入肝門靜脈動脈化加門腔分流術對大鼠肝臟再生的影響

1、入肝門靜脈動脈化加門腔分流術對大鼠肝臟再生的影響 【摘要】 【目的】 在大鼠70%肝部分切除基礎上建立入肝門靜脈動脈化加門腔分流術的模型，并研究大鼠肝臟再生情況?！痉椒ā?155只sprague-dawley大鼠分為3組。實驗組大鼠65只，利用右腎動脈行入肝門靜脈動脈化，并行門腔分流及肝部分切除，肝切組大鼠65只，僅進行肝部分切除，對照組大鼠25只，僅右腎切除。分別觀察實驗組及肝切組術后2、7、14及28 d殘肝再生比率變化，以及3組在術中0 h、術后24、48、72 h及7 d各時相點殘肝肝臟s期細胞比例及增殖細胞核抗原（pcna）陽性表達的肝細胞比例情況?！窘Y果】 術后2、7、14 d兩組

2、肝臟再生比率相比，實驗組較肝切組明顯增高，差異有顯著統計學意義（p 0.05）。術后各時相點實驗組及肝切組殘肝s期肝細胞比例及pcna陽性表達肝細胞比例均較對照組明顯升高，差異有顯著統計學意義（p 0.01）。實驗組與肝切組相比，術后24 h殘肝s期細胞比例及pcna陽性細胞比例均已經開始升高，至術后48、72 h及術后7 d，實驗組仍明顯高于肝切組，差異有顯著統計學意義（p 0.01）。【結論】 入肝門靜脈動脈化重建入肝血流對大鼠肝細胞的增生及增殖有促進作用，是預防肝部分切除術后急性肝功能衰竭的有效方法?！娟P鍵詞】 門靜脈動脈化； 肝切除術； 再生； 增殖細胞核抗原abstract： 【ob

3、jective】 extended hepatectomy may result in acute postoperative liver failure， the aim of this study was to assess the effects of portal vein arterialization （pva） associated with portocaval shunt （pcs） on liver regeneration after 70% partial hepatectomy （ph） in a rat model. 【methods】 one hundred an

4、d fifty-five sprague dawley rats were assigned to three groups： pva associated with pcs after 70% ph （experimental group）； 70% ph only （ph group）； right nephrectomy （control group）。 liver regeneration rate （lrr） was assessed on days 2， 7， 14， and 28 after surgery， proliferating cell nuclear antigen

5、（pcna） labeling index， and s phase liver cell rate were assessed on 0 h， 24 h， 48 h， 72 h， and 7 days after surgery， respectively. 【results】 rats with 70% ph following pva + pcs showed significantly greater liver growth than rats with 70% ph only in the first 14 days postoperatively （p 0.01）。 howeve

6、r， no significant difference was found 28 days after surgery between these two groups. the rats with pva + pcs showed the highest values of pcna labeling index and s phase liver cell rates within 7 days， and higher than the other two non-pva groups significantly （p 0.01）。 【conclusions】 the present f

7、indings indicate that pva technique bring beneficial effects on maintaining liver regeneration after extended partial hepatectomy in rats.門靜脈動脈化最初應用于肝硬化門靜脈高壓癥門體分流術后預防肝功能衰竭和肝性腦病的發(fā)生1，以及用于進展期肝膽惡性腫瘤行擴大肝部分或肝門部根治性整塊切除后預防急性肝功能衰竭2，近年來更多用于肝移植術中處理門靜脈栓塞3，但多為動物模型研究。已經有部分學者在臨床上實驗性的應用了門靜脈動脈化技術，取得了一定的療效4-5。但對于門靜脈動

8、脈化對肝臟細胞再生的影響如何，至今研究仍較少。為了解門靜脈動脈化對肝臟細胞再生影響，結合之前所建立的利用右腎動脈行入肝門靜脈完全動脈化加門腔分流術的大鼠模型，我們在此基礎上附加肝部分切除，對大鼠肝臟再生情況進行研究，報道如下。1 材料與方法1.1 實驗動物及分組雄性sprague-dawley（sd）大鼠共155只，體質量250 300 g，分3組：實驗組65只，行右腎切除，利用右腎動脈行入肝門靜脈動脈化，門腔完全分流，再按higgins6方法行70%部分肝（肝左葉 + 中葉）切除；肝切除組65只，行右腎切除 + 70%部分肝（肝左葉 + 中葉）切除；對照組25只，僅行右腎切除。1.2 入肝門

9、靜脈動脈化模型建立所有大鼠術前均禁食24 h，不禁水，口罩吸入乙醚麻醉。取腹部正中切口進腹，在手術顯微鏡下，游離門靜脈上至門靜脈入肝左右分支處，下至脾靜脈與腸系膜上靜脈匯合處。游離右腎動脈、右腎靜脈和右輸尿管，右腎動脈由腹主動脈開口處游離至腎動脈分叉以遠3 mm，并結扎切斷由腎動脈發(fā)出的腎上腺動脈。右腎靜脈由下腔靜脈游離至腎門，游離輸尿管并結扎切斷。在距腹主動脈5 mm處阻斷右腎動脈，于右腎動脈分叉以遠2 mm處切斷右腎動脈，于右腎靜脈匯入下腔靜脈處阻斷右腎靜脈，距血管夾以遠2 mm處橫斷右腎靜脈，切除右腎。肝素生理鹽水反復沖洗各游離的血管腔。將右腎動脈從下腔靜脈后方拉至其左前方，并將動脈分叉

10、部用顯微組織剪剖開并修剪成魚口狀備用，長徑約3 4 mm，橫徑約2 mm。在門靜脈主干分支處和脾靜脈與腸系膜上靜脈匯合處分別用無損傷血管夾阻斷，在兩血管夾中下三分之一處橫斷門靜脈。修剪各斷端血管外膜，以備吻合。在10 16倍雙人雙目手術顯微鏡輔zhu下，用10-0帶針無創(chuàng)尼龍縫線將入肝門靜脈主干與右腎動脈橢圓形剖面兩定點連續(xù)端端吻合，縫合完畢后依次松開入肝門靜脈主干與右腎動脈血管夾，成功將入肝門靜脈動脈化（阻斷時間8 12 min）。之后用10-0帶針無創(chuàng)尼龍縫線將右腎靜脈與遠端門靜脈主干（脾靜脈與腸系膜上靜脈匯合處）兩定點連續(xù)端端吻合，完畢后松開阻斷血管夾，完成門腔完全分流（阻斷時間在10

11、12 min）。以雙鑷法證實吻合口通暢并檢查有無漏血，若有漏血，可間斷補針。肝部分切除參照higgins6大鼠肝部分切除方法，切除大鼠肝臟的左葉和中葉，切除量占全肝70%。術畢經大鼠尾靜脈注射1 ml生理鹽水，可翻身飲水，1 d后正常飲食，單籠飼養(yǎng)。1.3 指標測定1.3.1 肝臟再生比率的測定預實驗時取10只正常大鼠稱體質量為（261 31） g，切除全肝稱濕質量，為（10.96 2.24） g，再將肝臟切除左外葉、左內葉及中葉稱濕質量，為（7.13 1.43） g。得出肝切除部分濕質量占全肝的（68.4 1.7）%，同時求得全肝濕質量占體質量的（4.76 0.34）%。手術制模前大鼠稱質量

12、，根據全肝/體質量比例算出全肝理論質量，手術后稱取切除之部分肝臟濕質量，實驗組及肝切組分別在術后2、7、14、28 d取10只大鼠處死后取殘肝標本并稱取肝濕質量。根據公式計算肝再生比率： 肝再生率（%） = mc - （ma - mb）/（ma - mb） 100%， 其中ma為大鼠理論全肝質量，mb為切除肝質量，mc為處死大鼠取標本時的殘余肝質量。1.3.2 再生肝s期肝細胞比例3組各取5只大鼠分別于術中取1 cm3大小肝組織，術后6、24、48、72 h和7 d處死后于殘余肝上取部分組織以0.5 g/l膠原酶消化，制作單細胞懸液，供流式細胞術fcm檢測。使用facs calibur 型流式

13、細胞儀（美國becton dickinson公司），用碘化丙啶（pi）定量dna熒光染色法（美國bd cycletesttm plus dna reagent kit），雞紅細胞做標準樣品，調整儀器的cv值在5%以內，激光功率為200 w，激發(fā)光波長488 nm，濾光片波長620 nm，測定細胞熒光信號。每份樣品檢測20 000個細胞，計數活細胞總數，s期（dna合成期）肝細胞數，求出每例樣本s期肝細胞百分比例 = s期肝細胞/活細胞總數 100%。1.3.3 肝細胞pcna免疫組化檢測3組同樣分別于術中取1 cm3大小肝組織，術后6、24、48、72 h和7 d處死時留取肝臟標本，均中性甲醛

14、溶液固定、石蠟包埋。連續(xù)切片，厚4 m。切片常規(guī)脫蠟后蒸餾水沖洗5 min;用300 ml/l過氧化氫孵育30 min以抑制內源性過氧化物酶；用10 ml/l正常小牛血清孵育20 min封閉內源性過氧化酶；加一抗（美國 dako公司，pcna pc10 mab）稀釋液（1 50）4 濕盒內室溫孵育過夜，pbs沖洗3次 5 min;加生物素標記的二抗（福州邁新公司，kit-0100m，ultra sensitive s-p mouse）室溫孵育30 min;加abc復合物室溫作用30 min，pbs徹底沖洗；dab顯色液（福州邁新，dab-2031加強型 dab plus kit）染色2 10

15、min，蘇木素輕度復染；系列酒精脫水，二甲苯透明；樹膠封片觀察。由兩名病理醫(yī)師雙盲法分別觀察免疫組織化學染色結果，在高倍鏡下（10 40）隨機觀察4個視野共1 000個細胞，核內有棕黃色顆粒沉積者為陽性細胞，取其兩人計數結果的平均值，用百分率表示pcna陽性率。計算方法：pcna陽性表達細胞比例 = 陽性細胞數/觀察的細胞總數 100%。1.4 統計學處理應用spss 13.0版軟件，數據以x s表示，兩組間計量資料統計采用t檢驗， 3組間均數比較先行單因素方差分析后再行l(wèi)sd-t （least significant difference-t）檢驗，?。孔?= 0.05。2 結 果2.1 殘

16、肝再生率變化實驗組及肝切組術后肝臟再生率均呈上升趨勢，術后2 d至術后14 d，實驗組肝再生率與對照組相比明顯升高，差異有顯著統計學意義（p 0.05，表1）。2.2 殘肝s期肝細胞比例變化各組術后s期肝細胞比例的變化（表2）。從表中可以看出實驗組及肝切組s期肝細胞比例的變化，其高峰出現在術后24 72 h，以后逐漸下降，但到7 d時仍明顯高于本組0時相點的水平（p 0.01），說明肝細胞的再生主要發(fā)生在術后一周。特別是在術后3 d以內，是肝細胞再生的關鍵時期。三組在術后各個時相點總體均數存在統計學差異（f = 23.82，p 0.01）。其中實驗組與肝切除組相比，在術后各時相點均有明顯升高，

17、差異有顯著統計學意義（p 0.01）。與對照組相比，實驗組與肝切組術后各時相點s期肝細胞含量均明顯升高，差異有顯著統計學意義（p 0.01）。2.3 pcna陽性表達細胞比例變化對照組pcna表達陽性細胞比例在3%左右。實驗組及肝切組術后24 h陽性細胞比例已經明顯增高，至72 h達到高峰，此后逐漸下降，但仍明顯高于本組0時相點水平，差異有顯著統計學意義（p 0.01），表明術后1周細胞仍持續(xù)增殖。兩組術后各時間點與對照組相比，pcna陽性細胞比例均明顯升高，差異有顯著統計學意義（p 0.01），而實驗組pcna陽性細胞比例與肝切組比較，從術后24 h至術后7 d，各時間點相比較，實驗組均明顯

18、高于肝切組，差異有顯著統計學意義（p 0.01，表3;圖1）。3 討 論肝臟作為體內血流最豐富的器官，有肝動脈及門靜脈雙重血供，約75%的血液供應來自乏氧的門靜脈。以往一直認為，門靜脈血中的肝臟營養(yǎng)因子對肝細胞的再生及增殖是必不可少的，但早在1952年，cohn等就最早提出用動脈血代替門脈血灌注肝臟的設想，隨后的動物實驗證明，以適當壓力和流量的動脈血灌注肝臟，可使分流后的動物維持正常肝血流量，促使肝細胞再生，保證正常肝臟的解毒功能。張紅衛(wèi)等7在肝硬化大鼠行部分門靜脈結扎后發(fā)現，非結扎的相應肝葉代償增生，可提高期肝切除手術的范圍。近年來的動物實驗結果也顯示8，在擴大部分肝切除的模型中，采用門靜脈

19、動脈化的技術增加肝臟氧供及血流，能有效促進肝細胞的增生。本實驗結果亦表明，在完全門腔分流后行入肝門靜脈動脈化，肝臟雖然沒有靜脈血的灌注，但充分的動脈血供能有效促進肝細胞再生，尤其是在術后1周內，肝細胞再生相關指標如s期肝細胞比例及肝細胞pcna表達的比例均較單純肝切除者明顯升高，與國外部分學者研究結果相符。陳永亮等9-10研究表明肝臟部分切除后不論是在正?；蚬Ｗ栊渣S疸后再通的大鼠還是在同時行門靜脈動脈化的大鼠，術后肝質量的測定、有絲分裂期肝細胞的計數和流式細胞儀對各期dna含量的檢測均表明肝細胞再生非常明顯而且比較相似，說明門靜脈血的供應對肝臟的再生并不是必須的，門靜脈動脈化后不影響肝臟的再生

20、。王鵬等11利用胃十二指腸動脈與門靜脈行端側吻合術加肝左外葉切除犬只模型研究門靜脈動脈化對肝硬化犬肝切除后肝再生結果表明，pcna表達增強，門靜脈動脈化對肝細胞的再生有促進作用。fan等8用部分肝切除大鼠模型研究門靜脈動脈化后肝臟再生情況的結果表明，充足的肝血流量是肝再生的前提因素，在門靜脈血流量相同的情況下，無論是靜脈血還是動脈血均能保證肝臟的正常再生能力。而我們的殘肝再生率的研究結果亦表明，在術后28 d內，相對單純肝切除，附加入肝門靜脈化能顯著提高殘肝的增生及肝臟重量，這對于擴大的部分肝切除術后預防和減少術后早期發(fā)生急性肝功能衰竭有著重要意義。門靜脈動脈化主要機制是通過動脈血強化灌注門靜

21、脈，增加門靜脈的壓力和改善肝臟缺血、缺氧。肝細胞主要由線粒體的呼吸鏈供能，其作用約消耗肝臟90%的供氧，而肝細胞再生的啟動有賴于白細胞介素-6及腫瘤壞死因子-?琢等因子表達增加12。因此，穩(wěn)定的氧供對肝臟能量代謝非常重要。在門靜脈動脈化后，富含氧供和高流量血供對肝臟的灌注能有效促進肝細胞再生及增殖，另一方面，結合完全性的門腔分流，有效避免了門靜脈屬支壓力升高而引起的消化道靜脈曲張出血。實驗結果表明，門靜脈動脈化對肝臟再生具有促進作用?！緟⒖嘉墨I】maillard jn， benhamou jp， rueff b， et al. arterialization of the liver with

22、 porto-caval shunt in the treatment of portal hypertension due to intrahepatic block j. surgery， 1970， 67（6）： 883-890.iseki j， touyama k， noie t， et al. partial portal arterialization for the prevention of massive liver necrosis following extended pancreatobiliary surgery： experience of two cases j.

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