 （1）人外周血t細(xì)胞分泌il-2的誘生： 人pbmc分離：采用常規(guī)淋巴細(xì)胞分層液濃度梯度離心法分離pbmc，用10%fcs-rpmi-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為11

33、05/ml加樣：接種細(xì)胞懸液于24孔培養(yǎng)板，每孔0.5lml，每孔再加pha0.5ml，37度，5% co2孵育48小時(shí)。 回收上清：吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清，12000r/min離心15分鐘，收集上清，-20度凍存。 （2）il-2生物活性測(cè)定 ctll-2細(xì)胞制備：取傳代培養(yǎng)2448小時(shí)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ctll-2細(xì)胞，用培養(yǎng)液離心洗滌2次，每次1000r/min離心5分鐘，再用10%fcs-rpmi-1640培養(yǎng)液調(diào)制細(xì)胞濃度為1105/ml。 加樣：將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.1ml。同時(shí)將待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做倍比稀釋，每孔加入0.1ml，每個(gè)稀釋濃度均設(shè)3復(fù)孔。另設(shè)培養(yǎng)液對(duì)照孔（100ul細(xì)

34、胞+100ul培養(yǎng)液）。37，5% co2孵育40小時(shí)。 mtt摻入：輕輕吸取上清液100ul，加mtt（1mg/ml）100ul，37度，5% co2孵育2小時(shí)。 測(cè)定：離心培養(yǎng)板，2000r/min，5分鐘，吸棄上清液，每孔加100uldmso，作用30分鐘，用酶標(biāo)測(cè)定儀于波長(zhǎng)570nm測(cè)吸光值（a）。 計(jì)算：用標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的凈a570nm值（實(shí)驗(yàn)孔-陰性對(duì)照孔的a570nm值）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測(cè)樣品il-2水平。（四）關(guān)鍵點(diǎn) （1）ctll-2細(xì)胞存活率應(yīng)大于95%。 （2）因標(biāo)本中含il-4等，可影響il-2的測(cè)定，最好采用抗il-4mab吸附劑除去il-4。三、i

35、l-8生物學(xué)活性檢測(cè)（一）原理il-8對(duì)中性粒細(xì)胞具有激活和趨化作用，通過(guò)檢測(cè)中性粒細(xì)胞的遷移距離可以確定il-8的生物學(xué)活性，即對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化活性。（二）材料（1） 6%右旋糖酐生理鹽水溶液。（2） 淋巴細(xì)胞分層液比重為1.077+（-）0.001。（3） 2%瓊脂糖：稱取2g瓊脂糖，加入到100ml蒸餾水中，煮沸溶解。（4） 0.1%白明膠hanks液。（5） dmem培養(yǎng)液（2濃縮），內(nèi)含20%fcs和0.75mg/mlna2co3溶液。（6） 甲醇溶液、wright-giemsa染液。（7） 潔凈載玻片。（8） 打孔器，直徑為3mm。（三）方法 （1）il-8的誘生 常規(guī)分離pbm

36、c，洗滌后，調(diào)細(xì)胞濃度為5106/ml。 將細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.5ml。 加誘生劑lps（20ug/ml），每孔0.5ml，37度，5% co2孵育48h。 離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用hcl溶液調(diào)為酸性（ph4.0），經(jīng)sephadxg-75柱分離，收集活性組分即為待測(cè)的il-8粗品。（2）il-8的生物活性檢測(cè) 瓊脂板的制備；取溶化后50度左右保溫的2%瓊脂糖與等體積50度水浴預(yù)溫的dmem培養(yǎng)液（2濃縮），混合，取3ml加到潔凈的載玻片上，鋪成薄層，室溫凝固后，放4度，進(jìn)一步凝固3060分鐘，紅打孔器打孔。 中性粒細(xì)胞制備：常規(guī)分離人外周血中性粒細(xì)胞。 加樣：取10ul中性

37、粒細(xì)胞懸液加入瓊脂板各組中心孔，分別取10ul待檢樣品及陽(yáng)性對(duì)照品加入樣品孔，取10uldmem培養(yǎng)液加入對(duì)照孔；將玻片置于濕盒內(nèi)，37度溫育2小時(shí)。 染色：用甲醇溶液固定30分鐘，用瑞氏染液染片并干燥。 檢測(cè)：顯微鏡下分別測(cè)量細(xì)胞從中心孔向樣品孔游走的距離（趨化游走距離）及向陽(yáng)性對(duì)照孔的游走距離（自發(fā)游走距離），趨化 活性以趨化指數(shù)表示。 趨化指數(shù)=趨化游走距離/自發(fā)游走距離（四）關(guān)鍵點(diǎn) 為確認(rèn)待檢樣品中il-8的特異性趨化效應(yīng)，最好同時(shí)比較抗il-8抗體與待測(cè)樣品作用后的趨化結(jié)果。實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞免疫檢測(cè)ii：淋巴細(xì)胞分離計(jì)數(shù)及活性（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn) ）【實(shí)驗(yàn)任務(wù)】市場(chǎng)上有一廣告產(chǎn)品，據(jù)說(shuō)有免疫增強(qiáng)

38、作用，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)方案證實(shí)之（從淋巴細(xì)胞數(shù)目及活性的角度考慮）?！灸康囊蟆恳弧⒊醪秸莆諒牧馨图?xì)胞數(shù)目及活性的角度證實(shí)某產(chǎn)品有免疫增強(qiáng)作用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。二、掌握用密度梯度離心的方法分離外周血淋巴細(xì)胞。三、掌握用溴花二氨基異硫氫化物法分離外周血淋巴細(xì)胞。四、了解用間接免疫吸附分離法分離外周血淋巴細(xì)胞。五、了解fcm的原理、操作步驟及其實(shí)用意義?！緦?shí)驗(yàn)條件】一、淋巴細(xì)胞分離液(聚蔗糖一泛影葡胺)，外周血，肝素，hanks液。二、注射器、針頭、10ml離心管、滴管、乳膠頭、試管、試管架、離心機(jī)、天秤。三、新鮮豚鼠血、兔紅細(xì)胞（rrbc）、溴花二氨基異硫氫化物（aet）、淋巴細(xì)胞分層液。四、其它：hank

39、s液，含小牛血清的199培養(yǎng)液，無(wú)菌生理鹽水，3.5%氯化鈉溶液，離心機(jī)等?！咀鳂I(yè)】請(qǐng)將你們小組的設(shè)計(jì)方案與技術(shù)路線在討論完善后記錄在實(shí)驗(yàn)報(bào)告本，并將可行的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在實(shí)驗(yàn)課中實(shí)施?！緟⒖假Y料】一、淋巴細(xì)胞主要分t淋巴細(xì)胞和b淋巴細(xì)胞兩大亞群，它們具有不同的特性和功能，為此在進(jìn)行某些免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先需分離出純的t淋巴細(xì)胞和b淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞廣泛分布在組織和器官中，但由于采血方便，目前多由血液中分離淋巴細(xì)胞，從外周血中分離淋巴細(xì)胞的方法很多，下面介紹幾種常用的分離淋巴細(xì)胞方法。二、密度梯度離心法（一）原理： 根據(jù)各類血細(xì)胞的比重不同，采用分離液提取淋巴細(xì)胞。分離液的比重稍高于淋巴細(xì)胞，而低于紅

40、細(xì)胞和粒細(xì)胞；本實(shí)驗(yàn)用比重為1.077聚蔗糖一泛影葡胺淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞。 (二)材料： 1淋巴細(xì)胞分離液(聚蔗糖一泛影葡胺) 2外周血，肝素、hanks液 3注射器，針頭，10ml離心管，滴管、乳膠頭 試管，試管架，離心機(jī)、天秤（三）方法與結(jié)果： 1取肝素抗凝血：取靜脈外周血2ml，每ml血加肝素2530國(guó)際單位。 2用hanks液稀釋一倍到4ml。 3用10ml離心管，加入2ml淋巴細(xì)胞分離液，在分離液的界面上輕輕加入4ml已稀釋的肝素抗凝血。4將離心管裝入離心機(jī)的套筒，平衡后，以2000轉(zhuǎn)分的速度離心20分鐘。 5此時(shí)可見(jiàn)液體分為四層，最下層是紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，分離液在它的上層，

41、最上層是血漿層，淋巴細(xì)胞在血漿層和分離液之間。用滴管直接插入淋巴細(xì)胞層（灰白色混濁層）吸取淋巴細(xì)胞。（見(jiàn)圖）6將淋巴細(xì)胞放入含有hanks液5m1試管中，充分混勻，1000轉(zhuǎn)分離心10分鐘，棄去上清液，即獲得純淋巴細(xì)胞。圖用分層液離心后的血細(xì)胞層三、溴花二氨基異硫氫化物法（aet法）（一）原理：淋巴細(xì)胞與用溴花二氨基異硫氫化物（簡(jiǎn)稱aet）處理的綿羊紅細(xì)胞（srbc）混合后，其中全部t淋巴細(xì)胞均能吸附aetsrbc，形成牢固穩(wěn)定而巨大的e花環(huán)，較正常未處理的srbc形成的e花環(huán)百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復(fù)性好。再經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離時(shí)，aete花環(huán)易沉于管底，而未形成e花環(huán)的t淋巴

42、細(xì)胞，用低滲液解花環(huán)周圍的aetsrbc，便可獲得純t淋巴細(xì)胞，而b淋巴細(xì)胞可直接取自分層液的界面。(二)材料：1新鮮豚鼠血，兔紅細(xì)胞（rrbc），溴花二氨基異硫氫化物（aet），淋巴細(xì)胞分層液。2其它：hanks液，含小牛血清的199培養(yǎng)液，無(wú)菌生理鹽水，3.5%氯化鈉溶液，離心機(jī)等。（三）方法與結(jié)果：1aetrrbc制備（1）aet溶液的制備稱取aet粉劑402毫克，溶于10毫升蒸餾水中，使成為0.143m溶液，用4n naoh溶液調(diào)ph9.0。該溶液必須新鮮配制，不宜久存。（2）aet處理rrbc取洗滌好壓積的rrbc，按一份壓積aetrrbc加入4份新鮮配制的ph9.0的aet溶液充分

43、混勻置37水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次。取出加冷無(wú)菌生理鹽水至離心管口（12厘米）1800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。連續(xù)洗滌35次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少aetrrbc粘附成團(tuán)，并觀察有無(wú)溶血。若有溶血現(xiàn)象，則用含小牛血清的199培養(yǎng)基再洗一次，最后配成10%aetrrbc懸液，置4保存，不得超過(guò)5天。（3）1%aetrrbc的配制：將預(yù)先配制并保存于4冰箱的10%濃度的aetrrbc，以含10%小牛血清的199培養(yǎng)液稀釋至1%。2從新鮮豚鼠血液分離單個(gè)核細(xì)胞，操作見(jiàn)后試驗(yàn)。3aete花環(huán)試驗(yàn)：將分離的單個(gè)核細(xì)胞（2106/毫升）與等量1%aetrrbc混合，置37水浴15分鐘，每隔5分鐘

44、搖勻一次，分裝數(shù)管，每管23毫升，低速離心（1000轉(zhuǎn)/分鐘）5分鐘后，移至4冰箱45分鐘。4t淋巴細(xì)胞和b淋巴細(xì)胞的分離將形成e花環(huán)的細(xì)胞懸液，再用淋巴細(xì)胞分層液分離，吸取界面云霧狀的細(xì)胞，即為富含b淋巴細(xì)胞群。沉淀于管底的e花環(huán)，用hanks液洗一次后，加雙蒸水3毫升處理3分鐘，低滲裂解e花環(huán)周圍的rrbc，立即加3.5%氯化鈉溶液1毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含t淋巴細(xì)胞群?！咀鳂I(yè)】請(qǐng)將你們小組的設(shè)計(jì)方案在討論完善后記錄在實(shí)驗(yàn)報(bào)告冊(cè)，并將可行的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在實(shí)驗(yàn)課中實(shí)施?！舅伎碱}】一、為什么要將待分離血液稀釋一倍?二、為什么在分離液界面上加肝素抗凝血時(shí)不能打亂兩液間的液面?【附】

45、一、間接免疫吸附分離法（一）原理 將t細(xì)胞與針對(duì)某種t細(xì)胞亞群特異表面分化抗原的特異性鼠抗人單克隆抗體一起孵育，再置人預(yù)先包被有羊抗鼠ig的平皿中。此時(shí)結(jié)合有鼠抗人特異性抗體的t細(xì)胞亞群將吸附在平皿中，而其他t細(xì)胞則不被吸附，由此即可將某一t細(xì)胞亞群從t細(xì)胞群體中分離出來(lái)。現(xiàn)以用抗cd8抗體將t細(xì)胞分為cd4+與cd8+細(xì)胞兩大類為例。（二）材料1羊抗鼠ig，對(duì)t細(xì)胞無(wú)毒性作用。2特異性鼠抗人cd8單克隆抗體或多抗。315x100mm塑料平皿。4已純化的t細(xì)胞懸液。（三）方法1用ph9.5，0.05moll的tris-hcl緩沖液將羊抗鼠ig稀釋至10gml，加10ml至平皿中，室溫下孵育40

46、min，或4下孵育24h，輕搖平皿使整個(gè)皿底均被抗體包被。此平皿在4下可貯存12周。2測(cè)定抗cd8抗體的最適使用濃度，并用pbs將抗cd8抗體稀釋至該濃廈。3將21073107個(gè)t細(xì)胞置于15ml離心管中，在410下，以1300rmin離心10min，棄上清后，將抗cd8抗體加至t細(xì)胞中，懸浮細(xì)胞置冰浴30min。4當(dāng)t細(xì)胞懸液置冰浴時(shí)，用吸管吸出平皿中未吸附的羊抗鼠ig(可再用于包被平皿)，用含5ncs的pbs 57ml洗滌平皿，輕輕搖動(dòng)后吸出(亦可再利用)，重復(fù)洗滌3 次。5將含5ncs的pbs 510ml加至t細(xì)胞中，在4下，以1300rmin離心10min，棄上清，重復(fù)洗滌一次。用3m

47、l上述液體懸浮t細(xì)胞。6將t細(xì)胞懸液倒人上述經(jīng)洗滌后的平皿中，立即置4下孵育30min，取出后輕搖30s，再在同樣條件下孵育30min。7用吸管將未吸附的細(xì)胞懸液輕輕吸出，用含1ncs的pbs輕輕洗滌平皿，洗滌 時(shí)將吸管尖嘴抵住平皿的邊緣并緩慢滴加pbs，然后吸出，重復(fù)23次。將吸出的液體留置于另一試管中，以便分離未吸附的cd4+細(xì)胞。8用倒置顯微鏡檢查平皿，并對(duì)未吸附的殘留細(xì)胞計(jì)數(shù)，繼續(xù)洗滌，直至所有未吸附的cd4+細(xì)胞均被洗出。9加入含1ncs的pbs 57ml置平皿中，用無(wú)菌刮匙輕輕刮下吸附的cd8+細(xì)胞，重復(fù)23次?；蛘呒尤?5ml上述液體，用吸管猛烈吹打，將吸附的cd8+細(xì)胞洗下。1

48、0分別將cd4+細(xì)胞與cd8細(xì)胞懸液在4下，以1300rmin離心10min，用完全rpmi-1640懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。如果需提高細(xì)胞純度，可再重復(fù)(7)(9)步。二、免疫磁性微珠分離法 將羊抗鼠ig與磁性微珠結(jié)合形成免疫磁性微珠（imb）。將t細(xì)胞與針對(duì)某種需去除的t細(xì)胞亞群表面抗原的特異性單克隆抗體孵育后，再與imb孵育，則需去除的t細(xì)胞亞群與imb結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的作用下，imb連同相應(yīng)的靶細(xì)胞一起快速高效地沉降而被去除，留下的懸浮細(xì)胞即為所需的t細(xì)胞亞群。此種方法是一種負(fù)選性分離法，其優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞純度高，產(chǎn)量大，不需使用離心沉淀分離技術(shù)，且所得細(xì)胞表面抗原未與抗體交聯(lián)。

49、此外，與imb結(jié)合的t細(xì)胞亞群再經(jīng)過(guò)解離處理后，亦可重回收利用。此法尤其適合于從凍存細(xì)胞中分離b細(xì)胞。其材料和方法參見(jiàn)上述間接免疫吸附分離法。三、流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)（fcm）免疫細(xì)胞是一組不均一的細(xì)胞群體。各種特定的細(xì)胞群其細(xì)胞表面表達(dá)有各自特異的表面標(biāo)志分子，利用這些特異的表面標(biāo)志，可以鑒定、分離和純化相應(yīng)的細(xì)胞群。隨著單克隆抗體技術(shù)的誕生和免疫標(biāo)記技術(shù)（特別是熒光標(biāo)記技術(shù)）的發(fā)展，以及計(jì)算機(jī)科學(xué)的應(yīng)用，使利用儀器的方法檢測(cè)特異的細(xì)胞膜表面分子成為可能。本章介紹的熒光激活細(xì)胞分類技術(shù)就是采用單克隆抗體技術(shù)和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，并結(jié)合光學(xué)檢測(cè)和計(jì)算機(jī)分析技術(shù)而產(chǎn)生的鑒定和分離特定細(xì)胞亞群的技術(shù)。

50、（一）原理 流式細(xì)胞儀（flow cytometer）是一種能夠探測(cè)和計(jì)數(shù)以單細(xì)胞液體流形式穿過(guò)激光束的細(xì)胞檢測(cè)裝置，由于在檢測(cè)中使用的細(xì)胞標(biāo)志示蹤物質(zhì)為熒光標(biāo)記物，因此，用來(lái)分離、鑒定細(xì)胞的流式細(xì)胞儀有被稱為熒光激活細(xì)胞分類儀（fluorescence activated cell sorter,facs）,是分離和鑒定細(xì)胞群及亞群的一種強(qiáng)而有力的應(yīng)用工具。其原理是在一組混合的細(xì)胞群中，加入特異的針對(duì)特定靶細(xì)胞表面分子的熒光標(biāo)記單克隆抗體，這種特異單克隆抗體與其對(duì)應(yīng)的抗原靶分子結(jié)合，結(jié)合后的熒光標(biāo)記抗體停留在特定細(xì)胞的表面，稱為熒光抗體標(biāo)記的靶細(xì)胞；將含有被標(biāo)記細(xì)胞的混合細(xì)胞群混懸在一定容積

51、的上樣緩沖液中，再通過(guò)facs的進(jìn)樣吸管孔，儀器就會(huì)將細(xì)胞懸液制成以單細(xì)胞排列的微細(xì)流束。當(dāng)每一個(gè)細(xì)胞通過(guò)儀器的激光束照射時(shí)，帶在細(xì)胞上的熒光就會(huì)被相應(yīng)的激光束激活并發(fā)出對(duì)應(yīng)的熒光，通過(guò)敏感的光電倍增管即可檢測(cè)到從細(xì)胞表面發(fā)出的熒光。根據(jù)測(cè)得的散射光（scattered light ）可得到細(xì)胞大小及顆粒狀態(tài)的信息；而從熒光的發(fā)射強(qiáng)度(fluorescence emissions)則提供了結(jié)合在細(xì)胞上的抗體信息，進(jìn)而也被反映了該細(xì)胞表面相應(yīng)分子的表達(dá)情況。在流式細(xì)胞儀分離裝置中，返回到計(jì)算機(jī)的信號(hào)，可用來(lái)產(chǎn)生一種電荷，這種電荷以特定準(zhǔn)確的時(shí)間通過(guò)facs的吸管孔，在與吸管孔的液體流相相遇時(shí)，可

52、將液體流打碎成只含一個(gè)細(xì)胞的微滴。含有電荷的微滴就會(huì)從主液體流中偏移，穿過(guò)一雙極板。帶正電荷的微滴被吸引至陰極，而帶負(fù)電荷的被吸引至陽(yáng)極。以這種方式，特定的細(xì)胞亞群由于標(biāo)記著不同的熒光抗體而帶有不同的電荷，從而將目的細(xì)胞從混合的細(xì)胞群中分揀出來(lái)。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用：流式細(xì)胞儀主要有兩個(gè)最基本的用途：第一是可以定量分析鑒定活細(xì)胞表面表達(dá)的特異分子，第二是進(jìn)行特定的活細(xì)胞群的分離和純化。1免疫細(xì)胞群的分類 靜止淋巴細(xì)胞之間從其外觀形態(tài)難以區(qū)分，都是以致密的核及少量細(xì)胞質(zhì)組成的小而圓的細(xì)胞為特征。然而，這些細(xì)胞確是由功能各異的不同細(xì)胞亞群所組成，各種細(xì)胞群表達(dá)各自特殊的表面分子。例如,b淋巴細(xì)胞上表達(dá)有特異的

53、膜表面免疫球蛋白（mig），而成熟的t淋巴細(xì)胞表面表達(dá)特異的cd3分子。t淋巴細(xì)胞又可進(jìn)一步按其表達(dá)的不同表面標(biāo)志細(xì)分成不同的亞群，如cd4+cd8-和cd4-cd8+亞群。因此，可由這些特征性的表面標(biāo)志，將細(xì)胞分為不同的群或亞群。2免疫細(xì)胞的分化發(fā)育 免疫細(xì)胞分化發(fā)育的不同階段，其表面標(biāo)志也在不斷地發(fā)生著變化。如胸腺細(xì)胞（發(fā)育過(guò)程中的t淋巴細(xì)胞），在發(fā)育的不同階段從不成熟到成熟，其表面標(biāo)志經(jīng)歷了從雙陰性（cd4-cd8-）到雙陽(yáng)性（cd4-cd8-），直到單陽(yáng)性（cd4+cd8-或cd4-cd8+）的過(guò)程。正常生理狀態(tài)下，發(fā)育不同階段的胸腺細(xì)胞以一定的比例存在于胸腺中。通過(guò)檢測(cè)這些標(biāo)志，即可

54、判定某些因素（基因突變等）對(duì)胸腺細(xì)胞發(fā)育的影響。3免疫細(xì)胞的分子表達(dá) 免疫細(xì)胞的不同因素的影響下，其表達(dá)的分子也會(huì)發(fā)生變化。通過(guò)檢測(cè)這些分子的變化，可分析細(xì)胞功能以及細(xì)胞分化狀態(tài)等。例如，靜止的t淋巴細(xì)胞不表達(dá)或低水平表達(dá)cd69分子；而一經(jīng)活化，其表達(dá)cd69分子數(shù)量明顯增加。因此，可通過(guò)檢測(cè)這些活化標(biāo)志的變化來(lái)判定細(xì)胞狀態(tài)以及研究影響細(xì)胞活化狀態(tài)的因素。4免疫細(xì)胞的分離 如前所述，免疫細(xì)胞是一組極不均一的群體。所以在研究免疫細(xì)胞功能時(shí)，常常需要把某些特異的細(xì)胞分離和純化。雖然免疫細(xì)胞分離的方法很多，但用facs來(lái)純化特定的細(xì)胞群是目前最為有效和方便的手段。例如，最近頗受關(guān)注的cd4+cd25+t淋巴細(xì)胞是一群具有免疫調(diào)節(jié)（免疫抑制）功能的細(xì)胞群。在對(duì)其特點(diǎn)及功能進(jìn)行研究時(shí)，首要的問(wèn)題是分離該細(xì)胞群。用相應(yīng)的單克隆抗體與其結(jié)合，再用facs進(jìn)行分離，就能得到純度很高cd4+cd25+t淋巴細(xì)胞細(xì)胞群。而其他分離方法不僅分離過(guò)程煩瑣，也很難控制無(wú)菌條件及保證細(xì)胞純度。（二）方法流式細(xì)胞儀的使用一般分為三個(gè)步驟。第一，是儀器前階段，包括試劑的準(zhǔn)備，細(xì)胞制備、細(xì)胞的熒光染色；第二，是流式細(xì)胞儀階段，主要是儀器的操作；第三，是結(jié)果分析階段。1、細(xì)胞和試劑的準(zhǔn)備（1）細(xì)胞樣品：來(lái)源淋巴細(xì)胞或外周血的白細(xì)胞。（2）熒光標(biāo)記單克隆抗體：常用的