實驗8植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定之歐陽文創(chuàng)編

1、實驗8植物組織中可溶性蛋白質(zhì)含量的測定時間：2021.03. 12創(chuàng)作：歐陽文1斐林-酚試劑法原理斐林（Folin）-酚試劑法結(jié)合了 雙縮腺試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，其中包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，與銅試劑作用 生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉗酸、磷餌 酸試劑還原，生成磷鉗藍(lán)和磷鉤藍(lán)的深藍(lán)色混合物，顏色深 淺與蛋白含量成正相關(guān)。在650nm時比色測定的靈敏度比雙 縮豚法高100倍。由于膚鍵顯色效果增強(qiáng)，從而減少了因蛋 白質(zhì)種類引起的偏差。該法適于微量蛋白的測定（范圍為5 100 Ug蛋白質(zhì)）。材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料各種植物材料。（二）儀器設(shè)備722分光光度計，離心

2、機(jī)，恒溫水浴，定量加 樣器，冷凝回流裝置一套，研缽，離心管，刻度移液管，微 量滴定管，試管等。(三) 試劑(1)0. 5mol / L NaOHo (2)斐林-酚試劑甲液：由 A、B兩種溶液組成：A液：4%碳酸鈉(Na2C03)溶液與0. 2mol/L氫氧化鈉(NaOH) 溶液等體積混合。B液：1%硫酸銅(CuS04 5H20)溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液 等體積混合。使用前將A與B按50:1的比例混合即成，此試劑只能在使 用當(dāng)天配制。(3)斐林-酚試劑乙液：稱取鵠酸鈉(Na2W04o H20)100g,鉗 酸鈉(Na2Mo04 2H20)25g,加蒸憾水 700ml 溶解于 1500mL 的圓底

3、燒瓶中。之后加入85%的H3P0450mL，濃Hcl 100 mL,安上回流裝置(使用磨口接頭，若用軟木塞或橡皮塞 時，就必須用錫鉗紙包起來)，使其慢慢沸騰10h。冷卻后加 入硫酸鋰(Li2S04. H20) 150g,蒸鐳水50ml,漠水2-3滴, 打開瓶口煮沸15min,以逐出過量的漠，冷卻后溶液呈黃色 (若仍綠色，須再滴加幾滴澳水，繼續(xù)煮沸15min) o待冷 卻后稀釋至1000ml,過濾入棕色瓶屮保存。使用時大約加水 1倍，使最終濃度相當(dāng)于lmol/L酸度。因此在使用前應(yīng)進(jìn)行標(biāo)定。標(biāo)定方法：取5ml福林-酚試劑 乙液放入錐形瓶內(nèi)，用lmol/L標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，酚 瞰作指示劑，當(dāng)溶

4、液突然轉(zhuǎn)紅再轉(zhuǎn)灰綠時，即為滴定終點。 計算其相當(dāng)?shù)乃岫?，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)至相當(dāng)于 lmol/L的酸度。在測定時要注意，因為酚試劑僅在酸性穩(wěn) 定，但此實驗的瓜只在pHHlO的情況下發(fā)生，所以當(dāng)加酚 試劑時，必須立即混勻，以便在磷鉗酸-磷鵠酸試劑被破壞 前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會使顯色程度減弱。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:稱取25噸牛血清蛋白,溶于100ml蒸 惘水中，使終濃度為250 Ug/mlo實驗步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）取18mmX 200mm試管7支，1-7編號，分別加入OmL、0. lmL 0. 2mL 0. 4mL、0. 6mL 0. 8mL 1. OmL 標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)溶液，用蒸鐳水補

5、足ImL,使每管含蛋白量分別為 Oumol/L、25 U mol/L 50 U mol/L 100 U mol/L150 U mol/L 200 U mol/L 250 U mol/Lo（2）用定量加樣器給每支試管中加入5mL甲液，混勻，于 30C下放置 lOmino（3）再向試管中噴射加入0.5mL乙液，立即振蕩混勻，在 30C下準(zhǔn)確保溫30min（4）以不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白的1號管為空白，在650nm下用lcni 光徑的比色皿測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光 度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）樣品的測定樣品的提?。悍Q取鮮樣0. 5g,用5mL蒸鐳 水或緩沖液研磨成勻漿后，10000 r/mi

6、n離心lOmin,取上 清液1. OmL （視蛋白質(zhì)含量適當(dāng)稀釋）于試管中，然后重復(fù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的24步驟，以空白管調(diào)零，測定吸光 度。根據(jù)吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求岀樣品中的蛋白質(zhì)含量。結(jié)果計算樣品屮蛋白的含量=（mg / g）式中：C為查標(biāo) 準(zhǔn)曲線值，Ug； VT為提取液總體積，mL； WF為樣品鮮重， g; Vs為測定時加樣量，mLo 注意事項還原物質(zhì)，其他酚類物質(zhì)及檸檬酸對此反應(yīng)有干 擾。II.考馬斯亮藍(lán)G-250染色法原理考馬斯亮藍(lán) G250（Coomassie brilliant blue G250）測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。該染料在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液屮當(dāng)它與蛋白

7、質(zhì)的 疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nm,后者在 5951 lnmo在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（11000 U g）,蛋白質(zhì) 與色素結(jié)合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正 比，故可用于蛋白質(zhì)的定量測定?？捡R斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)十分迅速，2min左右即 達(dá)到平衡。其結(jié)合物在室溫下lh內(nèi)保持穩(wěn)定。此法靈敏度 高（比斐林-酚法還高4倍），易于操作，干擾物質(zhì)少，是一 種比較好的定量法。其缺點是在蛋白質(zhì)含量很高時線性偏 低，且不同來源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有一定差異。材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料小麥葉片及其他植物材料。（二）儀器設(shè)備722分光光度計，研缽，燒杯，量瓶，移液

8、 管，具塞刻度試管等。（三）試劑標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：100 U g / mL牛血清白蛋白：稱取牛血 清蛋白25 Ug,加水溶解并定容至1 OOmL,吸取上述溶液 40mL,用蒸鐳水稀釋至lOOmL即可。（2）考馬斯亮藍(lán)G-250溶液:稱取lOOmg考馬斯亮藍(lán)G-250, 溶于50mL 90%乙醇中，加入lOOmL 85%（W/V）的磷酸，再 用蒸憎水定容到1L,貯于棕色瓶屮。常溫下可保存一個月。實驗步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6文具塞試管，按表2-29-1加入試 劑（0-100 Ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白）?；旌暇鶆蚝?，向各管中加 入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，搖勻，并放置5min左右， 用lcni

9、光徑比色皿在595nm下比色測定吸光度。以蛋白質(zhì)濃 度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）樣品測定（1）樣品提取。方法與斐林-酚試劑法相同。（2）吸取樣品提取液1. 0ml,放人具塞試管中（每個樣品重復(fù) 2次），加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，充分混合，放置 2min后在595nm下比色，測定吸光度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得 蛋白質(zhì)含量。結(jié)果計算樣品中蛋白質(zhì)的含量=（mg / g）式中:C、VT、WF、Vs的表示意義與斐林-酚法相同。III.紫外吸收法原理蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、色氨酸等殘基在280nm波 長下具有最大光吸收。由于各種蛋白質(zhì)中都含有酪氨酸，因 此280nm的光吸收度是蛋白

10、質(zhì)的一種普遍性質(zhì)。在一定程度 下，蛋白質(zhì)溶液在280nm吸光度與其濃度成正比，故可作定 量測定。核酸在紫外區(qū)（260nm）也有吸收，可通過校正加以 消除。材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料小麥葉片及其他植物材料。（二）儀器設(shè)備紫外分光光度計，離心機(jī)，刻度移液管。（三）試劑0lmol/L PH 7. 0磷酸緩沖液。實驗步驟（一）樣品提取與菲林-酚法相同。（二）測定取適量的樣品提取液，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度，用0. lmol/L pH7.0磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋后，用紫外分光光度計 分別在280nm和260nm波長下讀取吸光度，以pH7. 0磷酸緩 沖液為空白調(diào)零。結(jié)果計算蛋白質(zhì)濃度=1. 45A280-0. 744A260 （mg/mL）蛋 白質(zhì)含量二式中：1.45和0.74為校正值：A280為蛋白質(zhì)溶 液在280nm處